A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.
The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.
이 절차의 목적은 전반적인 C.의 에너지 상태의 신속한 계량화 화합물 스크리닝에서 엔드 포인트로 이것을 사용하여 볼 수있는 생체 내에서 간스. 이론적 근거는 선충 C에서 반딧불 루시 페라 제의 유전자 발현을 기반으로 플라스미드 pSLGCV (1 통해 엘레 1-3 https://www.addgene.org/49862 ). 루시퍼 라제 효소 (신호를 표적 루시퍼 페 록시 제거한) 녹색 형광 단백질 GFP 융합되고 세포질에서 구조적 및 보편적으로 발현된다. 루시페린 기질을 외생 제공되는 경우 이는 발광 리드. 웜이 투명하기 때문에, 광은 상대적 광 단위 (RLU)로서 루미 측정 될 수있다. 생물 발광 반응과 가용성 셀룰러 ATP 연료 생산 빛 수준을 결정합니다. 따라서, luminometry은 모든 편의를 제공합니다ATP를 생산하는 미토콘드리아에서 주로 일어나기 때문에 t는 상대적 ATP 수준을 평가 및 미토콘드리아 기능에 의해 확장을 의미한다. 미토콘드리아 기능 및 생물 발광 레벨 사이의 링크는 미토콘드리아 전자 전달계 유전자 및 수반 광 출력의 감소를 통해 이전 사일런 입증되었다. 1
PE254 (feIs4)를 지정하고 생성 된 생물 발광 균주 및 PE255 (feIs5) 1 (자료 목록 참조) 3. 상호 교환 사용할 수있는 다수의 연구는 아 지드 화 나트륨 (1), 카드뮴 (2), 하수 등의 다양한 생체 이물 화학 물질에 노출 된 후 생체 내에서 세포의 ATP 수준에보고 이러한 센서 균주를 활용 한 슬러지 추출물 3, 5'- 플루오로 -2- 데 옥시 우리 딘 (6), 및 담배 특이 니트로사민 7. 균주는 또한 C 자외선 방사선에 대한 노출의 효과를 모니터링하는 데 유용했을 <s업> (8)과 미토콘드리아의 호흡 쇄 기능을 방해의 효과. 1,9-는 GFP 융합 (PE39)없이 루시퍼 라제 유전자를 발현 발광 센서의 초기 버전은 또한 중금속 효과 조사 및 호흡기 사용되고 . uncoupler 10 균주 PE254과 PE255은 루시 페라 제를 수행 : GFP 융합 GFP의 형광 발광 값의 정상화를위한 편리한 수단을 제공하고, 선충 질량에 비례하여 증가 할 것으로 나타났다 6,9 잘 당 벌레의 차동 양의 효과도 될 수 있습니다. 분석 (조건 당 5 우물의 최소)에서 여러 기술 복제를 포함하여 고려. (3)
프로토콜은 에너지 수준의 생체 모니터링의 가능성을 제공한다 (반대로 더 기술적 힘드는 체외 ATP의 결정) 화합물의 스크리닝을 가능하게하고 전체 MU의 생리적 환경에서 재배치lticellular 유기체. 절차 및 / 또는 RNA 간섭에 의한 유전자 사일런 하시어 변이주에 형질 전환 유전자를 염색체에 통합 건너 유전 다양한 배경으로 확장 될 수있다; 따라서, C의 최대한 활용 모델 생물로 간스. 이 방법에 의한 미토콘드리아 독성 약물 후보의 후기 실패를 줄이고 더 높은 동물 실험의 감소를 향해 기여를 할 수 있도록해야한다.
