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Biology

Usando Caco-2 em células para estudo LIPID Transportes pelo intestino

Published: August 20, 2015 doi: 10.3791/53086
Automatic Translation
1, 2
1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University

Introduction

Estudos de absorção intestinal de gordura da dieta, e drogas e vitaminas solúveis em lípidos pode ser realizada in vivo usando um modelo de fistula linfática 1-4. No entanto, as técnicas cirúrgicas envolvidas não são apenas um desafio, mas também caro. Embora abordagens in vivo com base na análise fecal podem ser utilizados, eles são utilizados principalmente para determinar a percentagem de absorção pelo tracto gastrointestinal 2,5. O modelo in vitro descrito neste trabalho é mais rentável, e as técnicas envolvidas são, indiscutivelmente, menos desafiador. Estudos de modificação genética são também mais económico e menos quando eles são conduzidos usando este modelo in vitro demorado.

Uma vez que os materiais solúveis em lípidos que são absorvidos por enterócitos são empacotados em lipoproteínas de 6,7, a eficácia deste modelo in vitro para a produção de lipoproteínas é crucial. Os dois intestina principall lipoproteínas são quilomicrons e lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL). Os quilomicrons, lipoproteínas como definidas com 80 nm ou mais de diâmetro, são produzidos de forma rigorosa o intestino delgado, quando lípidos estão abundantemente presentes no lúmen gastrointestinal. Uma vez que eles são os maiores lipoproteínas, chylomicrons são concebivelmente os transportadores lipídicos mais eficientes. Este modelo in vitro, que é capaz de produzir quilomicrons 8, pode ser usado para estudar a absorção de gordura dietética, a vitamina solúvel em lípidos absorção pelo intestino, e biodisponibilidade oral da droga lipofílica. A presença de moléculas solúveis em lípidos, vitaminas ou drogas na fracção de lipoproteínas é um indicador da sua absorção pelo intestino delgado. Como discutido anteriormente, este modelo pode ser usado para melhorar a biodisponibilidade oral da droga lipofílica 6.

Este artigo descreve como células Caco-2 devem ser mantidas na membrana permeável ou regular pratos de cultura de tecidos, como os lipídios mixture para estimular a produção de lipoproteína deve ser preparado, como o sistema de expressão de lentivírus pode ser empregue para atingir a sobre-expressão eficaz, e como as lipoproteínas isolados devem ser analisados.

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Protocol

1. A manutenção das células Caco-2

  1. Usando regulares pratos de cultura de tecidos
    1. Descongelar as células Caco-2 a partir de um frasco congelado colocando o frasco num banho de água a 37 C °, e adicioná-los imediatamente para uma placa de 10 cm de cultura de tecidos contendo 10 ml de meio de crescimento (15% de soro bovino fetal pré-aquecido (FBS ) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM)).
      1. Quando as células Caco-2 atingiram 50-70% de confluência, dividi-los 1: 6 por incubação das células com 3 ml de 0,05% de tripsina / 0,53 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 37 ° C até que eles são destacados (15 min) . Para evitar aglomeração de células, mistura as células várias vezes por pipetagem suave. Adicionar 0,5 ml das células tripsinizadas a uma placa de 10 cm de cultura de tecidos contendo 10 ml de meio de crescimento pré-aquecido.
    2. Agite ligeiramente os pratos várias vezes para a frente e para trás seguido por uma direção para a esquerda e para a direita. Evite rodar os pratosuma vez que pode resultar numa dispersão celular desigual.
    3. Colocar as cápsulas sobre uma superfície plana em uma incubadora a 37 ° C fornecido com 5% de CO 2. Superfícies inclinadas também podem resultar numa dispersão celular desigual.
    4. Troque a mídia de crescimento de um dia após o início da incubação.
    5. Monitorar as células e gravar no dia em que chegar a confluência. Isso levará cerca de uma semana para as células para alcançar confluência do dia eles estão divididos.
    6. Mudar o meio de crescimento, duas vezes por semana antes de as células atingirem confluência. Uma vez que as células atingiram a confluência, muda os meios de crescimento a cada dois dias. Depois que as células são 7-dias pós-confluentes, alterar a mídia de crescimento diário.
      Nota: As células estão prontas para experiências quando eles são de 13 dias pós-confluentes (Figura 1). Uma vez que as células acabará por se tornar menos eficaz na produção de lipoproteínas, utilização de células que se encontram entre 13 a 17 dias pós-confluentes 8. Vá para a etapa 3 sobre como conduzir o experimento.
  2. Usando o sistema de membrana permeável
    1. Semente as células Caco-2 no inserto membrana permeável tal como descrito no passo 1.1.1.1. acima. Evite o uso de células a partir de um frasco congelado porque o seu crescimento celular é normalmente mais lenta (período de recuperação). Resumidamente, adicionar 0,5 ml das células tripsinizadas para a câmara de apical (compartimento superior) que contém 10 ml de meio de crescimento pré-aquecido. Além disso, adicionar 10 ml de meio de crescimento pré-aquecido para a câmara basolateral (compartimento inferior).
      Nota: Para as melhores práticas, adicione os meios de crescimento para a câmara apical primeiro e depois para a câmara basolateral. Ao remover a velha mídia, remova a mídia basolateral perante a mídia apical. Evitar picar a membrana de policarbonato, uma vez que pode romper a membrana.
    2. Devido à visibilidade pobre célula através da membrana de policarbonato, semear as células Caco-2 em um prato de cultura de tecidos regular com densidade semelhante, e usar este prato para julgar a confluência celular.
    3. Siga sPTE 1.1.2-1.1.6 acima.

