A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.
The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.
Det övergripande syftet med detta förfarande är den snabba kvantifiering av energistatus C. elegans in vivo i syfte att använda detta som en slutpunkt i förening screening. Den logiska grunden är baserad på den transgena expressionen av luciferas från eldfluga i nematoden C. elegans 1-3 via plasmiden pSLGCV (1 https://www.addgene.org/49862). Luciferasenzymet fuseras till grönt fluorescerande protein GFP och uttrycks konstitutivt och allmänt utbrett i cytoplasman (luciferas peroxisom målsignal avlägsnades). Detta leder till ljusemission när substratet luciferin tillhandahålls exogent. Eftersom masken är transparent, kan ljus mäts i en luminometer som relativa ljusenheter (RLU). Cellulära ATP bränslen mareld reaktionen och dess tillgänglighet bestämmer ljusnivåer produceras. Därför erbjuder luminometri en convenient betyder att bedöma relativa ATP-nivåer och i förlängningen mitokondriefunktion, eftersom ATP-produktion sker främst i mitokondrier. En länk mellan mitokondriefunktion och mareld nivåer har visats tidigare genom tysta mitokondriella elektrontransport kedjegener och åtföljande minskad ljuseffekt. 1
De mareld stammar som genereras betecknades PE254 (feIs4) och PE255 (feIs5) 1 (se materiallista) och kan användas omväxlande. 3 Ett antal studier har utnyttjat dessa sensor stammar att rapportera om cellulära ATP-nivåer in vivo efter exponering för olika xenobiotiska kemikalier såsom natriumazid 1, kadmium 2, avlopp slamextrakt 3, 5'-fluor-2-deoxiuridin 6, och en tobaksspecifika nitrosamin 7. Stammarna har också varit till nytta för att övervaka effekterna av exponering för ultraviolett strålning C <supp> 8 och effekterna av att störa mitokondriella andningskedjan fungerar. 1,9 En tidig version av luminiscens sensorn uttrycker luciferasgenen utan GFP fusion (PE39) har också använts i utredningen av effekterna av tungmetaller och en respiratorisk . frikopplare 10 Stammarna PE254 och PE255 bär luciferas: GFP fusion och GFP fluorescens visat sig öka proportionellt med nematod massa, som erbjuder ett bekvämt sätt för normalisering av luminiscens värden 6,9 effekterna av olika mängd maskar per brunn kan också vara. beaktas genom att inkludera flera tekniska replikat i analysen (minst 5 brunnar per betingelse). 3
Protokollet ger möjlighet att in vivo övervakning av energinivåer (i motsats till mer tekniskt arbetskrävande in vitro ATP bestämningar) som möjliggör förening screening och flytta i den fysiologiska samband med en hel multicellular organismen. Förfarandet kan förlängas till en mängd olika genetisk bakgrund genom att korsa kromosomalt integrerade transgen i tillgängliga mutantstammar och / eller genom att tysta gener genom RNA-interferens; därmed dra full nytta av C. elegans som modellorganism. Metoden bör bidra till att minska sent misslyckande läkemedelskandidater fas till följd av mitokondriell toxicitet och bidra till minskning av högre djurförsök.
Den modellorganism C. elegans ger en kraftfull experimentella system. Det är lätt att odla och producerar rikligt genetiskt identisk avkomma med en 3,5 dag livscykel från ägg till reproducera vuxen (via ungdomslarvstadier L1 fram till L4). På grund av sin ringa storlek, kan det vara enkelt odlas i 96-brunnsplattor, vilket underlättar förening screening. Vi presenterar en fenotypisk screening protokoll baserat på stammar av C. elegans som fungerar som in vivo sensorer av energinivåer. 14 Protokollet är tillämplig på alla laboratorier, även om en 96-brunnar luminometer och en steril skåp krävs. Det är viktigt att förhindra förorening i analyser med hjälp av god laboratorieteknik. Om att arbeta manuellt, är det maximala antalet nematod plattor uppnås 13 per experiment tillåter testning av 2x 96-well drogplattor och med två fordonsplattor. Representativa resultat presenteras för mitokondriekomplex I-inhibitor rotenone, superoxidgeneratorn parakvat, citronsyracykeln mellanliggande oxalacetat och fyra föreningar med känd eldflugeluciferas inhiberande aktivitet. De första två föreningarna ledde till en minskning i bioluminescens som förutspått medan oxaloacetat ledde till en förbättring, troligen att resultera från ökad generering av ATP. Oxalacetat datamängder visar också den inneboende variabiliteten i experiment baserade på eldflugeluciferas som reporter. Ett minimum av tre oberoende försök är tillrådligt att fastställa robusthet svar på okända föreningar.