모델 생물 C. 엘레은 강력한 실험 시스템을 제공합니다. 그것은 문화가 용이하고 (L4까지 청소년 애벌레 단계 (L1)을 통해) 성인의 재생에 계란에서 3.5 일 라이프 사이클과 풍부한 유 전적으로 동일한 자손을 생산하고 있습니다. 그것의 작은 크기 때문에, 이것은 편리 화합물 스크리닝을 용이하게, 96- 웰 플레이트에서 성장 될 수있다. 우리는 C의 변종에 따라 표현형 검사 프로토콜을 제시 96 웰 플레이트 루미 및 멸균 캐비넷이 요구되지만 에너지 수준의 생체 센서로서 작용 간스. 14 프로토콜은, 모든 실험에 적용 할 수있다. 이 우수 실험실 기술을 이용하여 분석에서 오염을 방지하는 것이 중요하다. 수동으로 작동하는 경우, 달성 가능한 선충 플레이트의 최대 수는 2 × 96- 웰 플레이트의 약물 검사를 허용하고 두 차량 번호판을 포함한 실험 당 13이다. 대표 결과는 내가 rotenon 억제제 미토콘드리아 복잡한 제시된다즉, 슈퍼 옥사이드 발생 파라콰트, 시트르산 회로 중간 옥 살로 아세테이트와 공지 반딧불이 루시퍼 라제 저해 활성을 갖는 화합물 네. 옥 살로 아세테이트는 향상에 ATP의 더 큰 발전에 기인 할 가능성이 주도하는 반면 예측으로 처음 두 화합물은 생물 발광의 감소되었다. 옥 살로 아세테이트 데이터 세트는 또한 리포터로서 개똥 벌레 루시퍼 라제에 기초 실험에서 고유 변화를 보여준다. 3 개의 독립적 인 실험의 최소 알 수없는 화합물에 대한 응답의 안정성을 확인하는 것이 바람직하다.
개똥 벌레 루시퍼 라제 활성의 억제는 시험 관내 분석 상업용 키트를 사용으로 식별 하였다. (3) 화합물 중 하나의 수준을 증가 억제와 일치 GFP 형광의 실질적인 증가를 초래 GFP 표지 된 루시퍼 라제 효소의 활성에 결합함으로써 반딧불 루시퍼 사이트하고 렌더링 더 안정적이다. 어떤 경우에는 15억제제 과량 기판에 의해 변위되면 (되지 특히이 경우) 이는 생물 발광 수준 증가로 이어질 수있다. 15 그것은 것이 중요 반딧불 효소와 상호 작용하는 화합물로부터 잘못하여 결과를 해석되지 ATP 수준을 감소 또는 증가함에 / 미토콘드리아 기능. 발광 신호의 변화는 매우 자주 운동, 발전과 성장으로 건강의 추가 측정과 상관 관계. 생물 발광 신호의 급격한 감소가 검출되지만 웜 현미경 관찰에 의해 대조군과 구별되는 경우 예를 들어, 화합물은 용의자 루시퍼 라제 억제제이다. 하지 성장 또는 자기 형광 화합물에 의해 설명 GFP 형광의 증가는 또한 억제제를 가리킬 수있다. 루시퍼 라제 억제제 (15)의 개수는 알려져 있고 PubChem에 입력되었다. 따라서 첫 번째 인스턴스에서, 그것은 PubChem 보유 루시퍼 라제 억제제에 대한 정보를 참조하는 것이 좋습니다이다; T 다음추가에 의해 미토콘드리아 기능에 대한 효과의 정제 된 효소 3 및 / 또는 확인과 시험 관내 시험 법의 복합 효과 esting. (16, 17)
GFP 형광 측정 가능한 생물 발광과 함께이 엔드 포인트를 측정하기위한 강한 케이스를 만들기 반딧불이 루시퍼 라제의 레벨을 검출 (및 전술 한 바와 같이 일부 루시페라아제 효소 저해제의 전위 검출)을 가능하게한다. GFP에 생물 발광 수치의 정상화는 (이 여러 기술의 복제를 포함함으로써 달성 될 수 있지만) 웰 사이 웜 번호의 변화를 차지하기위한 수단이다. 민감도를 들어, 측정에서 배경 형광을 빼는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 그러나 선충의 형광도가 현재 분석의 (제한, 어떤 노화 스투에 특히 중요한 회계 처리하지 않은 배경 형광에 세균 현탁액의 공헌을 평가) 나이가 선충의 형광도 증가 주어진 죽는다. 시험 화합물의 자기 형광도 병렬로 평가되어야한다. 연구원 생물 발광 유전자의 발현 수준에서 어떤 변형 차이를 제어하기 위해, 서로 다른 유전 적 돌연변이 또는 다른 유전자의 침묵 후 세포 ATP 풀을 비교하는 프로토콜을 적용하도록 할 때 GFP 정규화 불가결 보인다.
