Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

A للمسح Published: October 16, 2015 doi: 10.3791/53083
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Medical Sciences, University of Aberdeen

Introduction

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقدير سريع للوضع الطاقة في C. ايليجانس في الجسم الحي بهدف استخدام هذا بمثابة نقطة النهاية في فحص المركبة. ويستند هذا المنطق على التعبير المعدلة وراثيا من يراعة luciferase في C. الخيطية ايليجانس 1-3 عن طريق البلازميد pSLGCV (1 https://www.addgene.org/49862). وتنصهر انزيم luciferase المراسل إلى بروتين الفلورية الخضراء GFP وأعرب جوهري وبتواجد مطلق في السيتوبلازم (تم إزالة بيروكسية luciferase المراسل استهداف إشارة). وهذا يؤدي إلى انبعاث الضوء عندما يتم توفير الركيزة luciferin خارجيا. كما الدودة شفافة، وعلى ضوء يمكن قياسها في luminometer وحدات الخفيفة النسبية (RLU). الوقود ATP الخلوية رد فعل تلألؤ بيولوجي وتوافره يحدد مستويات الخفيفة المنتجة. ونتيجة لذلك، luminometry يقدم مريحهر يعني تقييم مستويات ATP النسبية وبالتالي وظيفة الميتوكوندريا، لأن إنتاج ATP يحدث بشكل رئيسي في الميتوكوندريا. وقد ثبت وجود صلة بين مستويات ظيفة وتلألؤ بيولوجي الميتوكوندريا سابقا من خلال إسكات الجينات الميتوكوندريا سلسلة نقل الإلكترون ويصاحب ذلك انخفاض ناتج الضوء. 1

سلالات تلألؤ بيولوجي ولدت وعينت PE254 (feIs4) و PE255 (feIs5) 1 (انظر قائمة المواد)، ويمكن أن تستخدم بالتبادل. 3 وقد استخدمت عدد من الدراسات هذه السلالات استشعار للإبلاغ عن مستويات ATP الخلوية في الجسم الحي بعد التعرض لمواد كيميائية مختلفة أجنبي بيولوجيا مثل أزيد الصوديوم 1، الكادميوم 2 والصرف الصحي استخراج الحمأة 3، 5'-الفلورية 2-deoxyuridine 6، ونيتروسامين التبغ محددة 7. وكانت سلالات من المفيد أيضا رصد تأثيرات التعرض للأشعة فوق البنفسجية C 1،9 كما تم استخدام نسخة مبكرة من أجهزة الاستشعار التلألؤ التعبير عن الجينات luciferase المراسل دون الانصهار GFP (PE39) في التحقيق في آثار المعادن الثقيلة وعلى الجهاز التنفسي . uncoupler 10 سلالات PE254 PE255 وتحمل luciferase المراسل: تبين GFP الانصهار وGFP مضان لزيادة متناسبة مع النيماتودا الإعلام، حيث تتيح وسيلة مريحة للتطبيع القيم التلألؤ 6،9 آثار مبلغ الفرق من الديدان لكل بئر ويمكن أيضا أن يكون. تؤخذ بعين الاعتبار من قبل بما في ذلك مكررات تقنية متعددة في مقايسة (ما لا يقل عن 5 آبار في حالة). 3

بروتوكول يتيح إمكانية الرصد في الجسم الحي من مستويات الطاقة (على العكس من أكثر شاقة من الناحية الفنية في المختبر قرارات ATP) مما يتيح فحص المركبة وتغيير وضعيتها في سياق الفسيولوجية لمو كلهكائن lticellular. ويمكن تمديد هذا الإجراء إلى مجموعة متنوعة من خلفيات وراثية عن طريق عبور التحوير متكاملة صبغويا إلى سلالات متحولة المتاحة و / أو إسكات الجينات التي تدخل الحمض النووي الريبي. وهكذا، مع الاستفادة الكاملة من C. ايليجانس بوصفه الكائن نموذج. يجب أن الأسلوب تساعد في الحد من فشل المرحلة في وقت متأخر من المرشحين المخدرات نظرا لسمية الميتوكوندريا وتقديم مساهمة نحو الحد من أعلى التجارب على الحيوانات.

Protocol

ملاحظة: القيام بجميع الخطوات تحت ظروف معقمة (الصفحي مجلس الوزراء التدفق) ومع المواد المعقمة مسبقا (قبل التعقيم 126 ° C، 11 دقيقة). لوحة LB مع يشوبه من E. أبقى القولونية OP50 في 4 درجات مئوية هو مطلوب، خط خارج على لوحات LB الطازجة وrestreak كل شهر.

1. البكتيرية الغذائية (الإشريكية القولونية OP50) إعداد

  1. اليوم 1. تلقيح 2 × 5 مل LB في زجاجتين عالمية مع مستعمرة واحدة من E. القولونية OP50 ومكان في هز حاضنة عند 37 درجة مئوية (220 دورة في الدقيقة) لمدة 8 ساعة.
  2. بعد 8 ساعات الحضانة، استخدام 2 مل من E. القولونية OP50 LB الثقافة لتطعيم كل 3 × 200 مل LB. مكان قوارير في هز حاضنة (220 دورة في الدقيقة) O / N (17 ساعة) عند 37 درجة مئوية.
  3. تزن 20 × 50 مل أنابيب الطرد المركزي والكتابة وزنه على الأنبوب.
  4. اليوم 2. باستخدام ماصة المصلية، قسامة 30 مل من O / N E. ثقافة القولونية OP50 إلى ما قبل وزن أنابيب الطرد المركزي. الطرد المركزي في 7741 سز، 10 ° C، 8 دقيقة.
  5. صب بعناية طاف، والحفاظ على أنبوب مقلوب مع غطاء على وترك الوقوف لعدة دقائق. باستخدام ماصة إزالة أي طاف الزائدة التي قد جمعها في الغطاء. وزن الأنبوب وحساب وزن بيليه.
  6. حساب حجم اللازمة لتوفير تعليق 30 جم / لتر وبمناسبة هذا المجلد على أنبوب. أنابيب التاريخ، والتسمية ومكان في -20 درجة مئوية لاستخدامها في غضون 1-3 أشهر أو في - 80 ° C إذا تخزين لمدة أطول من 3 شهور.
  7. إعداد تعليق البكتيرية لالديدان الخيطية النمو؛ السماح بيليه البكتيرية لذوبان الجليد بها وإضافة الكمية المطلوبة من S كاملة المتوسط ​​11،12 لكل أنبوب، دوامة بلطف ل resuspend بيليه، محتويات مجموعة من الأنابيب مختلفة للحصول على الكمية المطلوبة. العمل تحت ظروف معقمة.

2. إعداد معايير المخدرات في شكل لوحة 96-جيدا

ملاحظة: إذا كنت تستخدم مكتبة المخدرات، وتقدم لوحات المخدرات في واحدتركيز مركب في DMSO. وغربلة أولية اختبار المركبات بتركيز واحد. اتبع التعليمات لإعداد لوحة عقار للاختبار مركب تأكيدي على مجموعة من تركيزات بين 0-160 ميكرون، المحدد بعد دلالة إحصائية عند 10 ميكرومتر. الخطوات التالية يمكن تكييفها لاختبار تركيزات أخرى.