Inhibering av firefly luciferasaktivitet var identifierbar med en analys in vitro med användning av ett kommersiellt kit. 3 En av föreningarna resulterade i en väsentlig ökning av GFP-fluorescens i överensstämmelse med inhibitorn öka nivåerna av GFP-märkta eldflugeluciferas genom bindning till luciferas enzymets aktiva plats, och gör den mer stabil. 15 I vissa fall(inte i det här fallet) kan detta leda till ökade nivåer av mareld när hämmaren förskjuts av överskott substrat. 15 Det är därför viktigt att inte tolka resultat felaktigt från föreningar som interagerar med eldfluga enzymet som minskad eller ökad ATP-halter / mitokondriefunktion. Förändringar i luminiscens signal korrelerar ganska ofta med ytterligare mätningar av hälsa, såsom rörelse, utveckling och tillväxt. Som ett exempel, är en förening en misstänkt luciferas inhibitor om en dramatisk nedgång i mareld signal upptäcks, men maskar inte kan skiljas från kontroller mikroskopisk observation. En ökning av GFP fluorescens, inte förklaras av tillväxt eller förening autofluorescens, kan också peka på en inhibitor. Ett antal luciferas inhibitorer 15 är kända och har ingåtts PubChem. Därför i första hand, är det god praxis att hämta information luciferas hämmare som innehas av PubChem; följt av tEsting av föreningens effekter i in vitro-analyser med det renade enzymet 3 och / eller bekräftelse av effekter på mitokondriefunktionen genom att ytterligare medel. 16,17
GFP fluorescensmätningar gör det möjligt att upptäcka eldflugeluciferas nivåer (och potentiella detektering av vissa luciferas enzymhämmare såsom diskuterats ovan) gör ett starkt argument för att mäta denna endpoint tillsammans bioluminiscens där så är möjligt. Normalisering av mareld avläsningar till GFP är också ett sätt att redovisa variationer i snäck tal mellan brunnar (även om detta också kan uppnås genom införande av flera tekniska replikat). För större känslighet, är det viktigt att subtrahera bakgrundsfluorescens från mätningarna. Protokollet bedömer bidrag av den bakteriella suspensionen till bakgrundsfluorescens emellertid nematod autofluorescens redovisas inte för (en begränsning av den aktuella analysen, särskilt kritisk för någon åldrande studör med tanke på att nematod autofluorescens ökar med åldern). Autofluorescens av testföreningar bör också bedömas parallellt. GFP normalisering verkar oumbärlig där forskare vill anpassa protokoll för att jämföra cellulära ATP-sammanslagningar i olika genetiska mutanter eller efter tysta olika gener, för att kontrollera eventuella stamskillnader på nivån av uttryck av mareld transgen.
Kritiska parametrar i protokollet innefattar utvecklingsstadiet då exponering initieras, exponeringens varaktighet, och erhålla liknande antal nematoder i olika brunnar. Exponering kan börja när som helst under utvecklingen av nematoder, men L3 scen eller äldre är att föredra. Från detta stadium, nematoder är beroende av oxidativ fosforylering för utveckling i vuxen ålder, vilket framgår av en mycket kraftig ökning i mtDNA innehåll, syreförbrukning och ATP-nivåer. 18,19,20 Den nuvarande protokollet initierar mässorure på L4 scenen. Anledningen till alikvotering nematoder till 96-brunnsplattor endast i detta skede (snarare än när de först försedd med mat på L1 stadiet), är att även om plattorna placeras i fuktiga kammare för att minimera avdunstning sker en viss avdunstning fortfarande i vår skakinkubator, ses som mycket små droppar bildas på locken (detta kan inte vara ett problem med andra skakar inkubatorer). Genom att alikvotering nematoder till plattor strax före tillsats av läkemedelsstandarder, är den faktiska läkemedelskoncentrationen påverkas inte av någon liten variation i volym på grund av avdunstning. Laddning av en nematod platta med fordon är endast användbar för att kontrollera att nematoder jämnt fördelade mellan brunnar. Eventuella signifikanta skillnader hittades för fordonet endast plattan skulle tyda på dålig teknik vid utmatning nematoderna till brunnarna.