프로토콜 내에서 중요한 매개 변수는 노출이 시작되는 발달 단계, 노출의 길이, 다른 우물에서 선충의 비슷한 번호를 얻기를 포함한다. 노출하지만, 선충의 발달의 모든 단계에서 L3 단계를 시작할 수 이상이 바람직하다. 미토콘드리아 DNA 콘텐츠, 산소 소비와 ATP 수준에서 매우 유의 한 증가에 의해 입증에이 단계에서, 선충은 성인으로 개발을위한 산화 적 인산화에 따라 달라집니다. 18,19,20 본 프로토콜은 박람회를 시작합니다L4 단계에서 URE. (오히려 먼저 L1 단계에서 음식을 구비 한 경우보다) 만이 단계에서 96 웰 플레이트에 선충을 분취하는 이유는, 판이 증발을 최소화하기 위해 습한 챔버에 배치되어 있지만, 증발의 정도가 여전히 발생한다는 것이다 뚜껑에 형성 아주 작은 방울로 볼 우리의 진동 인큐베이터, (이것은 다른 떨고 인큐베이터에 문제가되지 않을 수 있습니다). 단지 표준 약물의 첨가 전에 플레이트에 선충을 분취하여, 실제 약물의 농도로 인해 증발 부피의 임의의 작은 변화에 의해 영향을받지 않는다. 차량 선충 판 넣기 만 선충이 고르게 우물 사이에 분포되어 있는지 확인하는 데 유용합니다. 차량 만 판을 위해 발견 된 유의 한 차이가 우물에 선충을 분배 가난한 기술을 나타내는 것입니다.
노광 길이는 고려해야 할 중요한 요소이다. 독립적으로 성장의 에너지 상태에 대한 효과는 관심, 프로 경우로토콜은 (예를 들면, 거의 즉시 반응에서, 2 시간)보다 짧은 노광을 수용하도록 변경 될 수있다. C.으로 화합물 한편, 엔트리 엘레 조직은 약간의 시간이 걸릴 수 있습니다. 예를 들어 12 ~ 24 시간이 레스베라트롤 및 5- 플루오로 -2'- 데 옥시 우리 딘 (FuDR)의 최대 내부의 농도를 달성하기 위해 요구된다. (21) 따라서, 긴 노출 (18 시간 내지 24)는 노출 레벨을 최대화하기 위해 정당화 될 수있다. 노출 시간은 상당한 수준의 재생이 잘 일어날 수 있도록하지 않는 시간으로 제한되어야한다. 우리는 선충의 총 개발 시간이 66 ~ 67 시간에서 유지하는 것이 좋습니다. 편리하지만, 선충은 그때까지 임신하는하고 egglaying을 시작했다. 그럼에도 불구하고, 우리는 무시할 수 달걀 제제에서 생물 발광 측정하는 결과 (도시 생략). 쉬르 5 프로모터 구동 트랜스 진 발현은 먼저 전용 1시 58분 시간 반 100 세포 단계 22 ℃에서 수정 후 검출hitinous 달걀 껍질은 루시페린의 항목을 제한 할 가능성이있다. 다른 사람은 유정란이 임신하는 성인의 대사에 크게 기여하지 않은 것으로 나타났습니다. (23) 그러나, 중요한 자손의 생산을 가능하게 조건을 피할 수 있습니다. 선호하는 경우, 실험 시간 척도 다시 이동 할 수 있습니다 : 우리는 이전에 늦게 L3 애벌레 단계 (36 시간)에서 환경 독소에 노출을 시작하고 55 시간에서 생물 발광 및 GFP 측정을 수행 한 조건부 멸균 2 또는 유전 적 배경. 예 FER-15 (B16) II에 관해서는, 자손의 생산을 방지하기 위해 사용될 수있다; 15 ℃로 유지 될 수있다 (hc17) IV 이중 돌연변이-1 FEM하지만, 25 ℃에서 멸균한다. (24) 불임을 유도하는 FuDR를 사용하는 것은 그 자체로 선충의 신진 대사에 영향을 미칠 수있는이 권장되지 않는다. (25) 분석 할 수 또한 부분 상실 (SECURITY) 기능을 비활성화로 더 투과 손톱과 균주에서 수행 될 수약제에 민감한 약물의 투과성을 증가 할 예정. (26)이다 이온 버스 8 돌연변이이 짧은 노출과 낮은 화합물 농도를 촉진 할 것이다. 이 선충 루시페린을 추가하는 조건은 또한 발광 버퍼에 1 % DMSO 및 0.05 % 트리톤 X100은 루시페린 가용성을 향상시키기 위해 필요하지 않을 수있다, 즉, 조정 필요가있다.