الحذر! اتبع الاحتياطات اللازمة للتعامل مع المخدرات (الوجه عموما قناع ونظارات السلامة والقفازات هي المطلوبة).

  1. إعداد لوحة المخدرات مع معايير لفحص تأكيدي العمل: وزن الكمية المطلوبة من المركب إلى العقيمة أنبوب 1.7 مل microcentrifuge لوإعداد 16 مم مركب في DMSO (أي، تتركز 100X نسبة إلى المطلوب تركيز أكبر للتعرض).
  2. مخفف تسلسليا 16 ملم الأوراق المالية 1: 2 في DMSO للحصول على 8، 4، 2، 1، 0.5 و 0.25 معايير ملي (ظروف معقمة). هذه هي 100X المركزة وسوف تضعف وصولا الى تركيزات النهائي 0 (السيارة فقط)،2.5، 5، 10، 20، 40، 80 و 160 ميكرومتر (في 1٪ DMSO) أثناء التعرض للمخدرات.
  3. في مجلس الوزراء تدفق الصفحي، ضع 20-50 ميكرولتر لكل بئر من المعايير مجمع داخل عمود لوحة 96-جيدا، على سبيل المثال لوحة موقف A1: 16 ملم، B1: 8 ملم، C1: 4 مم، D1: 2 مم، E1: 1 ملم، F1: 0.5 ملم، G1: 0.25 ملي المخدرات وH1: DMSO. استخدام الأعمدة المختلفة لسلسلة التخفيف من الأدوية المختلفة.
  4. سيارة قسامة إلى آبار العمود 12 في لوحة المخدرات.
    ملاحظة: هذا سوف يسهل اختبار السيطرة على السيارة أسفل الأعمدة بالإضافة إلى اختبار على طول الصف H، وضمان أن يتم اختبار السيارة في مواقف ممثل لوحة كاملة.
    ملاحظة: كل لوحة المخدرات لفحص تأكيدي يحمل سلسلة التخفيف لمدة أقصاها 11 الأدوية المختلفة لفحصها بالإضافة إلى السيطرة على السيارة.
  5. التسمية وختم لوحة، مع تغطية احباط ومكان في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.

3. التجارب نيماتودا

ملاحظة: القيام بجميع الخطوات شالتانجو ظروف معقمة، جو معقم و مطهر ومع المواد قبل تعقيمها والكواشف. الحفاظ على C. ايليجانس سلالات بشكل روتيني على لوحات NGM مع E. وتقدم القولونية OP50 12 التوقيتات المقترحة للخطوات بروتوكول مختلفة في الجدول 1.

