Introduction
מחקרים של ספיגה במעיים של שומן, ותרופות מסיסים בשומנים וויטמינים יכולים להתנהל in vivo על ידי שימוש במודל פיסטולה הלימפה 1 - 4. עם זאת, הטכניקות הניתוחיות המעורבים הן לא רק אתגר, אבל גם יקרות. למרות in vivo גישות המבוסס על ניתוח צואה עשויה להיות מנוצלת, הם משמשים בעיקר כדי לקבוע את ספיגת אחוזים על ידי מערכת עיכול 2,5. המודל במבחנה המתואר במאמר זה הוא יותר חסכוני, והטכניקות מעורבות הן ללא ספק פחות מאתגרות. מחקרי הנדסה גנטיים הם גם חסכוניים יותר ופחות כאשר הם נערכו באמצעות מודל במבחנה זה זמן רב.
מאז חומרי שומנים מסיסים הנלקחים על ידי enterocytes ארוזים ליפופרוטאינים 6,7, את האפקטיביות של מודל זה במבחנה כדי לייצר ליפופרוטאינים היא קריטיות. Intestina שתי העיקריליפופרוטאינים l הם chylomicrons ומאוד ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (VLDL). Chylomicrons, מוגדר כיפופרוטאינים עם 80 ננומטר או יותר בקוטר, מיוצר אך ורק על ידי המעי הדק כאשר שומנים הם בשפע נוכחי בלומן במערכת העיכול. מאז הם יפופרוטאינים הגדולים, chylomicrons הם להעלות על הדעת מובילי שומנים יעילים ביותר. מודל זה במבחנה, שהוא מסוגל לייצר chylomicrons 8, יכול לשמש כדי לחקור קליטה תזונתית שומן, ספיגת ויטמין מסיס בשומנים על ידי המעיים, וזמינות ביולוגית תרופה אוראלית lipophilic. הנוכחות של מולקולות שומנים מסיסים, ויטמינים, או סמים בשבריר ליפופרוטאין היא אינדיקטור של קליטתם על ידי המעי הדק. כפי שנאמר קודם לכן, מודל זה יכול לשמש כדי לשפר את הזמינות הביולוגית תרופה אוראלית lipophilic 6.
מאמר זה מתאר כיצד יש לשמור על קאקו-2 תאים בקרום חדיר או מנות בתרבית רקמה רגילות, איך מיל השומניםxture לגירוי ייצור ליפופרוטאין צריך להיות מוכן, איך מערכת ביטוי lentivirus יכולה להיות מועסקות על מנת להשיג ביטוי יתר יעיל, וכיצד יש לנתח יפופרוטאינים המבודדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תחזוקה של קאקו-2 תאים
- שימוש בכלים בתרבית רקמה רגילים
- להפשיר את קאקו-2 תאים מבקבוקון קפוא על ידי הצבת את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, ומייד להוסיף אותם לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילה 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה (15% בסרום שור עוברי מחומם מראש (FBS ) בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM)).
- כאשר קאקו-2 התאים הגיעו 50-70 מפגש%, לפצל אותם 1: 6 על ידי דוגרים התאים עם 3 מיליליטר של 0.05% חומצת ethylenediaminetetraacetic / 0.53 מ"מ טריפסין (EDTA) על 37 מעלות צלזיוס עד שהם מנותקים (15 דקות) . כדי למנוע clumping תא, לערבב את התאים מספר פעמים על ידי pipetting העדין. הוסף 0.5 מיליליטר של תאי trypsinized לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילה 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה מחוממת מראש.
- נער בעדינות את המנות כמה פעמים בכיוון קדימה ואחורה ואחריו כיוון שמאלה וימינה. הימנע מתערבל המנותכפי שהוא עשוי לגרום לפיזור של תאים שאינו שווה.
- מניחים את הכלים על משטח שטוח בחממה 37 ° C מסופקת עם 5% CO 2. משטחים משופעים עשויים גם לגרום לפיזור של תאים שאינו שווה.
- לשנות את תקשורת צמיחת יום לאחר תחילת הדגירה.
- צג התאים ולהקליט את היום שהם מגיעים למפגש. זה ייקח כ 1 שבוע לתאים מגיעים למפגש מהיום שהם נפרדו.