2. Gene Overexpression

  1. Usando a abordagem de transfecção regulares
    1. Semente as células Caco-2 em um prato de cultura de tecidos como descrito no 1.1.1.1.-1.1.4 supra.
      Nota: Quando as células são cerca de 40-50% confluentes, eles estão prontos para ser transfectada.
    2. Adicionar 67 ul de reagente de transfecção de 472 ul de meio de soro reduzido os num tubo de microcentrífuga. Evitar o contacto do reagente de transfecção não diluída com a parede do tubo.
    3. Adicionar 23 g de pLL3.7 reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) 9 para o reagente de transfecção / meio de soro reduzido mistura.
    4. Incubar a mistura durante 20 min à temperatura ambiente.
    5. Substituir o meio de crescimento das células Caco-2 'com 8 ml de 10% de FBS em meio DMEM.
    6. Adicionar a mistura de ADN / reagente de transfecção / meio de soro reduzido, gota a gota para o prato.
    7. Agite ligeiramente os pratos várias vezes em uma frente e badirecção ckward seguido por um sentido para a esquerda e para a direita.
    8. Coloque o prato no 37 ° C incubadora.
    9. Substitua a mídia no prato com 10 ml de meio de crescimento por dia após o início da incubação.
    10. Monitorar a expressão do gene.
      1. Monitorar a expressão de genes sem 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) coloração. Usando um microscópio de fluorescência, determinar a percentagem de células que são verdes. A percentagem representa a eficiência da transfecção.
      2. Monitorar a expressão gênica com coloração DAPI.
        1. Lavam-se as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) três vezes.
        2. Fixar as células por adição de 10 ml de formaldeído a 4% em PBS (10 minutos de incubação à TA).
        3. Lavam-se as células com PBS três vezes.
        4. Incubar as células no escuro durante 15 min à temperatura ambiente com 8 ml de PBS contendo 1: 500 DAPI, 1% de BSA, 0,01% de digitonina.
        5. Lavam-se as células com PBS três vezes.
        6. VCcante um microscópio de fluorescência, determinar o número de células que são verde / azul em relação àqueles que são azuis (Figura 2 painel superior). A percentagem calculada representa a eficiência da transfecção.
  2. Usando o sistema de sobre-expressão de lentivírus 10
    1. Rim embrionário (HEK) Semear as células em um humanos 293T 15 centímetros prato de cultura de tecidos (10% de FBS em DMEM como seu meio de crescimento).
      Nota: Quando as células são cerca de 60-70% confluentes, eles estão prontos para ser transfectada.
    2. Adicionar 162 ul de reagente de transfecção de 1133 ul de os meio de soro reduzido em um tubo de microcentrífuga de 11. Evitar o contacto do reagente de transfecção não diluída com a parede do tubo.
    3. Adicionar 24 g de pLL3.7 eGFP (ou outra construção), 15,6? G de elemento de resposta a Rev (RRE), 6,0 ug de REV, e 8,4? G de glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVG) para o reagente de transfecção / reduced mistura meio de soro.
    4. Incubar a mistura durante 20 min à temperatura ambiente.
    5. Substituir o meio de crescimento com 16 ml de 10% de FBS em DMEM.
    6. Adicionar a mistura de ADN / reagente de transfecção / meio de soro reduzido, gota a gota para o prato.
    7. Agite ligeiramente os pratos várias vezes para a frente e para trás seguido por uma direção para a esquerda e para a direita. É normal ver algumas das células HEK293T destacadas neste momento.
    8. Coloque o prato na incubadora.
    9. Após 24 horas de incubação, substituir a mídia no prato com 25 ml de meio de crescimento.
    10. No dia seguinte, recolher o meio de crescimento contendo o lentivírus (primeira coleção).
    11. Repita o passo 2.2.10 para coletar mais lentivírus (a segunda cobrança).
    12. Reúnem-se os primeiro e o segundo recolha, e remover os detritos celulares por centrifugação (2500 xg durante 5 min).
    13. Filtrar a coleção com um filtro descartável garrafa-top (0,45 poro), econcentra-se o vírus por centrifugação a recolha a 31.400 xg durante 2 horas à temperatura ambiente (rotor JA-20). Marcar a parte inferior do tubo de centrifugação em que o pelete é localizado. Decantar o sobrenadante, e deixar o tubo invertido à TA durante cerca de 15 min.
    14. Ressuspender o sedimento contendo vírus com 100 ul de PBS 1X. Evite bolhas.
    15. Armazenar o vírus concentrada a -80 ° C. Evite ciclos de congelamento e descongelamento.
    16. Determinar a quantidade óptima de vírus necessária para transduzir as células Caco-2 por meio de titulação. Para poupar custos, utilizar uma placa de 24 poços (0,3 ml de meio de crescimento / poço) em vez de um 10 centímetros prato de cultura de tecidos para a titulação.
      1. Adicionar quantidades crescentes do vírus concentrado (0, 1, 2, 5, 10, 25, e 50 uL / ​​poço) suplementado com polibreno (concentração final = 5 ug / ml) para a 40-70% confluentes células Caco-2. Agitar a placa de 24 poços como descrito em suavemente 1.1.2.
      2. Monitore sua expressão gênica (Passo 2.1.10.) (Figura 2 fundo4 painéis).
    17. Desde a expressão de transgene é geralmente sustentado, manter as células transduzidas para experiências futuras e monitorar continuamente a sua expressão gênica (Passo 2.1.10.).