  1. يوم 1 المهمة: أقامت ثقافة السائل من سلالة جهاز الاستشعار البيولوجي لمزامنة لاحقة.
    1. تناول الديدان الخيطية من واحد لوحة NGM 6 سم (مع الكثير من اليرقات الصغيرة حيث يكون الطعام قد ينفد فقط) في 2 مل S كاملة ونقل إلى قارورة مع 30 جم / L E. القولونية OP50 في S الكامل (إجمالي حجم 30 مل في 250 مل المخروطية قدرة قارورة زجاج). احتضان 3 أيام في 20 درجة مئوية، 160 دورة في الدقيقة.
  2. يوم 4 مهمة (السماح حوالي 30-35 دقيقة): الثقافة التبييض لحصاد البيض ومزامنة السكان دودة. تنفيذ جميع الخطوات الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة، 600 ز س.
    1. تحضير محلول التبييض فقط قبل الاستخدام: لكل 16 مل من 0.156 M KOH / هيدروكسيد الصوديوم إضافة 4 مل التبييض.
    2. صب 2 × 14 ملثقافة دودة إلى 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية. السماح الديدان لتسوية عن طريق الجاذبية (3 دقائق). إزالة والتخلص السائلة الديدان الخيطية استقر أعلاه. إضافة 5 مل من محلول التبييض إلى كل أنبوب وبدء الموقت. الجمع بين وحدات التخزين في أنبوب واحد.
    3. عكس أنبوب بلطف لمدة 2 دقيقة، والتحقق من تحت المجسام لكسر الديدان والإفراج عن البيض في تعليق. عندما يتم إطلاق سراح معظم البيض أو في وقت الحد الأقصى لمدة 2 دقيقة في محلول التبييض، الطرد المركزي.
    4. إزالة طاف بعناية. يغسل 1X بيليه مع 14 مل S كاملة وأجهزة الطرد المركزي.
    5. تجاهل طاف، إضافة 10 مل من محلول التبييض وبدء الموقت (هذه الخطوة التبييض الثانية يضمن أن معظم الجثث دودة تتفكك ولم يعد ينظر تحت المجسام). بعد أقصى وقت في محلول التبييض من 2 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي.
    6. غسل بيليه 3X في S كاملة، صب بلطف طاف و resuspend بيليه في 14 مل S كاملة بعد كل الطرد المركزي. بعد غسل النهائي، Resuspend بيليه البيض في 14 مل S جomplete.
    7. نقل الصوت إلى قارورة زجاجية المخروطية. احتضان 18-24 ساعة عند 20 درجة مئوية، 160 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: سوف تحصد يفقس البيض O / N واعتقال التنمية في أول الطور اليرقي (L1) وذلك بسبب نقص الغذاء، وبالتالي فإنها سوف تكون كلها في نفس المرحلة من النمو.
  3. يوم 5 المهمة: أقامت الثقافات دودة متزامنة لفحوصات المخدرات.
    ملاحظة: الديدان مع وقف التنفيذ في المجاعة متوسطة تميل إلى التمسك السطوح البلاستيكية مسعور مثل نصائح ماصة والأنابيب. 0.01٪ توين-20 هو السطحي المستخدمة هنا لتقديم السطوح البلاستيكية أكثر محبة للماء والسماح بقدر أكبر من الدقة في الفرز (0.01٪ تريتون-X100 يمكن أن تستخدم أيضا). عندما الديدان الخيطية هي في المتوسط ​​تستكمل البكتيرية، فإنها لا تميل إلى التمسك البلاستيك.
    1. تحديد أعداد وL1 الفقس في قارورة، والحفاظ على قارورة على منصة تهتز (160 دورة في الدقيقة).
      1. اتخاذ 3X 100 عينة ميكرولتر من القارورة (استخدام غيض نظيفة في كل مرة) إلى 1.7 مل منفصلة microtubes مع 900 ميكرولتر السائل مedium 0.01٪ توين-20.
        ملاحظة: أسباير 100 عينة ميكرولتر في تلميح نظيفة مرة واحدة فقط. ثم عندما الاستغناء، ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات في توين تستكمل المتوسطة لإطلاق سراح أي الديدان الانضمام إلى الحافة.
      2. عد النيماتودا في 4X 10 قطرات ميكرولتر من كل أنبوب التخفيف ثلاث نسخ. حساب متوسط ​​قيمة وتقدير عدد من الديدان موجودة في قارورة زجاجية المخروطية.
    2. حساب حجم تعليق الخيطية التي تحاك المطلوبة لإعداد ثقافة مل 2 × 20 مع 10 الديدان الخيطية في 10 ميكرولتر. زيادة حجم محسوب بنسبة 10٪ لتصل إلى فقدان بعض الديدان الخيطية لاحقة خلال الخطوات الطرد المركزي.
    3. حجم صب حاجة إلى 2 × 15 مل أنابيب الطرد المركزي (وزنه قبل). وزن الأنابيب للحصول على الحجم الفعلي الاستغناء، دوامة بلطف وضبط لاستهداف وحدة التخزين عن طريق إزالة حجم الزائد مع ماصة 5 مل (سوى غيض العقيمة ينبغي أن يدخل الأنبوب).
    4. تشكل وحدة التخزين إلى 14 مل مع S جديدة كاملة لكانح الديدان الخيطية. الطرد المركزي (1 دقيقة، 600 غ). إزالة وتجاهل طاف مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الديدان الخيطية.
    5. إضافة 5 مل من S الكامل مع 30 جم / L E. القولونية OP50 لالديدان الخيطية مكعبات. نقل 5 مل في كل أنبوب إلى قارورة زجاجية المخروطية التي تحتوي على 15 مل S كاملة مع 30 جم / L E. القولونية OP50. وقد قدمت يدون النيماتودا لأول مرة مع الغذاء.
    6. يهز بلطف قارورة (160 دورة في الدقيقة)، واتخاذ 9 × 10 قطرات ميكرولتر على الشرائح المجهرية (استخدام نصائح جديدة في كل مرة) لحساب الديدان الخيطية وتأكيد المتوسط ​​ما يقرب من 10 (± 2) في 10 ميكرولتر.
    7. وضع قوارير الخيطية في هز حاضنة عند 20 درجة مئوية، 160 دورة في الدقيقة ل42-44 ساعة.
  4. يوم 7 المهمة: نقل الديدان الخيطية إلى 96 لوحات جيدة والشروع التعرض للمخدرات.
    1. الجمع بين الثقافات الخيطية في قارورة واحدة، والحفاظ يحوم القارورة بلطف ووضع 3 × 4 مل من ثقافة الخيطية في 60 مل حوض العقيمة. وضع الحوض على منصة تهتز (160 دورة في الدقيقة).
    2. استخدام 8 تشاننيل ماصة للقسامة 25 ميكرولتر الديدان الخيطية مع وقف التنفيذ لكل بئر من 96 لوحات عيار مكروي السوداء بشكل جيد مع قاع شفاف شقة (لاتخاذ كل من التألق ومضان قراءات، أو لوحات بيضاء لالتلألؤ فقط). مع تغطية لوحة الغطاء وتوضع جانبا.
      1. بعد إعداد كل لوحات 2، ضع 2 × 2.5 مل النيماتودا أخرى في الحوض الصغير ليحل محل حجم المفقود (الحفاظ على "حجم القتلى" في الحضيض ما يقرب من 7 مل).
      2. انشاء 13/14 لوحات مع النيماتودا. سوف تكون هناك حاجة 11 لوحات الخيطية لاختبار اثنين من لوحات المخدرات 96-جيدا. سيتم تحميلها لوحة الخيطية 12 تشرين حصرا مع السيارة كمجموعة تحكم. سيتم استخدام ال 13 لتأسيس لوحة مضان الخلفية في يوم 8 (انظر أدناه). لوحة إضافية يمكن أن تكون على استعداد لاستخدام حالة حدوث أخطاء أثناء الإعداد.
    3. قسامة 74 ميكرولتر من S كاملة إلى كل لوحة جيدا ووضعه في غرفة رطبة (انظر قائمة المواد) في حاضنة تهتز (20 ° C، 160 دورة في الدقيقة) الاتحاد الوطني للعمالايل على استعداد لاختبار مركبات قسامة في الوقت التنموي المختارين مسبقا (على سبيل المثال، 45 ساعة 30 دقيقة بعد تقديم الطعام). [حجم لكل بئر الآن 99 ميكرولتر].
    4. ذوبان الجليد من لوحة المخدرات (ق) إلى الاختبار.
    5. استخدام ماصة الأقنية لإعداد لوحات الخيطية مع المخدرات، وتغيير نصائح في كل مرة. سماح 5 دقائق في 96 لوحة جيدا لaliquoting المخدرات.
      1. تأخذ 1 ميكرولتر من 1 شارع عمود لوحة المخدرات وإضافة إلى أعمدة 1-5 من لوحة تحتوي على الديدان الخيطية. كرر من 2 العمود الثاني في لوحة المخدرات في الأعمدة 12/8 من لوحة تحتوي على الديدان الخيطية. إضافة 1 ميكرولتر من السيارة إلى أعمدة 6 و 7 من لوحة الديدان الخيطية.
        ملاحظة: إن الحجم الكلي لكل بئر في لوحة الخيطية يكون 100 ميكرولتر مما أدى إلى 1: 100 التخفيف من مجمع / مركبة.
      2. كرر العملية بإضافة 1 ميكرولتر من 3 الثالثة / 4 تشرين العمود من لوحة المخدرات إلى أعمدة 1-5 / 8-12 من لوحة الخيطية الثانية. إضافة سيارة إلى أعمدة 6 و 7 من لوحة الديدان الخيطية.
      3. مواصلة اختبار الأعمدة لوحة المخدرات المتبقية. إنشاء ما لا يقل عن واحد لوحة النيماتودا مع مركبة في جميع الآبار عن طريق أخذ عينات من العمود 12 لوحة المخدرات. مكان وحات الظهر في غرف رطبة في هز حاضنة (20 ° C، 160 دورة في الدقيقة) ل20-22 ساعة (انظر الملاحظة لمدة يوم 8).
    6. جزء من إعداد المخزن المؤقت التلألؤ لليوم التالي: إضافة DMSO و 10٪ تريتون-X-100 للحجم المطلوب من S الكامل للحصول على 1٪ DMSO و 0.15٪ تريتون X-100. سماح 5 مل لكل لوحة لقراءة التلألؤ، بالإضافة إلى 1 مل لفتيلة luminometer حاقن.
  5. يوم 8 مهمة: مقروءة النهاية التجريبية - مضان وتلألؤ بيولوجي. (ينصح قراءات مضان GFP كوسيلة لتطبيع البيانات تلألؤ بيولوجي).
    ملاحظة: حاول أن تقرأ النهاية من قبل 66-67 ساعة بعد الطعام المقدمة للالديدان من أجل منع الإنتاج الكبير ذرية تحت ظروف تجريبية وصفها.
    1. إعداد لوحة لاستخدامه على التحكم الخلفية للقراءات GFP. Cمحتويات جيدا ombine الفترة من 13 لوحة في أنبوب 15 مل. السماح الديدان الخيطية ليستقر (2-3 دقائق). استخدام طاف لتحميل صفيحة ميكروسكوبية (أسود ذات القاع الشفاف) مع 100 تعليق البكتيرية ميكرولتر لكل بئر.
      1. مراقبة الخلفية لوحة التحكم تحت المجهر مشيرا إلى أسفل الآبار حيث يمكن رؤية الديدان الخيطية. استبعاد هذه من تقدير الخلفية المستخدمة في تحليل البيانات لاحقا.
    2. قراءة مضان من كل لوحة 96-جيدا، بما في ذلك مراقبة الخلفية. (إعدادات: البصريات من الجزء السفلي من لوحة، مرشحات 485/20 الإثارة، 528/20 الانبعاثات.)
    3. إعداد عازلة للقراءات التلألؤ: إضافة وسيفيرين (20 ملم) لجزء التحضير عازلة (في اليوم السابق)، للحصول عازلة التألق مع 1٪ DMSO (1X)، 0.15٪ تريتون-X100 (3X) و 0.3 ملي وسيفيرين (3X ). رئيس luminometer حاقن 6X مع 150 العازلة التلألؤ ميكرولتر.
      1. الخطوة السابقة تفترض 1٪ DMSO عن مركبة أثناء التعرض للمخدرات. عندما المركبة المياه، وضبط المشتركncentration من DMSO في المخزن التلألؤ إلى 3٪ (أي 3X).
    4. العمل مع لوحة واحدة في وقت واحد. الاستغناء عن 50 ميكرولتر التلألؤ عازلة لكل بئر. (150 حجم ميكرولتر النهائي بشكل جيد؛ تخفيف 3X العازلة التلألؤ: 1٪ DMSO، 0.05٪ تريتون-X100 و 0.1 ملي تركيزات وسيفيرين النهائية.) مكان على الفور تهز منصة وبدء الموقت.
      1. بعد 3 دقائق على منصة تهتز (160 دورة في الدقيقة)، وقراءة التلألؤ (1 ثانية في القياس).