- לשנות את תקשורת הצמיחה פעמיים בשבוע לפני התאים להגיע למפגש. ברגע שהתאים הגיעו מפגש, לשנות את תקשורת צמיחה בכל יום אחר. אחרי התאים 7 ימים לאחר מחוברות, לשנות את תקשורת הצמיחה יומית.
הערה: התאים מוכנים לניסויים כאשר הם 13 ימים שלאחר מחוברות (איור 1). מאז תאי סופו של הדבר להיות פחות יעילים בייצור יפופרוטאינים, להשתמש בתאים שבין 13 עד 17 ימים לאחר מחוברות 8. עבור לשלב 3 על איך לבצע את הניסוי.
- להפשיר את קאקו-2 תאים מבקבוקון קפוא על ידי הצבת את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, ומייד להוסיף אותם לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילה 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה (15% בסרום שור עוברי מחומם מראש (FBS ) בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM)).
- שימוש במערכת הקרום החדיר
- זרעי קאקו-2 תאים בכנס הקרום החדיר כמתואר בשלב 1.1.1.1. לעיל. הימנע משימוש בתאים מבקבוקון קפוא כי צמיחת התאים שלהם היא בדרך כלל איטית יותר (תקופת החלמה). בקצרה, להוסיף 0.5 מיליליטר של תאי trypsinized לתא הפסגה (תא עליון) המכיל 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה מחוממת מראש. כמו כן, להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה המחוממת מראש לתא basolateral (בתא תחתון).
הערה: התרגול הטוב ביותר, להוסיף את תקשורת הצמיחה לתא הפסגה הראשונה ולאחר מכן לתא basolateral. כאשר מוציא את המדיה הישנה, להסיר את המדיה basolateral לפני תקשורת הפסגה. הימנע תוקע את קרום פוליקרבונט כפי שהוא עשוי להיקרע הקרום. - בשל הראות לקויה תא דרך קרום פוליקרבונט, זרע קאקו-2 התאים בצלחת תרבית רקמה רגילה עם צפיפות דומה, ולהשתמש במנה זו לשפוט את מפגש התא.
- עקוב יםteps 1.1.2-1.1.6 לעיל.
- זרעי קאקו-2 תאים בכנס הקרום החדיר כמתואר בשלב 1.1.1.1. לעיל. הימנע משימוש בתאים מבקבוקון קפוא כי צמיחת התאים שלהם היא בדרך כלל איטית יותר (תקופת החלמה). בקצרה, להוסיף 0.5 מיליליטר של תאי trypsinized לתא הפסגה (תא עליון) המכיל 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה מחוממת מראש. כמו כן, להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה המחוממת מראש לתא basolateral (בתא תחתון).
2. ג'ין ביטוי יתר
- שימוש בגישת transfection הרגילה
- זרעי קאקו-2 תאים בצלחת תרבית רקמה, כמתואר ב1.1.1.1.-1.1.4 לעיל.
הערה: כאשר התאים כ 40-50% ומחוברות, הם מוכנים להיות transfected. - להוסיף 67 μl של מגיב transfection לμl 472 של התקשורת בסרום המופחתת בצינור microcentrifuge. יש להימנע ממגע של מגיב transfection חי עם קיר הצינור.
- להוסיף 23 מיקרוגרם של pLL3.7 משופרים חלבון ירוק ניאון (eGFP) 9 למגיב transfection / תערובת תקשורת סרום מופחתת.
- דגירה את התערובת במשך 20 דקות ב RT.
- החלף תקשורת צמיחת קאקו-2 תאים עם 8 מיליליטר של 10% FBS בDMEM.
- מוסיף את תערובת DNA / מגיב transfection / מדיה סרום מופחתת ירידה מבחינת לצלחת.
- נער בעדינות את המנות כמה פעמים בקדימה ותואר ראשוןכיוון ckward אחרי כיוון שמאלה וימינה.
- מניחים את הצלחת בחממת 37 ° C.
- החלף את המדיה בצלחת עם 10 מיליליטר של תקשורת צמיחת יום לאחר תחילת הדגירה.
- לפקח על ביטוי גנים.
- צג ביטוי גנים ללא 6-diamidino-2-phenylindole צביעת 4 ', (DAPI). באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לקבוע את האחוזים של תאים שהם ירוקים. אחוז מייצג את יעילות transfection.
- צג ביטוי גנים עם מכתים DAPI.