Längden på exponeringen är en viktig faktor att beakta. Om effekterna på energistatus oberoende tillväxt är av intresse, proprotokoll kan modifieras för att rymma kortare exponeringar (från nästan omedelbara svar på, till exempel, 2 tim). Å andra sidan, införandet av föreningar i C. elegans vävnader kan ta lite tid. Till exempel 12-24 timmar krävs för att uppnå maximal inre koncentrationer av resveratrol och 5-fluor-2'-deoxiuridin (FUDR). 21 Därför kan en längre exponeringstid (18 till 24 timmar) vara motiverat att maximera exponeringsnivåer. Exponeringstiden bör begränsas till tider som inte tillåter signifikanta nivåer av mångfaldigande skall ske i brunnen. Vi rekommenderar att den totala utvecklingstiden för nematoder hålls under 66-67 timmar. Även bekvämt, är nematoder gravid då och har inlett egglaying. Ändå fann vi mareld avläsningar från ägg förberedelser för att vara försumbar (ej visad). Den sur-5 promotorn driven transgen expression först upptäcktes bara två till två och en halv timme efter befruktningen vid 100 cellstadiet 22 och chitinous äggskal är sannolikt att begränsa införsel av luciferin. Andra har funnit att embryonerade ägg inte signifikant bidrar till metabolismen av gravida vuxna. 23 emellertid villkor som möjliggör betydande avkommor produktion ska kunna undvikas. Om du vill kan den experimentella tidsskala flyttas tillbaka: vi har tidigare inlett exponering för en miljögift i slutet L3 larvstadiet (36 timmar) och genomförde mareld och GFP mätningar vid 55 h 2 Alternativt genetiska bakgrunder som är villkorligt sterilt. kan användas för att förhindra avkomma produktion, såsom till exempel den fer-15 (b16) II; FEM-1 (hc17) IV dubbel mutant som kan hållas vid 15 ° C, men är steril vid 25 ° C. 24 Användningen av FUDR att inducera sterilitet rekommenderas inte, eftersom detta kan i sig påverka nematod metabolism. 25 Analysen kan även utföras i stammar med mer genomträngnagelband såsom partiell förlust av funktionsion buss 8 mutanter som är multi känsliga på grund av ökad permeabilitet av läkemedel. 26 Detta kommer att underlätta kortare exponeringar och lägre föreningskoncentrationer. Villkoren för att lägga luciferin till dessa nematoder kan också behöva justera dvs 1% DMSO och 0,05% Triton-X100 i luminiscens bufferten kan inte krävas att förbättra luciferin tillgänglighet.
Protokollet använder 1% DMSO som bärare för föreningen leverans. Även om det inte dödlig, denna koncentration av DMSO har några biologiska effekter som vi har diskuterat i en tidigare publikation. 3 Många av de tillgängliga bibliotek läkemedels bereds i 100% DMSO, vid koncentrationer som kommer att vara lämpliga för cellbaserade analyser efter utspädning av fordon till 0,1%. Högre föreningskoncentrationer krävs för att framkalla svar i C. elegans jämfört med mänskliga celler, så att det ofta inte är möjligt att genomföra analyser vid lägre än 1% DMSO. Återigen, användning av stammar medmer genomsläppliga nagelband kan leda till att testa med lägre koncentrationer av fordon. Koncentrationer av DMSO högre än 1% rekommenderas inte.
En uppsättning inkubationstid med luciferin före avläsningar ska följas. Som tidigare visats, når luminiscens sina högsta nivåer inom den andra minuten efter att ha lagt luciferin, förblir relativt stabil under de första 5 min, följt av en långsam gradvis minskning av luminiscens under de kommande 30 min 1. Kinetiska svar på en viss kemikalie kan genomföras under detta inledande skede av 30 min efter initial dosering av luciferin.