이 프로토콜은 화합물 배달을위한 차량으로 1 % DMSO를 사용합니다. 우리가 이전 책에서 논의 된 것처럼 치명적인 것은 아니지만, DMSO의 농도는 약간의 생물학적 효과가 있습니다. 가능한 약물 라이브러리의 많은 3 차량의 희석 후 세포 기반 분석에 적합 할 것 농도에서, DMSO 100 % 준비되어있다 0.1 %이다. 높은 화합물 농도에서 C. 반응을 유도하는 데 필요한 엘레가 1 % 미만인 DMSO에서 분석을 수행하는 것이 불가능하도록 인간 세포와 비교할 때. 다시 말하지만, 균주의 사용과더 투과성 손톱은 차량의 낮은 농도로 시험 발생할 수 있습니다. DMSO보다 높은 1 %의 농도는 사용하지 않는 것이 좋습니다.
이전 수치에 루시페린과 세트 배양 시간을 준수해야합니다. 이전에 나타낸 바와 같이, 발광이 다음 30 분에 1 이상의 발광 느린 점진적인 감소이어서, 루시페린 첨가 처음 5 분 동안 비교적 안정 남은 초 후에 분 이내에 최대 농도에 도달한다. 특정 화학 물질에 대한 운동 반응은 루시페린의 초기 분배 후 30 분의 초기 단계에서 수행 할 수있다.
프로토콜 선충 인구의 동기화를 달성하기 위해 계란을 수집 기아 다음 단계를 포함한다. 다른 발달 단계는 세포의 ATP 수준에 차이 및 시험 화합물에 다르게 반응 할 수 있기 때문에 우리는 선충 테스트 인구의 동기화를 권장합니다. S의 전체의 굶주림을 수행함으로써M9에 반대하는 매체로, 부화 선충은 그 애벌레 개발하지 않도록, 탄소원 (에탄올)와 함께 제공되지만 완전히 고갈되지 않습니다. (27, 28) 또한 L1 체포의이 음식에 대한 신속한 대응을위한 준비가 끝났다하고 그 표시되었습니다 정상 L1 증가율 음식 사용할 수있게 한 후 3 시간 내에 달성된다. (29) 그러나, 그것을 가능성 기아 단계 C.의 신진 대사를 변경시킬 수 있음 엘레 배제 할 수 없다. 기아의 길이가 24 시간을 초과하지 않아야이 때문에 30 (18 시간 동기화에 충분하다). 특정 실험실 완전히 고갈 단계를 우회 나이 동기화 COPAS Biosorter를 사용할 수있는 가능성을 가지고있다. 다른 실험실 전에 표백에 (OP50와 NGM 플레이트) 고체 배지에 (단계 3.1) 선충 인구 확대를위한 환경 설정을 가질 수 있으며,이 너무 잘 작동합니다. 우리는 선충의 배양을위한 표준 매체 등의 화합물에 노출시 S 매체를 사용 howeveR 다른 매체 예를 K 매체 또는 EPA 적당히 하드 물, 선택할 수는 종종 생태 독성 연구에 사용됩니다. (31, 32)
프로토콜은 수단 선별하고 미토콘드리아의 기능에 미치는 영향의 측면에서 더 테스트를 위해 후보를 식별 할 수를 제공합니다. 차 심사의 단계에서 그것은 몇 가지 화합물 따라서 약물 화면은 철저한 간주되어서는 안됩니다 때문에 하나의 농도를 테스트 할에 누락 된 가능성이 높습니다. 히트 예컨대 산소 소비 C. 위해 미토콘드리아 기능의 다른 양태를 평가하는 기법의 사용에 의해 확인 될 수있다 엘레는 GFP 표현 미토콘드리아와 균주, 미토콘드리아 막 잠재력 및 / 또는 ROS 측정을위한 얼룩. 16,33,34 방법론의 가장 큰 의미는 다세포 유기체 수준에서 화합물 및 / 또는 조건의 많은 수를 스크리닝하는 방법을 가지고있다, 그리고 중요한 일을 활용 할 수 있도록C의 전자 유전 취급 용이성 행동의 메커니즘을 조사하기 위해 엘레 간스. 이 기술은 가속화하고 흥미로운 화합물 및 대상의 발견에 새로운 경로를 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 질병 관련 맥락에서 화합물 라이브러리의 심사에 대한 인간의 질병과 관련된 유전 적 배경을 가진 센서의 조합이 제공하는 많은있을 것이라는 점을 예상한다.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.
Orion II Microplate Luminometer | Berthold Detection Systems | with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