تحليل 4. البيانات

  1. طرح متوسط ​​خلفية GFP القراءة من النتائج مضان. تقسيم تلألؤ بيولوجي بواسطة القراءة GFP منها.
    1. عندما يتم الكشف عن قيمة GFP عالية للالديدان الخيطية تعرضت لمركب، وقياس مضان المجمع من تلقاء نفسها لحساب أي مضان المجمع. إذا كان أعلى من المتوسط، واستخدام هذه كخلفية بدلا من ذلك.
  2. تلألؤ بيولوجي السريع، GFP تطبيع تلألؤ بيولوجي لالثاني البيانات GFP مضان كنسبة مئوية من متوسط ​​قيمة السيطرة على السيارة في كل لوحة.
  3. رسم متوسط ​​القيم وأشرطة الخطأ لكل تركيز.
  4. الاختبار إحصائيا باستخدام 2-طريقة تحليل التباين (ANOVA) مع آثار 'التركيز'، 'تجربة' وتفاعلهم (كل نقطة بيانات تشير إلى بئر واحدة)، واستخدام اختبار Dunnett كما الاختبار اللاحق (مقابل . السيطرة على السيارة).
    ملاحظة: إذا كان "تجربة" أو مصطلح "التفاعل" كبيرة، قد تكون هناك حاجة مزيد من التجارب للتأكد استجابة. حيث لا التباين بين التجارب هو واضح من مراقبة المؤامرات البيانات، في اتجاه واحد ANOVA لا يمكن أن يؤديها على البيانات المجمعة من تجارب مستقلة.
    1. لتحليل إحصائي لوحة (s) مع سيارة فقط، حدد جميع الآبار في الأعمدة 6 -7 وجميع الآبار في الصف H كمجموعة تحكم (هذه هي المواقف المخصصة بشكل روتيني لمركبة خلال اختبار مركب).

Representative Results

وقد تم الحصول على نتائج ممثلة لتوضيح طريقة لروتينون (الشكل 1)، الباراكوات (الشكل 2)، أوكسالوآسيتات (الشكل 3)، و 4 مركبات التي تم انتقاؤها مثبطات كما يراعة luciferase خلال فحص مكتبة المخدرات 13 (الشكل 4). وقد بدأ التعرض للمخدرات في المرحلة L4 في جميع الحالات، ولكن بدأت تجارب التعرض ترابل في 41 ساعة بعد الغذاء قدمت أول من الديدان الخيطية مقارنة مع 45-46 ساعة للمركبات الأخرى. بروتوكول يسمح للحصول على درجة من المرونة في اختيار الوقت المناسب للبدء من التعرض للمخدرات وطول التعرض. ينبغي التقيد ومع ذلك، لأغراض الفحص، تعيين أوقات الى المفضلة مرة واحدة، لاستنساخ بين التجارب. يجب أن تقاس النهاية من قبل 66-67 ساعة وقت التنموية من أجل منع واسعة وضع البيض والتفريخ من ذرية في الآبار. يتم توفير مبادئ توجيهية للتوقيت في Tقادرة 1.

روتنون، وهو مجمع الميتوكوندريا I المانع، تخفيض تلألؤ بيولوجي بعد كل من قصيرة نسبيا (2 ساعة) وأطول التعرض (24 ساعة) لمجموعة من تركيزات (الشكل 1). في هذه الحالة، لم تتخذ أية قياسات GFP، ولكن عدد مكررات التقنية المستخدمة (ن = 6) كافية لمعادلة أية اختلافات في أرقام دودة بين الآبار 3. تعرض 24 ساعة هو نافذة الزمنية التي تنمو الديدان الخيطية، والتنمية أبطأ نتيجة معقدة I تثبيط كان من المتوقع أن تسهم في انخفاض تلألؤ بيولوجي. هذا ما أكده الملاحظة البصرية تحت المجسام مع تطوير تأخر ينظر إليها، ولا سيما في تركيزات 20 ميكرومتر وأعلاه؛ بالإضافة لوحظ بعض الفتك من 40 ميكرومتر (الملاحظات النوعية لا كميا). ولم يلاحظ أي الفتك بعد التعرض 2 ساعة ولكن ظهرت التأثيرات على حركة الدودة. انخفاض حاد في تلألؤ بيولوجي بالنسبة لضوابط occurred في أقل تركيز من روتينون اختبار 2.5 ميكرومتر، والتي الآثار لم يتم الكشف بسهولة عن طريق الملاحظة البصرية السريعة في 2 التعرض ساعة. هذا الانخفاض في تلألؤ بيولوجي يتسق مع انخفاض ATP الخلوية. وقد تحقق تثبيط القصوى بأقل تركيز روتينون المستخدمة (2.5 ميكرومتر) مشيرا إلى أن أي تجارب لاحقة تستهدف روتينون على وجه التحديد يجب أن تنفذ بين 0 و 5 ميكرومتر [نطاق تركيز 0-160 ميكرون تم اختيار كجزء من المقارنة مع أدوية أخرى حددت في البداية وجود آثار كبيرة على 10 ميكرومتر (التي سيتم نشرها في مكان آخر)].

والباراكوات مبيدات الأعشاب تؤثر على وظيفة الميتوكوندريا من خلال زيادة أنواع الاكسجين التفاعلية. هنا، علينا أن نظهر تأثيرها على تلألؤ بيولوجي من C. ايليجانس السلالة PE254 بعد التعرض لمجموعة من تركيزات لمدة 24 ساعة (الشكل 2). كما سلالة يحمل لوك :: الانصهار GFP، كان GFP مضان المرضس قياس كوسيلة للتطبيع. انخفضت 6،9 ترابل تلألؤ بيولوجي، GFP مضان وتلألؤ بيولوجي تطبيع بشكل ملحوظ. وأشار الاختبار اللاحق-Dunnet أن تركيزات الباراكوات مع وجود اختلافات كبيرة فيما يتعلق السيطرة على السيارة وكانت 4 و 8 مم للتلألؤ بيولوجي وتلألؤ بيولوجي تطبيع، فضلا عن 2 ملم لتلألؤ بيولوجي تطبيع. وكان تركيز الوحيد تخفيض كبير GFP مضان 8 ملم، والتركيز على شوهدت فيها آثار للنمو ودودة الميتة عرضية (الملاحظات النوعية). كان الانخفاض في تلألؤ بيولوجي (وتلألؤ بيولوجي تطبيع) أكبر من مضان، بما يتفق مع انخفاض وظيفة الميتوكوندريا والآثار على إنتاج ATP.