- לשטוף את התאים עם מי מלח פוספט (PBS) שלוש פעמים.
- תקן את התאים על ידי הוספת 10 מיליליטר של פורמלדהיד 4% ב- PBS (דגירה 10 דקות ב RT).
- לשטוף את התאים עם PBS פעמים שלוש.
- דגירה התאים בחושך במשך 15 דקות ב RT עם 8 מיליליטר של PBS המכיל 1: 500 DAPI, BSA 1%, digitonin 0.01%.
- לשטוף את התאים עם PBS פעמים שלוש.
- Uלשיר מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לקבוע את מספר התאים שהם בצבע ירוק / כחול ביחס לאלה ש( פנל עליון איור 2) כחול. בחישוב אחוז מייצג את יעילות transfection.
- זרעי קאקו-2 תאים בצלחת תרבית רקמה, כמתואר ב1.1.1.1.-1.1.4 לעיל.
- שימוש במערכת ביטוי יתר lentivirus 10
- תאי זרע אנושיים כליה עוברית (HEK) 293T בצלחת תרבית רקמת 15 סנטימטר (10% FBS בDMEM כתקשורת הצמיחה שלהם).
הערה: כאשר התאים כ 60-70% ומחוברות, הם מוכנים להיות transfected. - להוסיף 162 μl של מגיב transfection ל1,133 μl של התקשורת בסרום המופחתת בצינור microcentrifuge 11. יש להימנע ממגע של מגיב transfection חי עם קיר הצינור.
- להוסיף 24 מיקרוגרם של pLL3.7 eGFP (או מבנה אחר), 15.6 מיקרוגרם של אלמנט תגובת Rev (RRE), 6.0 מיקרוגרם של REV, ו -8.4 מיקרוגרם של גליקופרוטאין וירוס stomatitis שלפוחי (VSVG) למגיב transfection / Rתערובת תקשורת הסרום צמח.
- דגירה את התערובת במשך 20 דקות ב RT.
- החלף את המדיה הצמיחה עם 16 מיליליטר של 10% FBS בDMEM.
- מוסיף את תערובת DNA / מגיב transfection / מדיה סרום מופחתת ירידה מבחינת לצלחת.
- נער בעדינות את המנות כמה פעמים בכיוון קדימה ואחורה ואחריו כיוון שמאלה וימינה. זה נורמלי לראות כמה תאי HEK293T מנותקים בשלב זה.
- מניחים את הצלחת בחממה.
- לאחר 24 שעות של דגירה, להחליף את התקשורת בצלחת עם 25 מיליליטר של תקשורת צמיחה.
- ביום הבא, לאסוף תקשורת הצמיחה המכילה lentivirus (האוסף הראשון).
- חזור על שלב 2.2.10 לאסוף יותר lentivirus (האוסף השני).
- בריכת האוסף הראשון והשני, ולהסיר פסולת תא על ידי צנטריפוגה (2500 XG במשך 5 דקות).
- סנן את האוסף עם מסנן בקבוק העליון חד פעמי (0.45 מיקרומטר נקבובית), ולרכז את הנגיף על ידי צנטריפוגה האוסף ב31,400 XG לשעה 2 ב RT (JA-20 הרוטור). סמן את החלק התחתון של צינור צנטריפוגות בי גלולה נמצא. למזוג supernatant, ולהשאיר את הצינור ההפוך ב RT במשך 15 דקות על.
- Resuspend גלולה המכיל וירוס עם של 1X PBS 100 μl. למנוע בועות.
- אחסן את הווירוס מרוכז ב -80 ° C. הימנע מחזורים להקפיא להפשיר.
- לקבוע את הכמות האופטימלית של וירוס צריך transduce קאקו-2 תאים על ידי טיטרציה. כדי לחסוך בעלויות, השתמש בצלחת 24 גם (0.3 מיליליטר של תקשורת צמיחה / טוב) במקום צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים לטיטרציה.
- להוסיף כמויות גדלות והולכות של הנגיף המרוכז (0, 1, 2, 5, 10, 25, ו -50 μl / טוב) בתוספת polybrene (ריכוז = 5 מיקרוגרם / מיליליטר סופי) ולמחוברות 40-70% קאקו-2 תאים. לנער את צלחת 24 גם בעדינות כפי שמתואר ב1.1.2.