3. Estimular o Lipoproteína Secreção

  1. Usando o prato de cultura de tecido normal
    1. Prepara-se uma mistura de lípidos de 100X através da mistura de 50 mg de ácido oleico, 40 mg de lecitina, e 48 mg de taurocolato de sódio. Levar o volume a 900 mL com PBS (o suficiente para pratos 8). Vortex vigorosamente a mistura de lípidos.
    2. Adicionar 900 ul da mistura de lípidos 100X em 89,1 ml de meio de crescimento. Misturar e filtrar a mídia contendo lípidos. As concentrações finais (1x) de ácido oleico, lecitina, e taurocolato de sódio é 2,0 mM, 1,36 mM e 1,0 mM, respectivamente.
    3. Adicionar 10 ml de meio contendo lípido para as células.
    4. Incubam-se as células com meio contendo o lípido durante 4 horas num 37° C incubadora.
    5. Lavam-se as células com PBS três vezes.
    6. Adicionam-se 10 ml do meio de crescimento para as células para recolher a secreção de lipoproteínas.
    7. Incubar durante 2 horas num banho a 37 ° C incubadora.
    8. Recolhe a mídia contendo lipoproteína.
  2. Usando o sistema de membrana permeável
    1. Siga os passos 3.1.1-3.1.2 para preparar a mistura de lípidos.
    2. Adicionar 10 ml de meio contendo lípido para a câmara de apical e 10 ml de meio de crescimento para a câmara basolateral.
    3. Incuba-se durante 4 horas numa incubadora de 37 ° C. Recolhe a mídia contendo lipoproteína na câmara basolateral.