دورة حمض الستريك أوكسالوآسيتات المتوسط ​​اختبارها على C. ايليجانس السلالة PE254 بتركيز واحد من 8 ملم، أدى إلى زيادة في تلألؤ بيولوجي (الشكل 3). لا GFP يتألقتم الحصول على قياسات الامتحانات التنافسية الوطنية أو إجراء الملاحظة البصرية إضافية خارج. ولكن هذه الاستجابة إلى تركيز واحد سوف تستحق المزيد من التعرض تأكيدي على مجموعة من تركيزات، وملاحظات أكثر تفصيلا من الآثار. تعزيزا لتلألؤ بيولوجي هذا المركب ليس من المستغرب كما أنها يمكن أن يفترض أن تؤدي إلى مزيد من النشاط في دورة حمض الستريك، مع زيادة في نهاية المطاف إنتاج ATP (مع ذلك سيكون من المستحسن للسيطرة على أي آثار على مستويات luciferase المراسل عن طريق تقييم GFP مضان في تجارب لاحقة). مجموعات البيانات أوكسالوآسيتات أظهرت تكشف عن مدى التباين في استجابة ينظر في تجاربه التي تستند luciferase المراسل. في تجربتنا هذه التقلبات هو سمة من سمات نظام الاختبار وخاصة لظروف التعرض أقل ضررا.

المركبات المثبطة يراعة luciferase DDD00001434، تم اختبار DDD0001477، DDD00000635 وDDD00023047 على حد سواء في المختبر من خلال النظر في الآثار المترتبة على بوانزيم rified والحية باستخدام C. ايليجانس لوك: GFP معربا عن سلالة. لم يكن هناك أي دليل على أن أيا من مركبات اخضعت للاختبار تسبب في وفاة الخيطية تحت ظروف التعرض. جميع المركبات 4 أثرت على luciferase النشاط في المختبر على تركيزات 2 اختبار 25 و 100 ميكرومتر (الشكل 4A). DDD00001434 قتل نشاط luciferase المراسل تنقيته تماما تقريبا، والتي قدمت لتبرير معقول لتراجع كبير في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي في (الشكل 4B). على الرغم من أن في المختبر والمقايسات فيفو لا يمكن مقارنتها مباشرة، كانت ردا على DDD00023047 مماثلة في كل من المقايسات. تسبب DDD0001477 وDDD00000635 انخفاضا أكبر في الجسم الحي مما كانت عليه في في المختبر. وقدمت هذه المركبات إلى الديدان الحية 22 ساعة قبل الركيزة وسيفيرين، ويمكن أن تعكس النتائج التي لم ينزحوا بسهولة من موقع نشط luciferase المراسل عندما أصبح وسيفيرين افاعيlable و. بدلا من ذلك، قد DDD0001477 وDDD00000635 يكون لها تأثير إضافي على مستويات ATP الخلوية. وهذا من شأنه أن يتم تقييمها بواسطة الوسائل التي لا تنطوي على يراعة luciferase. من المذكرة هو تعزيز قوي للإشارة GFP في الديدان الحية تتعرض لتفاقم DDD00000635. وسيناقش هذا أدناه.

الشكل 1
الشكل 1. مجمع الميتوكوندريا I المانع انخفض روتينون وضع الطاقة في C. ايليجانس مقاسا تلألؤ بيولوجي من سلالة PE254. المتزامنة L4 مرحلة الديدان (45-46 ساعة بعد الغذاء المقدم لليرقات L1) تتعرض ل0، 2.5، 5، 10، 20، 40، 80 و 160 ميكرومتر روتينون في 1٪ DMSO ل2 ساعة (قصيرة) أو 24 ساعة (التعرض الطويل) قراءات مسبقة من تلألؤ بيولوجي على التوالي في 48 و 69 ساعة من وضع دودة بعد توفير الغذاء. وأعرب تلألؤ بيولوجي (وحدة النسبية وحدات خفيفة، RLU) كنسبة مئوية من السيارة (1٪ DMSO) القيم. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية في كل تركيز روتينون (ن = 6). أسفرت عن تركيزات اختبارها في غاية الاختلاف ذات دلالة إحصائية فيما يتعلق السيطرة على السيارة (P <0.001).

الرقم 2
الشكل 2. الباراكوات الأكسدة الضغوطات انخفضت وضع الطاقة في C. تعرضت ايليجانس السلالة PE254 بطريقة تعتمد على التركيز (تقاس تلألؤ بيولوجي). المتزامنة L4 الديدان المرحلة (للراحة في هذه الحالة في 41 ساعة بعد الطعام المقدمة للL1 اليرقات) إلى 0، 0.25، 0.5، 1، 2، 4 أو 8 ملي الباراكوات لمدة 24 ساعة. وقد استخدم مضان GFP (وحدة وحدات مضان النسبية، RFU) لتطبيع البيانات تلألؤ بيولوجي (وحدة RLU)، وكلاهما النهاية حصلت على 65 تنمية الموارد البشرية. يتم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من الضوابط (1٪ DMSO). أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية(ن = 5 لتركيزات مختلفة، ن = 18 للضوابط). في اتجاه واحد ANOVA: *** P <0.001 نسبة إلى السيطرة على السيارة.

الشكل (3)
الشكل 3. دورة حمض الستريك أوكسالوآسيتات المتوسط ​​(8 ملم) تعزيز تلألؤ بيولوجي من C. تعرضت ايليجانس السلالة PE254. المتزامنة L4 مرحلة الديدان (45-46 ساعة بعد الغذاء المقدم لليرقات L1) إلى طازجة 8 ملي أوكسالوآسيتات لمدة 18 ساعة ± 30 دقيقة. تم قراءة تلألؤ بيولوجي (وحدة RLU) في وقت التنموي من 63.5 ساعة ± 1 ساعة وكنسبة مئوية من السيطرة على السيارة ([ده 2 O). وتمثل أعمدة مختلفة مجموعات البيانات المختلفة من 8 مكررات التقنية المخصصة لمختلف 96 لوحات جيدة داخل نفس التجربة. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية (ن = 8). 2 طريقة ANOVA مع "مجموعة" و "تركيز" كعوامل: ̵6؛ مجموعة "P> 0.05، '' ع تركيز <0.001 و مصطلح التفاعل P> 0.05.