- צג ביטוי גנים שלהם (שלב 2.1.10.) (תחתון 2 איור4 פנלים).
- מאז הביטוי של transgene בדרך כלל נגרם, לשמור על תאי transduced לניסויים עתידיים ולפקח באופן רציף ביטוי גנים שלהם (שלב 2.1.10.).
- תאי זרע אנושיים כליה עוברית (HEK) 293T בצלחת תרבית רקמת 15 סנטימטר (10% FBS בDMEM כתקשורת הצמיחה שלהם).
3. גירוי ההפרשה ליפופרוטאין
- שימוש בצלחת תרבית הרקמה הרגילה
- הכן תערובת שומנים 100X על ידי ערבוב 50 מ"ג של חומצה אולאית, 40 מ"ג של לציטין, ו -48 מ"ג של נתרן taurocholate. תביא את הנפח עד 900 μl עם PBS (מספיק עבור 8 מנות). מערבולת תערובת השומנים במרץ.
- להוסיף 900 μl של תערובת השומנים 100X ל89.1 מיליליטר של תקשורת צמיחה. לערבב, ולסנן את התקשורת המכיל שומנים. הריכוזים הסופיים (1X) של חומצה אולאית, לציטין, וtaurocholate נתרן הם 2.0 מ"מ, 1.36 מ"מ, ו1.0 מ"מ, בהתאמה.
- להוסיף 10 מיליליטר של התקשורת המכיל שומנים לתאים.
- דגירה התאים עם התקשורת המכיל שומנים במשך 4 שעות ב37° C חממה.
- לשטוף את התאים עם PBS פעמים שלוש.
- להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת הצמיחה לתאים כדי לאסוף את הפרשת השומנים בדם.
- דגירה עבור שעה 2 באינקובטור 37 ° C.
- לאסוף את המדיה המכיל שומנים בדם.
- שימוש במערכת הקרום החדיר
- בצע את הפעולות 3.1.1-3.1.2 להכין את תערובת השומנים.
- להוסיף 10 מיליליטר של התקשורת המכיל שומנים לתא הפסגה ו -10 מיליליטר של תקשורת הצמיחה לתא basolateral.
- דגירה של 4 שעות בחממה 37 ° C. לאסוף את המדיה המכיל ליפופרוטאין בתא basolateral.
4. בידוד ליפופרוטאין (איור 3)
- הסר את פסולת התא מהתקשורת המכיל ליפופרוטאין על ידי צנטריפוגה (2,000 XG במשך 5 דקות).
- למזוג את התקשורת לתוך שפופרת 50 מיליליטר.
- להוסיף 5.95 גרם של נתרן כלורי לתקשורת.
- אם sample ינותח על ידי TEM, להוסיף לוח מעכבי פרוטאז קוקטייל 1 כדי לשמור על השלמות של ליפופרוטאין.
- תביא את הנפח עד 23 מיליליטר עם מים (1.2 גרם מיליליטר NaCl פתרון צפיפות /).
- ממיסים את המומסים לחלוטין.
- למזוג כל הפתרון לתוך צינור ultracentrifuge פוליקרבונט.
- בעדינות כיסוי פתרון צפיפות 1.2 גר '/ מיליליטר עם 0.5 מיליליטר מים (1.0 / מיליליטר צפיפות ז).
- לאזן את הצינור לפי משקל ולא לפי נפח.
- בעדינות לטעון צינורות בהרוטור T865.
- ספין הדגימות בultracentrifuge ב429460 XG במשך 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
- מייד לבודד את הפתרון 0.5 מיליליטר העליון על ידי pipetting העדין. שמור את הצינור כעדיין אפשרית כ.
ניתוח 5. TEM
- הכן 5 מיליליטר של 2% חומצת phosphotungstic (w / v) ולהתאים את ה- pH 6.0.
- סנן 2% חומצת phosphotungstic עם מסנן מזרק (גודל נקבובית: 0.2 מיקרומטר).
- ירידה של 20 μl של מדגם ליפופרוטאין בצלחת סטרילית.
- ירידה של 20 μl של 2% חומצת phosphotungstic המסונן ליד המדגם על אותה הצלחת.
- בעדינות שחרר רשת EM עם הצד המשעמם נח על המדגם.
- לדגור על RT דקות 1.
- לטפוח בעדינות את הצד של רשת EM על נייר סינון כדי להסיר את המדגם מהרשת.