FLx800 fluorimeter | Biotek | with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
Ks 130 basic shaking platform | Ika | #0002980000 | |
Innova 4349 | New Brunswick Scientific | Refrigerated incubator shaker | |
Eppendorf centrifuge 5804R | Eppendorf | with eppendorf rotor A-4-44 (for 50/15ml tubes) | |
Stripette, Costar | Corning | #4489 | Serological pipette |
Cellstar 50 ml tubes | Greiner bio-one | #227661 | |
Cellstar 15 ml tubes | Greiner bio-one | #188261 | |
Cellstar 60 mm tissue culture plates | Greiner bio-one | #628160 | |
Superfrost Microscope slides | VWR | #631-0909 | |
Sterile spatula | Corning | #3007; #3004 | for weighing out chemicals |
0.22 mM Millex GP filters | Millipore | #SLGP033RS | |
Axygen eppendorf tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | #MCT-150-R | |
Corning 96 well assay plate | VWR | #3603 | Black plate clear bottom with lid |
Nunc 96 well assay plate | Fisher Scientific | #236105 | White plate with lid |
Reservoir reagent 60 mL | Thermo Scientific Finnpipette | #9510027 | used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1) |
Storage box/damp chamber | Roche Diagnostics | #10 800 058 001 | 174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid |
Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content | Sigma Aldrich | #239305 | Store in aliquots at 4°C, seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil |
D-Luciferin, potassium salt | Biotium Inc | # 10101-2 | Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots |
Tween 20 | Sigma Aldrich | # P9416 | |
DMSO | CalBiochem | #317275 | Purity 99.99% |
Triton X100 | Alfa Aesar | #A16046 | Diltute to 10% in ddH20 |
Nystatin | CalBiochem | #475914 | |
C. elegans bioluminescent strains | Author's own laboratory | PE254, PE255 | contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then. |
E. coli OP50 | CGC | ||
General chemicals | Sigma Aldrich/Fisher Scientific |