A
الرقم 4
B
الرقم 4
الرقم 4. اختبار الردود على 4 مركبات من اكتشاف المخدرات مكتبة مجمع دندي 13 (C1: DDD00001434، C2: DDD0001477، C3: DDD00000635 وC4: DDD00023047) مع النشاط المثبطة معروف على يراعة luciferase المراسل التلألؤ. (A) تأثير المركبات على نشاط تنقية يراعة luciferase (قياس وحدات خفيفة، RLU)، معبرا عنه كنسبة مئوية من السيطرة على السيارة. تم استخدام ATP تلألؤ بيولوجي CLSII مجموعة (روش، مانهايم، ألمانيا) وفقا لتعليمات بنفس كمية الانزيم luciferase المراسل aliquoted إلى الآبار (أبيض 96 ثالذراع لوحات عيار مكروي). وقدمت ATP في تركيز النهائي من 10 ميكرومتر و 1 ميكرولتر من مركب (تركيز النهائي أشار) أو أضيفت DMSO (1٪). تم دمج إشارة التلألؤ لمدة 10 ثانية. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية (ن = 4). تحليل: في اتجاه واحد ANOVA. * P <0.05 أو *** P <0.001 نسبة إلى السيطرة على السيارة. الاختلافات بين 25 و 100 ميكرومتر هامة للغاية لC1 (DDD00001434؛ P <0.001)، وهامة لC2 و C3 (على التوالي DDD0001477 وDDD00000635؛ P <0.05). (ب) في الجسم الحي قياسات تلألؤ بيولوجي، تلألؤ بيولوجي تطبيع لGFP مضان و GFP مضان من C. ايليجانس السلالة PE254 في 67 ساعة وقت التنموية بعد التعرض لمركبات الاختبار لمدة 22 ساعة. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية (ن = 8). تحليل إحصائي قامت (واحد طريقة ANOVA) للخروج على البيانات المجمعة من 3 مجموعات البيانات (3 XN = 8). * P <0.05 أو *** P <0.001 نسبة إلى السيطرة على السيارة المعنية. مختلفاالمجال الاقتصادي الموحد بين 25 و 100 ميكرومتر فقط يعتد به إحصائيا (P <0.05) للتلألؤ بيولوجي تطبيع بعد التعرض لC4 (DDD00023047).

وقت اليوم اليوم 1 يوم 2 اليوم 3 اليوم 4 اليوم 5 اليوم 6 يوم 7 اليوم 8
10/09 خطوة 5
10-11 خطوة 5
11-12 الخطوة 4 خطوة 5
12-13 الخطوة 4
13-14
14-15
15-16
16-17 الخطوة 1 الخطوة 3
17-18
18-19 الخطوة 2

الجدول 1. نظرة عامة على خطوات البروتوكول التي يتعين القيام بها في كل يوم من التجارب الخيطية (القسم 3) واقترح توقيت.

Discussion

الكائن الحي نموذج C. يوفر ايليجانس نظام تجريبي قوي. فمن السهل أن تنتج ثقافة وفيرة ذرية متطابقة جينيا مع دورة حياة 3.5 يوم من البيض لاستنساخ الكبار (عبر مراحل اليرقات الأحداث L1 حتى L4). ونظرا لصغر حجمه، فإنه يمكن زراعتها بشكل ملائم في لوحات 96-جيدا، وتسهيل فحص المركبة. نقدم بروتوكول الفحص المظهري بناء على سلالات C. ايليجانس التي تقوم بدور في الجسم الحي أجهزة الاستشعار من مستويات الطاقة. 14 البروتوكول ينطبق على أي مختبر، على الرغم من أن هناك حاجة إلى luminometer لوحة 96-جيدا والحكومة العقيمة. من المهم لمنع التلوث في فحوصات باستخدام تقنية المختبرات الجيدة. إذا كان يعمل يدويا، والحد الأقصى لعدد لوحات الديدان الخيطية يمكن تحقيقه هو 13 في التجربة السماح للاختبار 2X لوحات المخدرات 96-جيدا وبينهم اثنان من لوحات المركبات. يتم عرض نتائج ممثل للمجمع الميتوكوندريا I المانع rotenonه، مولد الباراكوات الفائق، ودورة حمض الستريك أوكسالوآسيتات المتوسطة وأربع مركبات مع المعروف النشاط المثبطة يراعة luciferase. أدت المركبين الأولى إلى انخفاض في تلألؤ بيولوجي كما كان متوقعا في حين أوكسالوآسيتات أدى إلى تعزيز، من المرجح أن يؤدي من جيل أكبر من ATP. تظهر أيضا مجموعات البيانات أوكسالوآسيتات التغير الجوهري في تجاربه التي تستند إلى يراعة luciferase كمراسلة. ما لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة لا ينصح للتأكد من متانة الردود على مركبات غير معروفة.

وتثبيط النشاط يراعة luciferase التعرف مع فحص في المختبر باستخدام طقم التجارية. 3 واحدة من المركبات أدى إلى زيادة كبيرة في GFP مضان بما يتفق مع مثبط زيادة مستويات يراعة luciferase المراسل ملزمة لانزيم luciferase المراسل النشط الموسومة GFP الموقع، وجعله أكثر استقرارا. 15 وفي بعض الحالات(وليس في هذه الحالة بالذات) وهذا يمكن أن يؤدي إلى زيادة مستويات تلألؤ بيولوجي عند النازحين المانع من قبل الركيزة الزائدة. 15. ولذا، من المهم عدم تفسير النتائج خطأ من المركبات التي تتفاعل مع انزيم يراعة كما انخفضت أو زيادة مستويات ATP / وظيفة الميتوكوندريا. التغييرات في إشارة التلألؤ في كثير من الأحيان ترتبط مع قياسات إضافية للصحة مثل الحركة والتطور والنمو. وكمثال على ذلك، وهو مركب هو luciferase المراسل المانع المشتبه به إذا تم الكشف عن الانخفاض الكبير في إشارة تلألؤ بيولوجي لكن الديدان لا يمكن تمييزها من الضوابط من خلال الملاحظة المجهرية. زيادة في GFP مضان، لا يفسر النمو أو مركب تألق ذاتي، قد يشير أيضا إلى المانع. ومن المعروف أن عددا من مثبطات luciferase المراسل 15، وقد دخلت حيز PubChem. لذلك، في المقام الأول، بل هو ممارسة جيدة للتشاور معلومات عن مثبطات luciferase المراسل تحتجزهم PubChem. تليها رesting من آثار مركب في فحوصات في المختبر مع انزيم المنقى 3 و / أو تأكيد من آثار على وظيفة الميتوكوندريا من قبل وسائل إضافية. 16،17

قياسات GFP مضان تمكين الكشف عن مستويات يراعة luciferase (والكشف المحتمل لبعض مثبطات انزيم luciferase المراسل كما نوقش أعلاه) مما يجعل حجة قوية لقياس هذه النهاية جنبا إلى جنب مع تلألؤ بيولوجي حيثما كان ذلك ممكنا. تطبيع قراءات تلألؤ بيولوجي لGFP هو أيضا وسيلة لتوضيح أسباب الاختلاف في الأرقام دودة بين الآبار (على الرغم من أن هذا يمكن أيضا أن يتحقق عن طريق إدراج مكررات التقنية متعددة). لمزيد من حساسية، من المهم طرح مضان الخلفية من القراءات. بروتوكول يقيم مساهمة تعليق البكتيرية إلى مضان الخلفية، ولكن لا تمثل الديدان الخيطية تألق ذاتي ل(وجود قيود على الفحص الحالي، حاسمة بشكل خاص لأي ستو الشيخوخةوفاة بالنظر إلى أن الزيادات الخيطية تألق ذاتي مع التقدم في السن). وينبغي أيضا تقييم تألق ذاتي من المركبات اختبار في نفس الوقت. سوف GFP تطبيع يبدو لا غنى عنه حيث يرغب الباحثون على التكيف بروتوكول لمقارنة حمامات ATP الخلوية في المسوخ وراثية مختلفة، أو بعد إسكات الجينات المختلفة، من أجل السيطرة على أي اختلافات الضغط على مستوى التعبير عن التحوير تلألؤ بيولوجي.