- בעדינות שחרר את רשת EM עם הצד המשעמם נח על 2% חומצת phosphotungstic.
- לדגור על RT דקות 1.
- לטפוח בעדינות את הצד של רשת EM על נייר סינון כדי להסיר את חומצת phosphotungstic מהרשת.
- באמצעות TEM, ללכוד את התמונות של ליפופרוטאין (איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור קאקו-2 תאים נורמלים 1 מציג 13 ימים לאחר מחוברות. המראה של מבנים בצורת כיפה וטיפי שומנים תאיות אופייני של קאקו-2 תאים מובחנים. כאשר קאקו-2 התאים אינם מפוזרים באופן שווה במהלך זריעה, הם גוש ולגדול באזורים מסוימים של המנה; ויהיו כמה אזורים בצלחת ללא כל תאים. מתערבל והצבת הצלחת על משטח משופע יש להימנע. כמו כן, חשוב לשים לב שהודעת מחוברות-קאקו-2 תאים רגישים יותר לניתוק כאשר תקשורת צמיחה חדשה תתווסף לתאים בערך מדי. לכן, יש להוסיף מדיה החדשה בעדינות כדי למנוע ניתוק תא.
בהתבסס על מחקרים אלה, יעילות transfection של קאקו-2 תאים הייתה בין 30-60% (איור 2 פנלים העליונים). לעומת זאת, יעילות התמרה של קאקו-2 באמצעות מערכת ביטוי lentivirus הייתה כ -100% (איור 2 איור 2 הראה גם כי הכמות האופטימלית של lentivirus המרוכז הייתה 10 μl. קאקו-2 תאי transduced נשמרו עד 12 קטעים. כפי שניתן לראות, גם לאחר 12 קטעי התאים transduced עדיין הביעו eGFP. יעילות התמרה בבירור תלויה בריכוז lentivirus. האישור של יעילות transfection / התמרה הוא קריטי, ויש לבצעו כניתוח ראשוני שיגרתי לפני הניסויים בפועל. למרות שניתוח כתם מערבי ניתן להשתמש כדי להעריך את גידול אחוזים מביטוי גנים, זה לא צריך להיות השיטה העיקרית לקביעת יעילות transfection / התמרה.
שימוש בשיטת NaCl שיפוע צפיפות ultracentrifugation (איור 3), ליפופרוטאינים מופרשים על ידי קאקו-2 התאים היו מבודדים ונותח על TEM. חלק מchylomicrons, ליפופרוטאין גדול יותר מ -80 ננומטר בקוטר, היו מתוארים באיור4. יפופרוטאינים הקטנים יותר, VLDLs, היו גם בהווה. זה חיוני כדי לאשר את הבידוד המוצלח של שני chylomicrons וVLDLs על TEM. כפי שנאמר בעבר 8, ניתוח ביוכימי לא צריך להיות השיטה העיקרית של אישור. היעדר יפופרוטאינים, במיוחד chylomicrons, מצביע על כך שתחבורת השומנים על ידי קאקו-2 התאים היא לא יעילה. כתוצאה מכך, הם לא ישמשו כמודל טוב ללמוד תחבורת שומנים. מספר חלקיקי chylomicron ביחס למספר הכולל של חלקיקים ליפופרוטאין ניתן לספור 8. אחוז גבוה מצביע תחבורת שומנים יעילה.