Protokollet innebär en svält steg efter insamling av ägg för att uppnå synkronisering av nematodpopulation. Vi rekommenderar synkronisering av nematod provpopulationer eftersom olika utvecklingsstadier skiljer sig i cellulära ATP-nivåer och kan svara olika på testföreningarna. Genom att utföra svält i S komplettmedellång till skillnad från M9, är kläcknings nematoder försedd med en kolkälla (etanol), så att larverna inte utvecklas, men är inte helt svalt. 27,28 Det har också visat sig att arreste L1: s grundmålas för snabb respons på mat och normal L1 tillväxttakt uppnås inom tre timmar efter måltid blir tillgängliga. 29 det dock möjligheten att svält steget kan förändra metabolismen av C. elegans kan inte uteslutas. 30 Av denna anledning längden av svält bör inte överstiga 24 timmar (18 timmar är tillräckligt för synkronisering). Vissa laboratorier kan ha möjligheten att använda ett Copas Biosorter för ålder synkronisering förbi svält steget helt och hållet. Andra laboratorier kan ha en preferens för att expandera nematodpopulation på fasta medier (NGM plattor med OP50) före blekning (steg 3.1) och detta kommer att fungera bra också. Vi använder S mediet under förening exponering som en standardmedium för nematod odling, however andra medier kan väljas, till exempel K medium eller EPA måttligt hårt vatten används ofta för ekotoxikologiska studier. 31,32
Protokollet ger en möjlighet att screena och identifiera kandidater för ytterligare tester när det gäller effekterna på mitokondriefunktion. Vid tidpunkten för primär screening är det troligt att vissa föreningar kommer att ha missat på grund av endast en koncentration som testas, därför drog skärmar bör inte betraktas som uttömmande. Träffar kan valideras med hjälp av tekniker för att bedöma olika aspekter av mitokondriefunktion till exempel syreförbrukning, C. elegans stammar med GFP uttryck mitokondrier, fläckar för mitokondriell membranpotential och / eller ROS mätningar. 16,33,34 Den största betydelsen av metoden är att ha ett medel för screening av ett stort antal föreningar och / eller förhållandena på flercelliga organismnivå, och framför allt för att kunna dra nytta av the genetisk spårbarhet C. elegans att undersöka verkningsmekanismer. Tekniken kan bidra till att påskynda och hitta nya vägar till upptäckten av intressanta föreningar och mål. Det är tänkt att kombinationen av sensorn med genetisk bakgrund i samband med sjukdom hos människor för screening av substansbibliotek i en sjukdom relevant sammanhang kommer att ha mycket att erbjuda.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.
Orion II Microplate Luminometer | Berthold Detection Systems | with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
FLx800 fluorimeter | Biotek | with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
Ks 130 basic shaking platform | Ika | #0002980000 | |
Innova 4349 | New Brunswick Scientific | Refrigerated incubator shaker | |
Eppendorf centrifuge 5804R | Eppendorf | with eppendorf rotor A-4-44 (for 50/15ml tubes) | |
Stripette, Costar | Corning | #4489 | Serological pipette |
Cellstar 50 ml tubes | Greiner bio-one | #227661 | |
Cellstar 15 ml tubes | Greiner bio-one | #188261 | |
Cellstar 60 mm tissue culture plates | Greiner bio-one | #628160 | |
Superfrost Microscope slides | VWR | #631-0909 | |
Sterile spatula | Corning | #3007; #3004 | for weighing out chemicals |
0.22 mM Millex GP filters | Millipore | #SLGP033RS | |
Axygen eppendorf tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | #MCT-150-R | |
Corning 96 well assay plate | VWR | #3603 | Black plate clear bottom with lid |
Nunc 96 well assay plate | Fisher Scientific | #236105 | White plate with lid |
Reservoir reagent 60 mL | Thermo Scientific Finnpipette | #9510027 | used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1) |
Storage box/damp chamber | Roche Diagnostics | #10 800 058 001 | 174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid |
Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content | Sigma Aldrich | #239305 | Store in aliquots at 4°C, seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil |
D-Luciferin, potassium salt | Biotium Inc | # 10101-2 | Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots |
Tween 20 | Sigma Aldrich | # P9416 | |
DMSO | CalBiochem | #317275 | Purity 99.99% |
Triton X100 | Alfa Aesar | #A16046 | Diltute to 10% in ddH20 |
Nystatin | CalBiochem | #475914 | |
C. elegans bioluminescent strains | Author's own laboratory | PE254, PE255 | contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then. |
E. coli OP50 | CGC | ||
General chemicals | Sigma Aldrich/Fisher Scientific |