وتشمل المعايير الضرورية ضمن بروتوكول المرحلة التنموية التي يبدأ التعرض، ومدة التعرض، والحصول على أرقام مماثلة من الديدان الخيطية في آبار مختلفة. التعرض يمكن أن يبدأ في أي مرحلة من مراحل التنمية من الديدان الخيطية، ولكن مرحلة L3 أو أقدم الأفضل. من هذه المرحلة على والديدان الخيطية تعتمد على الفسفرة التأكسدية للتنمية في مرحلة البلوغ، كما يتضح من زيادة كبيرة جدا في المحتوى و mtDNA، واستهلاك الأوكسجين ومستويات ATP. 18،19،20 هذا البروتوكول يبدأ المعارضلدى عودتهم في المرحلة L4. سبب aliquoting الديدان الخيطية لوحات 96-جيدا فقط في هذه المرحلة (وليس عندما قدمت لأول مرة في المواد الغذائية في مرحلة L1)، هو أنه على الرغم من وضع لوحات في غرف رطبة لتقليل التبخر، وعلى درجة التبخر لا يزال يحدث في لدينا حاضنة الهز، وينظر إليها على أنها قطرات صغيرة جدا تتشكل على الجفن (وهذا قد لا يكون مشكلة مع حاضنات تهز أخرى). بواسطة aliquoting الديدان الخيطية لوحات قبل إضافة معايير المخدرات، لا يتأثر تركيز الدواء الفعلي من قبل أي اختلاف صغير في الحجم بسبب التبخر. تحميل لوحة الخيطية مع السيارة هو مفيد فقط للتأكد من أن الديدان الخيطية وزعت بالتساوي بين الآبار. فإن أي اختلافات كبيرة تم العثور عليها ل السيارة لوحة فقط يكون مؤشرا على تقنية الفقيرة في الاستغناء عن النيماتودا إلى الآبار.

طول التعرض هو عامل مهم للنظر فيها. إذا كانت الآثار على وضع الطاقة بشكل مستقل من النمو هي التي تهم، والمؤيديمكن تعديل tocol لاستيعاب التعرض أقصر (من استجابات فورية تقريبا، على سبيل المثال، 2 ساعة). من ناحية أخرى، دخول المركبات إلى C. الأنسجة ايليجانس قد يستغرق بعض الوقت. على سبيل المثال يطلب من 12-24 ساعة لتحقيق أقصى قدر من تركيزات الداخلية ريسفيراترول و 5 الفلورية 2'-deoxyuridine (FuDR). 21 لذلك، التعرض الطويل (18-24 ساعة) قد يكون له ما يبرره لتحقيق أقصى قدر من مستويات التعرض. الساعة التعرض ينبغي أن يقتصر على الأوقات التي لا تسمح مستويات كبيرة من الاستنساخ الذي سيعقد في البئر. ونحن نوصي بأن الوقت التنموي الكلي للالنيماتودا يتم الاحتفاظ تحت 66-67 ساعة. على الرغم من مريحة، وحامل الديدان الخيطية في ذلك الوقت، وقد بدأت egglaying. ومع ذلك وجدنا قراءات تلألؤ بيولوجي من الاستعدادات البيض لا تذكر (لا يظهر). يتم الكشف عن سور 5 المروج يحركها التعبير التحوير أول اثنين فقط لمدة سنتين وبعد نصف ساعة الإخصاب في مرحلة 100 خلية 22 وجومن المرجح أن تحد من دخول وسيفيرين قشر البيض hitinous. ووجد آخرون أن البيض المحتوي لم تساهم بشكل كبير في عملية التمثيل الغذائي للبالغين حامل. 23 ومع ذلك، والظروف التي تسمح بانتاج كبير ذرية هي التي ينبغي تجنبها. إذا كان يفضل، والجدول الزمني التجريبي يمكن أن تحول مرة أخرى: بادرنا قبل التعرض لسموم البيئية في أواخر L3 مرحلة اليرقات (36 ساعة) والتي أجريت القياسات تلألؤ بيولوجي وGFP في 55 ساعة 2 الخلفيات بدلا من ذلك، الوراثية التي هي عقيمة مشروط. يمكن استخدامها لمنع إنتاج ذرية، وعلى سبيل المثال فر-15 (B16) II. لا ينصح فيم-1 (hc17) IV متحولة المزدوج الذي لا يمكن الحفاظ عليه في 15 ° C، ولكن غير معقمة في 25 ° C. 24 استخدام FuDR للحث على العقم وهذا يمكن أن يؤثر في حد ذاته عملية التمثيل الغذائي الديدان الخيطية. 25 الفحص يمكن أن كما أن يؤديها في التوترات مع البشرة أكثر نفاذية مثل جزئية الخسارة من وfunctأيون حافلة 8 المسوخ التي هي نتيجة لزيادة نفاذية الأدوية الحساسة للأدوية المتعددة. 26 وهذا يسهل التعرض أقصر وتركيز مركب أقل. الشروط لإضافة وسيفيرين لهذه الديدان الخيطية يمكن أيضا تحتاج التعديل أي 1٪ DMSO و 0.05٪ تريتون-X100 في المخزن المؤقت التلألؤ قد لا تكون هناك حاجة لتعزيز توافر وسيفيرين.

يستخدم بروتوكول 1٪ DMSO كما سيلة لتسليم المجمع. وإن لم يكن قاتلا، وهذا تركيز DMSO لديه بعض التأثيرات البيولوجية كما ناقشنا في منشور السابق. 3 العديد من المكتبات المخدرات المتاحة مستعدون في 100٪ DMSO، بتركيزات من شأنها أن تكون مناسبة لفحوصات خلية القاعدة بعد التخفيف من السيارة إلى 0.1٪. ويلزم تركيز مركب أعلى للحصول على ردود في C. ايليجانس بالمقارنة مع الخلايا البشرية، بحيث غالبا ما يكون من غير الممكن إجراء فحوصات على أقل من 1٪ DMSO. مرة أخرى، واستخدام سلالات معقد يؤدي المزيد من البشرة منفذة لاختبار مع تركيزات أقل من المركبات. لا ينصح تركيزات DMSO أعلى من 1٪.

ينبغي التقيد الوقت المحدد الحضانة مع وسيفيرين قبل قراءات ل. كما هو موضح سابقا، التلألؤ يصل أقصى مستويات لها في الدقيقة الثانية بعد إضافة وسيفيرين، وتبقى مستقرة نسبيا لأول 5 دقائق، تليها انخفاض تدريجي بطيء في التألق على مدى 30 دقيقة المقبل 1. ويمكن إجراء استجابات حركية لمادة كيميائية معينة من خلال هذه المرحلة الأولية من 30 دقيقة بعد الاستغناء الأولي من وسيفيرين.