טיפות שומנים איור 1. מיקרוסקופ נציג של קאקו-2 תאי פוסט-מחוברות 13 יום. תאיים נראות בכמה תאים (חץ אדום). המבנים הייחודיים בצורת כיפה (חץ שחור) FOrmed על ידי כמה קאקו-2 תאים הם בדרך כלל קיים רק לאחר שהתאים הגיעו מפגש. הגדלה = 100X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. השוואה של מערכת ביטוי lentivirus היעילות של transfection השומנים מבוסס ופנל עליון:. קאקו-2 תאים היו transfected עם pLL3.7 eGFP באמצעות מגיב הלא liposomal transfection (בר = 20 מיקרומטר Scale). 4 פנלים תחתון: קאקו-2 תאים היו transduced עם pLL3.7 eGFP באמצעות מערכת ביטוי lentivirus עם כמויות משתנות (1, 2, 5, או 10 μl) של lentivirus המרוכז (LV). התאים המוצגות היו מהמעבר ה -12 של תאי transduced המקוריים. הלוחות עזבו להראות מכתים DAPI, הרשות הפלסטינית אמצענלס להראות הקרינה GFP, והלוחות מימין מראים את התמונות הממוזגות. מערכת ביטוי lentivirus הייתה כנראה יעילה יותר מtransfection השומנים מבוסס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בידוד איור 3. של ליפופרוטאין במעיים באמצעות ultracentrifugation שיפוע צפיפות NaCl. הצפיפות של תקשורת המכיל ליפופרוטאין מותאם ל1.2 גרם / מיליליטר ידי הוספת הכמות המתאימה של NaCl. הנפח של המדגם גם צריך להיות מותאם כך שהוא ימלא את כל צינור ultracentrifuge כדי למנוע קריסה. כדי להשיג שיפוע צפיפות, 0.5 מיליליטר של מים מעולף בעדינות על g / מיליליטר פתרון צפיפות 1.2. המדגם לאחר מכן הסתובב ב429460 XG במשך 24 שעות באמצעות T865הרוטור (שווה ערך ל 2.15 יחידות סודברג). ליפופרוטאינים המעיים צריכים להיות התאוששו באופן מיידי על ידי pipetting העדין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. מיקרוסקופ אלקטרונים נציג של ליפופרוטאין מיוצר על ידי קאקו-2 תאים. יפופרוטאינים מבודדים על ידי ultracentrifugation שיפוע צפיפות NaCl היה מוכתמים שלילי עם 2% חומצת phosphotungstic (pH 6.0). Chylomicrons, חלקיקי שומנים גדולים יותר מ -80 ננומטר בקוטר, וVLDLs, ננומטר קטן יותר מ -80 אלה, שניהם נמצאים. בר סולם = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, שתי מערכות שיכולים לשמש כדי לשמור קאקו-2 תאים מתוארים, כלומר, צלחת תרבית רקמה הרגילה וקרום החדיר. היתרונות של שימוש במערכת הקרום החדיר כוללים הפרדה של הפסגה ותאי basolateral, ואת יכולת דגירה תערובת השומנים ולאסוף את ההפרשה ליפופרוטאין בו זמנית. עם זאת, מוסיף קרום החדיר הם יקרים, וקרום פוליקרבונט אינו מאפשר את חשיפת תא טובה. אחד היתרונות של מודל זה במבחנה הוא שמחקרי מניפולציה גנטיים יהיו חסכוניים יותר ופחות זמן רב. ליעילות טובה יותר, יש להשתמש במערכת ביטוי lentivirus. קאקו-2 התאים transduced שומרים בדרך כלל על הביטוי של transgene.
היכולת של קאקו-2 תאים לייצר chylomicrons היא בעלת חשיבות עליונה. ללא יכולת זו, קאקו-2 תאים לא יהיו מסוגלים efficiently הובלת חומרי lipophilic, לרבות אך לא רק לתרופות liphophilic, ויטמין A, D, E, K, וכל חומרים מזינים מסיסים בשומנים. השיטות הנכונים לאתגר את קאקו-2 תאים לייצר שני חלקיקי VLDL וchylomicrons מתוארים. הבידוד המוצלח של חלקיקים ליפופרוטאין אלה צריך להיות מאושר על TEM. בהתבסס על הספרות הנוכחית, קאקו-2 דגם זה מציע תחבורת שומנים היעילה ביותר בקרב קאקו-2 דגמים אחרים 12 - 14. עם זאת, במודל vivo cannulation הלימפה עדיין מעביר שומנים ביעילות רבה יותר מאשר כל מודל במבחנה. הסיבות שבבסיס כבר נדונו לאחרונה 8, כלומר כי קאקו-2 תאים לייצר 2 isoforms שונה של אפוליפופרוטאין B, קאקו-2 תאים לא יכולים לסנתז טריגליצרידים מmonoglycerides, והמרכיב קריטי בסרום לbiogenesis chylomicron עשוי להיות נמוך יותר בתקשורת הצמיחה . כמו כן, חשוב להבין את המגבלה של זה במודל חוץ גופית; מודל זה במבחנה אינו כולל כמה גורמים חשובים פוטנציאליים, כגון תנועתיות מעי, האנטומיה של המעיים, ואינטראקציה עם מערכות איברים אחרות.
הגורמים העיקריים המאפשרים קאקו-2 תאים לייצר chylomicrons יעילות הם הסוג / כמות השומנים משמשים והתמיינות 8. ללא שילוב הנכון של גורמים אלה, קאקו-2 תאים לא לייצר מספר משמעותי של chylomicrons 8. ראוי לציין, ultracentrifugation שיפוע צפיפות NaCl צריך להתבצע כראוי. הבידוד המוצלח של ליפופרוטאין תלוי בעיתוי (מיידי ללא עיכוב משמעותי), מדגם טוב טיפול (חסון בלי הרבה תסיסה), וpipetting זהיר (מקבל רק את השכבה העליונה). טכניקה נכונה יכולה להיות מתורגלת באמצעות שומנים מוכתמים מראש כדי לעזור להמחיש את שכבת ליפופרוטאין 8. חוץ מזה TEM, ניתוחים ביוכימיים, כלומר, אפוליפופרוטאין B וטריגליצרידים ניתוחים, יכולים להיות גם used כדי לאשר את הבידוד המוצלח של ליפופרוטאין. ניתוחים אלה ביוכימי, שיש לנו הדיווח בעבר 8, יכולים לשמש גם שיטות בכימות קליטה. עם זאת, TEM עדיין צריכה להתבצע בשל הנטייה של ליפופרוטאין כדי לצבור 2, גרימת הערכת יתר פוטנציאל של ייצור chylomicron.
מודל זה במבחנה שימושי במיוחד ללימוד ספיגת שומן תזונתי וספיגה במעי של תרופות lipophilic, ויטמינים, שומנים וחומרים מזינים מסיסים אחרים. זה גם יכול לשמש כמודל לשיפור זמינות ביולוגית ירודה של תרופות אוראליות lipophilic. מאז חומרי שומנים מסיסים ארוזים לתוך chylomicrons ידי enterocytes לתחבורה למחזור, קאקו-2 תאים מייצרי chylomicron יהיו יעילים יותר בקליטת תרופות lipophilic. בנוסף, מודל זה מאפשר לחוקרים לקבוע את תפקידו של גן מסוים בקליטת תרופה על ידי המעיים (Pharmacogenetics). זה גם מאפשר בvestigators להשוות את ההשפעה של שומנים תזונתיים שונים בזמינות ביולוגית תרופה אוראלית lipophilic. כל היישומים הללו כבר דנו בעבר 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | VWR | 16750-112 | Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells |
| FBS | Fisher | 3600511 | We do not heat inactivate our serum |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment |
| Permeable membrane system | Fisher | 7200173 | 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane |
| 10 cm dish | Fisher | 08-772-E | Tissue culture dish |
| 15 cm dish | Fisher | 08-772-24 | Tissue culture dish |
| 24 well plate | Fisher | 12565163 | Tissue culture plate |
| Lipid-based transfection reagent | Fisher | PRE2691 | Can be substituted with other transfection reagent |
| Reduced serum media | Invitrogen | 11058021 | For transfection |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Bottle-top filter | Fisher | 9761120 | 0.45 mm pore |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/ml |
| Oleic acid | Sigma | 01383-5G | Prevent freeze-thaw cycle |
| Lecithin | Fisher | IC10214625 | Egg lecithin |
| Sodium taurocholate | Fisher | NC9620276 | Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956 |
| Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) | Fisher | 5892791001 | Used mainly for samples that need TEM analysis |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Fisher | NC9696153 | Reusing it multiple times will collapse the tube |
| Lid for ultracentrifuge tube | Fisher | NC9796914 | A tool is required to remove the tube/lid from rotor |
| Syringe | Fisher | 50-949-261 | Disposable |
| Syringe filter | Fisher | 09-719C | Pore size = 0.2 mm; nylon |
| Phosphotungstic acid | Fisher | AC208310250 | For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0 |
| Tweezer | Fisher | 50-238-62 | Extra fine and strong tips |
| Formvar/carbon grid | Fisher | 50-260-34 | Formvar/carbon film square grid 400 Copper |
References
- Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
- Nauli, A. M., et al. CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine. Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).
- Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).
- Lo, C. -M., et al. Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).
- Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption. Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).
- Nauli, A. M., Nauli, S. M. Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability. Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).
- Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein. Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).
- Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiol Rep. 2 (6), (2014).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Pottekat, A., et al. Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release. Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).
- Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells. Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).
- Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).
- Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).