4. Isolamento de lipoproteína (Figura 3)

  1. Remover os restos celulares do meio contendo lipoproteína por centrifugação (2000 xg durante 5 min).
  2. Decantar a mídia em um tubo de 50 ml.
  3. Adicionar 5,95 g de cloreto de sódio para a mídia.
  4. Se a sample serão analisados ​​pelo MET, adicionar um inibidor da protease de cocktail comprimido para manter a integridade das lipoproteínas.
  5. Levar o volume a 23 ml com água (1,2 g / ml de solução de NaCl a densidade).
  6. Dissolve-se os solutos completamente.
  7. Decantar a totalidade da solução para um tubo de ultracentrífuga policarbonato.
  8. Suavemente sobrepor a solução densidade 1,2 g / ml com 0,5 ml de água (1,0 g / ml de densidade).
  9. Equilibrar o tubo por peso e não por volume.
  10. Carregue suavemente os tubos no rotor T865.
  11. Rodar as amostras na ultracentrífuga a 429.460 xg durante 24 horas a 4 ° C.
  12. Isolar imediatamente o topo 0,5 ml de solução por pipetagem suave. Mantenha o tubo o mais imóvel possível.

5. Análise TEM

  1. Prepare 5 ml de ácido fosfotúngstico a 2% (w / v) e ajustar o pH a 6,0.
  2. Filtra-se o ácido fosfotúngstico a 2% com um filtro de seringa (tamanho de poro: 0,2 um).
  3. Gota de 20 ul da amostra em um prato de lipoproteína estéril.
  4. Gota de 20 ul de ácido fosfotúngstico a 2% filtrada ao lado da amostra no mesmo prato.
  5. Suavemente soltar uma grade EM com o lado maçante descansando na amostra.
  6. Incubar à temperatura ambiente durante 1 min.
  7. Bater levemente o lado da grade de EM num papel de filtro para remover a amostra da rede.
  8. Suavemente soltar a grade EM com o lado maçante descansando no ácido fosfotúngstico 2%.
  9. Incubar à temperatura ambiente durante 1 min.
  10. Bater levemente o lado da grade de EM num papel de filtro para remover o ácido fosfotúngstico a partir da rede.
  11. Usando uma ETM, capturar as imagens das lipoproteínas (Figura 4).

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Representative Results

Figura 1 apresenta normais de 13 dias pós-confluentes células Caco-2. O aparecimento de estruturas em forma de cúpula e gotículas lipídicas intracelulares são características diferenciadas de células Caco-2. Quando as células Caco-2 não são dispersos igualmente durante a sementeira, eles vão aglutinar-se e crescer demais em certas áreas do prato; e haverá algumas áreas no prato sem quaisquer células. Roda e colocando o prato numa superfície inclinada deve ser evitada. Também é importante notar que o pós-confluentes células Caco-2 são mais suscetíveis ao desapego ao novo meio de crescimento é adicionada às células demasiado aproximadamente. Portanto, os novos meios de comunicação deve ser acrescentado com cuidado para evitar desprendimento de células.

Com base nestes estudos, a eficiência de transfecção de células Caco-2 foi entre 30-60% (Figura 2 painéis de topo). Em contraste, a eficácia de transdução de células Caco-2, utilizando o sistema de expressão de lentivírus foi de aproximadamente 100% (Figura 2 A Figura 2 também mostraram que a quantidade óptima de lentivírus concentrado foi de 10 ul. Os transduzidas células Caco-2 foram mantidas até 12 passagens. Como mostrado, mesmo após 12 passagens as células transduzidas ainda expressa eGFP. A eficiência de transdução claramente depende da concentração lentivírus. A confirmação da eficiência de transfecção / transdução é crítica, e deverá ser realizada como uma análise preliminar de rotina antes das experiências reais. Embora a análise de Western blot pode ser utilizada para estimar a percentagem de aumento da expressão do gene, que não deve ser o método principal para determinar a eficiência de transfecção / transdução.

Usando o método de ultracentrifugação em gradiente de densidade de NaCl (Figura 3), as lipoproteínas secretadas pelas células Caco-2 foram isoladas e analisadas num MET. Alguns dos quilomicrons, lipoproteínas maior do que 80 nm de diâmetro, foram representados na Figura4. As lipoproteínas menores, VLDL, também estavam presentes. É essencial para confirmar o isolamento bem sucedido de ambos os quilomicrons e VLDLs sobre uma ETM. Como discutido anteriormente 8, análises bioquímicas não deve ser o principal método de confirmação. A ausência de lipoproteínas, especificamente quilomicrons, indica que o transporte de lípidos pelas células Caco-2 não é eficiente. Consequentemente, eles não vão servir como um bom modelo para estudar o transporte de lipídios. O número de partículas de quilomícrons relativamente ao número total de partículas de lipoproteínas podem ser contadas 8. Uma percentagem elevada indica transporte lipídico eficiente.

Figura 1
Figura 1. Representante micrografia de 13 dias pós-confluentes células Caco-2. Intracelular gotículas lipídicas são visíveis em algumas células (seta vermelha). As estruturas em forma de cúpula exclusivos (seta preta) formada por algumas células Caco-2 são geralmente presentes apenas após as células terem atingido a confluência. Ampliação = 100X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Comparação da eficácia de transfecção à base de lípidos e o sistema de expressão de lentivírus Painel superior:. Células Caco-2 foram transfectadas com eGFP pLL3.7 utilizando o reagente de transfeco n-lipossomal (Barra de escala = 20 um). Os painéis de fundo 4: células Caco-2 foram transduzidas com pLL3.7 eGFP utilizando o sistema de expressão de lentivírus com quantidades variáveis ​​(1, 2, 5, ou 10 ul) do lentivírus concentrado (LV). As células foram exibidos a partir da 12ª passagem das células originais transduzidas. Os painéis da esquerda mostram a coloração DAPI, o meio paNels mostram a fluorescência da GFP, e os painéis da direita mostram as imagens fundidas. O sistema de expressão lentivírus era, evidentemente, mais eficaz do que a transfecção à base de lípidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Isolamento de lipoproteínas intestinais utilizando NaCl a ultracentrifugação em gradiente de densidade. A densidade do meio contendo lipoproteína é ajustado a 1,2 g / ml, adicionando a quantidade adequada de NaCl. O volume da amostra também precisa de ser ajustada de modo a que ele vai encher todo o tubo de ultracentrífuga para evitar o colapso. Para obter um gradiente de densidade, de 0,5 ml de água é sobreposto suavemente sobre a g / ml de solução de densidade 1,2. A amostra é então centrifugada a 429.460 xg durante 24 horas usando um T865do rotor (equivalente a 2,15 unidades Svedberg). As lipoproteínas intestinais deve ser imediatamente recuperados por pipetagem suave. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. representativas micrografia electrónica das lipoproteínas produzidos pelas células Caco-2. As lipoproteínas isoladas por ultracentrifugação em gradiente de densidade de NaCl foram coradas negativamente com ácido fosfotúngstico a 2% (pH 6,0). Os quilomicrons, as partículas lipídicas maior do que 80 nm de diâmetro, e VLDLs, aqueles menor do que 80 nm, estão ambos presentes. Barra de escala = 100 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste artigo, os dois sistemas que podem ser utilizados para manter células Caco-2 são descritos, a saber, o prato de cultura de tecidos normal e a membrana permeável. Os benefícios de usar o sistema de membrana permeável incluem a separação do apical e basolateral os compartimentos, e a capacidade de incubar a mistura de lípidos e recolher a secreção de lipoproteínas simultaneamente. No entanto, as pastilhas de membranas permeáveis ​​são caros, e a sua membrana de policarbonato não permite uma boa visibilidade celular. Uma das vantagens deste modelo in vitro é que os estudos de manipulação genética vai ser mais económico e menos demorado. Para uma melhor eficácia, o sistema de expressão de lentivírus deve ser usado. Os transduzidas células Caco-2 manter geralmente a expressão do seu transgene.

A capacidade de células Caco-2 para produzir chylomicrons é de suma importância. Sem esta capacidade, células Caco-2 não seria capaz de efficiently transportar materiais lipofílicos, incluindo, mas não limitados a fármacos liphophilic, vitamina A, D, E e K e quaisquer nutrientes solúveis em lípidos. Os métodos adequados para desafiar células Caco-2 para produzir ambas as partículas de VLDL e de quilomicra são descritos. O isolamento bem sucedido destas partículas de lipoproteínas deve ser confirmada numa MET. Com base na literatura atual, este modelo Caco-2 oferece o transporte lipídico mais eficiente entre outras Caco-2 modelos 12-14. No entanto, o modelo cannulation linfa in vivo ainda transporta lípidos de forma mais eficiente do que qualquer modelo in vitro. As razões subjacentes foram recentemente discutidos 8, ou seja, porque células Caco-2 produzir duas isoformas diferentes de apolipoproteína B, células Caco-2 não pode sintetizar triglicéridos a partir de monoglicéridos, e a componente do soro crítica para quilomicron biogénese pode ser mais baixo no meio de crescimento . Também é importante compreender que a limitação de este emmodelo in vitro; este modelo in vitro exclui alguns potenciais fatores importantes, tais como a motilidade intestinal, anatomia do intestino, ea interacção com outros sistemas do órgão.

Os principais fatores que permitem que células Caco-2 para produzir de forma eficiente quilomícrons são o tipo / quantidade de lipídios utilizados e diferenciação celular 8. Sem a combinação apropriada destes factores, células Caco-2 não irá produzir um número significativo de quilomicrons 8. De nota, NaCl gradiente de densidade ultracentrifugação deve ser realizada corretamente. O isolamento de lipoproteínas depende do tempo (imediata, sem atraso significativo), boa amostra manipulação (resistente sem muita agitação), e pipetagem cuidadosa (recebendo apenas a camada superior). A técnica apropriada pode ser praticado usando lípidos pré-coradas para ajudar a visualização da camada de lipoproteína 8. Além MET, análises bioquímicas, ou seja, apolipoproteína B e triglicéridos análises, podem também ser used para confirmar o isolamento bem sucedido de lipoproteínas. Estas análises bioquímicas, o que temos previamente relatados 8, também pode servir como métodos em quantificar a absorção. No entanto, TEM ainda deve ser realizada devido à tendência das lipoproteínas de agregar dois, fazendo com que uma sobreavaliação potencial de produção de quilomicra.

Este modelo in vitro é particularmente útil para o estudo de absorção de gordura na dieta e a absorção intestinal de fármacos lipofílicos, vitaminas e outros nutrientes solúveis em lípidos. Ele também pode servir como um modelo para melhorar a má biodisponibilidade de fármacos lipofílicos orais. Uma vez que os materiais solúveis em lípidos são empacotados em quilomicra por enterócitos de transporte para a circulação, Caco-2 de células produtoras de quilomícrons será mais eficiente na absorção de fármacos lipofílicos. Além disso, este modelo permite que os investigadores a determinar o papel de um gene específico em absorção da droga pelo intestino (Farmacogenética). Também permite, eminvestiga- para comparar o efeito de vários gorduras alimentares na biodisponibilidade oral droga lipofílica. Todas estas aplicações têm sido discutidas anteriormente 6.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM VWR 16750-112 Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells
FBS Fisher 3600511 We do not heat inactivate our serum
Trypsin VWR 45000-660 Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment 
Permeable membrane system Fisher 7200173 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane
10 cm dish Fisher 08-772-E Tissue culture dish
15 cm dish Fisher 08-772-24 Tissue culture dish
24 well plate Fisher 12565163 Tissue culture plate
Lipid-based transfection reagent Fisher PRE2691 Can be substituted with other transfection reagent
Reduced serum media Invitrogen 11058021 For transfection
pLL3.7 eGFP Addgene 11795 https://www.addgene.org/11795/
Bottle-top filter Fisher 9761120 0.45 mm pore
Polybrene Fisher NC9840454 10 mg/ml
Oleic acid Sigma 01383-5G Prevent freeze-thaw cycle
Lecithin  Fisher IC10214625 Egg lecithin 
Sodium taurocholate Fisher NC9620276 Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956
Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) Fisher 5892791001 Used mainly for samples that need TEM analysis
Polycarbonate ultracentrifuge tube Fisher NC9696153 Reusing it multiple times will collapse the tube
Lid for ultracentrifuge tube Fisher NC9796914 A tool is required to remove the tube/lid from rotor
Syringe Fisher 50-949-261 Disposable
Syringe filter Fisher 09-719C Pore size = 0.2 mm; nylon
Phosphotungstic acid Fisher AC208310250 For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0
Tweezer Fisher 50-238-62 Extra fine and strong tips
Formvar/carbon grid Fisher 50-260-34 Formvar/carbon film square grid 400 Copper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Molecular Biology 102 Edição lipofílico insolúvel hidrofóbico droga intestino quilomícrons VLDL lipoproteina enterócito a linfa a absorção a secreção
Usando Caco-2 em células para estudo LIPID Transportes pelo intestino
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Nauli, A. M., Whittimore, J. D.… More

Nauli, A. M., Whittimore, J. D. Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine. J. Vis. Exp. (102), e53086, doi:10.3791/53086 (2015).

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