ويشمل البروتوكول خطوة جوعا بعد جمع البيض لتحقيق التزامن من السكان الديدان الخيطية. نوصي تزامن السكان اختبار النيماتودا منذ مراحل النمو المختلفة تختلف في مستويات ATP الخلوية وربما تستجيب بشكل مختلف للمركبات الاختبار. من خلال تنفيذ المجاعة في S كاملةمتوسطة بالمقارنة مع M9، يتم توفير الديدان الخيطية الفقس مع مصدر الكربون (الإيثانول)، بحيث اليرقات لا تتطور ولكنها لا تفتقر تماما. 27،28 كما تبين أن القبض على L1 وتستعد للاستجابة السريعة في الغذاء و ويتم تحقيق معدل نمو L1 العادي في غضون 3 ساعة بعد الغذاء تصبح متوفرة. 29 ومع ذلك، فإنه احتمال أن الخطوة المجاعة قد يغير التمثيل الغذائي للC. لا يمكن استبعاد ايليجانس. 30 لهذا السبب طول الجوع يجب أن لا تتجاوز 24 ساعة (18 ساعة كافية لمزامنة). قد يكون بعض المختبرات في إمكانية استخدام COPAS Biosorter لمزامنة عمر تجاوز الخطوة الجوع تماما. قد يكون غيرها من المختبرات تفضيل لتوسيع السكان الخيطية على وسائل الاعلام الصلبة (لوحات NGM مع OP50) قبل التبييض (الخطوة 3.1) وهذا سوف تعمل بشكل جيد جدا. نحن نستخدم S المتوسطة خلال التعرض مجمع كوسيلة القياسي لالنيماتودا زراعة، howeveص يمكن اختيار وسيلة أخرى، على سبيل المثال K متوسطة أو معتدلة EPA الماء العسر غالبا ما تستخدم للدراسات السمية البيئية. 31،32

وينص البروتوكول وسيلة لفحص وتحديد المرشحين لإجراء مزيد من التجارب من حيث الآثار المترتبة على وظيفة الميتوكوندريا. في مرحلة الفرز الأولية أنه من المحتمل أن يكون قد تم تفويت بعض المركبات بسبب تركيز واحد فقط يجري اختبارها، وبالتالي لا ينبغي النظر شاشات المخدرات شاملة. يضرب يمكن التحقق من صحة عن طريق استخدام تقنيات لتقييم جوانب مختلفة من وظيفة الميتوكوندريا للاستهلاك الأكسجين سبيل المثال، C. ايليجانس سلالات مع GFP معربا عن الميتوكوندريا، البقع على إمكانات غشاء الميتوكوندريا و / أو القياسات ROS. 16،33،34 أعظم أهمية المنهجية هو أن يكون وسيلة لفحص عدد كبير من المركبات و / أو شروط على المستوى العضوي متعددة الخلايا، والأهم من ذلك أن تكون قادرة على الاستفادة من الالبريد قابلية الإستطراق الجيني للC. ايليجانس للتحقيق في آليات العمل. تقنية قد تساعد على تسريع وإيجاد مسارات جديدة لاكتشاف مركبات والأهداف مثيرة للاهتمام. ومن المتصور أن الجمع بين أجهزة الاستشعار مع خلفيات وراثية مرتبطة الأمراض التي تصيب البشر لفرز مجموعات المركبات الكيميائية في سياق ذي صلة المرض سيكون لها الكثير لتقدمه.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما تكشف

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Orion II Microplate Luminometer Berthold Detection Systems with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement
FLx800 fluorimeter  Biotek with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement
Ks 130 basic shaking platform Ika #0002980000
Innova 4349 New Brunswick Scientific Refrigerated incubator shaker
Eppendorf centrifuge 5804R Eppendorf with eppendorf rotor A-4-44  (for 50/15 ml tubes)
Stripette, Costar Corning #4489 Serological pipette
Cellstar 50 ml tubes Greiner bio-one #227661
Cellstar 15 ml tubes Greiner bio-one #188261
Cellstar 60 mm tissue culture plates  Greiner bio-one #628160
Superfrost Microscope slides VWR #631-0909
Sterile spatula Corning #3007; #3004 for weighing out chemicals
0.22 mM Millex GP filters Millipore #SLGP033RS
Axygen eppendorf tubes 1.5 ml Fisher Scientific #MCT-150-R
Corning 96 well assay plate VWR #3603 Black plate clear bottom with lid
Nunc 96 well assay plate Fisher Scientific #236105 White plate with lid
Reservoir reagent 60 ml Thermo Scientific Finnpipette #9510027 used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1
Storage box/damp chamber Roche Diagnostics #10 800 058 001 174 x 101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2x 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid
Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content Sigma Aldrich #239305 Store in aliquots at 4 °C,  seal with Parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil
D-Luciferin, potassium salt Biotium Inc # 10101-2 Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots
Name Company Catalog Number Comments
Tween 20 Sigma Aldrich # P9416
DMSO CalBiochem #317275 Purity 99.99%
Triton X100 Alfa Aesar #A16046 Diltute to 10% in ddH2O
Nystatin CalBiochem #475914
C. elegans bioluminescent strains Author's own laboratory PE254, PE255 contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.
E. coli OP50 CGC
General chemicals Sigma Aldrich/Fisher Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans. BMC Physiol. 8, 7 (2008).
  2. Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor. Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).
  3. McLaggan, D., et al. Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor. PloS one. 7, e46503 (2012).
  4. Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells. Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).
  5. Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).
  6. Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
  7. Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans. Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).
  8. Leung, M. C., et al. Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).
  9. Kuang, J. J., Ebert, P. R. The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism. Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).
  10. Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors. FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).
  11. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  13. Brenk, R., et al. Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases. ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).
  14. Lagido, C. Nematodes as environmental indicators. Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. , CABI. 225-251 (2009).
  15. Thorne, N., et al. Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter. Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).
  16. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497, 451-457 (2013).
  17. Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Pharmacological approaches to restore mitochondrial function. Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).
  18. Tsang, W. Y., Lemire, B. D. Mitochondrial genome content is regulated during nematode development. Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).
  19. Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans. Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).
  20. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
  21. Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods. PloS one. 8, e56877 (2013).
  22. Yochem, J., Gu, T., Han, M. A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis. Genetics. 149, 1323-1334 (1998).
  23. Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans. J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).
  24. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
  25. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
  26. Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev Biol. 317, 549-559 (2008).
  27. Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae. PloS one. 7, (2012).
  28. Baugh, L. R. To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest. Genetics. 194, 539-555 (2013).
  29. Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest. Science. 324, 92-94 (2009).
  30. Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans. Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).
  31. Cressman, C. P., Williams, P. L. Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media. Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).
  32. Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media. Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).
  33. Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response. Genetics. 174, 229-239 (2006).
  34. Yang, W., Hekimi, S. A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans. Plos Biol. 8, (2010).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 104، الكائنات النموذجي،
A للمسح<em&gt; في فيفو</em&gt; الفحص للالميتوكوندريا المغيرون في الموجة الكهرومغناطيسية عن طريق المعدلة وراثيا للإضاءة الحيوية<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. … More

Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (104), e53083, doi:10.3791/53083 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter