Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Utilisation de cellules Caco-2 à étudier Lipid Transport par l'intestin

Published: August 20, 2015 doi: 10.3791/53086
Automatic Translation
1, 2
1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University

Introduction

Des études sur l'absorption intestinale des graisses alimentaires, les médicaments et les vitamines et solubles dans les lipides peuvent être conduites in vivo en utilisant un modèle de la fistule lymphatique 1-4. Cependant, les techniques chirurgicales sont impliqués non seulement difficile, mais aussi coûteux. Bien que in vivo approches basées sur l'analyse des fèces peuvent être utilisés, ils sont principalement utilisés pour déterminer l'absorption pour cent par le tractus gastro-intestinal 2,5. Le modèle in vitro décrit dans le présent document est plus rentable, et les techniques impliquées sont sans doute moins difficile. Des études de modification génétique sont également plus économique et moins de temps lorsqu'ils sont effectuées en utilisant ce modèle in vitro.

Depuis matières solubles dans les lipides qui sont prises par les entérocytes sont emballés dans les lipoprotéines 6,7, l'efficacité de ce modèle in vitro pour produire des lipoprotéines est crucial. Les deux intestina principalel lipoprotéines sont chylomicrons et les lipoprotéines de très faible densité (VLDL). Les chylomicrons, lipoprotéines définies comme ayant 80 nm ou plus de diamètre, sont fabriqués strictement par l'intestin grêle quand lipides sont présents en abondance dans la lumière gastro-intestinale. Comme ils sont les plus grands lipoprotéines, chylomicrons sont vraisemblablement les transporteurs de lipides les plus efficaces. Ce modèle in vitro, qui est capable de produire des chylomicrons 8, peut être utilisé pour étudier l'absorption de graisse alimentaire, la vitamine liposoluble absorption par l'intestin, et la biodisponibilité orale du médicament lipophile. La présence de molécules solubles dans les lipides, des vitamines, des médicaments ou dans la fraction de lipoprotéine est un indicateur de leur absorption par l'intestin grêle. Comme indiqué précédemment, ce modèle peut être utilisé pour améliorer la biodisponibilité des médicaments par voie orale lipophile 6.

Ce document décrit comment cellules Caco-2 devraient être maintenus dans la membrane perméable ou plats réguliers de culture de tissus, la façon dont les mi lipidiquesxture pour stimuler la production de lipoprotéines doit être préparé, la façon dont le système d'expression de lentivirus peut être utilisé pour réaliser une surexpression efficace, et la façon dont les lipoprotéines isolées doit être analysé.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Maintien des cellules Caco-2

  1. Utilisation plats réguliers de culture tissulaire
    1. Décongeler les cellules Caco-2 à partir d'un flacon congelé en plaçant le flacon dans un bain d'eau à 37 °, et tout de suite les ajouter à une boîte de culture tissulaire de 10 cm contenant 10 ml de milieu de croissance (sérum bovin fœtal préchauffé à 15% (FBS ) dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)).
      1. Lorsque les cellules Caco-2 ont atteint 50-70% de confluence, les diviser 1: 6 par incubation des cellules avec 3 ml de 0,05% de trypsine / 0,53 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 37 ° C jusqu'à ce qu'ils soient détachés (15 min) . Pour éviter l'agglutination des cellules, mélanger les cellules à plusieurs reprises par pipetage doux. Ajouter 0,5 ml des cellules trypsinisées à une boîte de culture tissulaire de 10 cm contenant 10 ml de milieu de culture préchauffé.
    2. Secouer doucement les plats à plusieurs reprises dans une direction vers l'avant et vers l'arrière suivie d'une direction vers la gauche et vers la droite. Évitez les plats tourbillonnantcar il peut conduire à une dispersion de cellules inégales.
    3. Placez les plats sur une surface plane dans un incubateur à 37 ° de fourni avec 5% de CO 2. Des surfaces inclinées peuvent également résulter en une dispersion de cellules inégales.
    4. Modifiez les milieux de croissance d'une journée après le début de l'incubation.
    5. Surveiller les cellules et enregistrer le jour où ils atteignent la confluence. Il faudra environ 1 semaine pour que les cellules atteignent la confluence de la journée, ils sont divisés.
    6. Changer le milieu de croissance deux fois par semaine avant que les cellules atteignent la confluence. Une fois que les cellules ont atteint la confluence, modifier les milieux de croissance tous les autres jours. Après que les cellules sont 7-jours post-confluentes, changer le milieu de croissance quotidienne.
      Remarque: Les cellules sont prêtes pour les expériences quand ils sont 13 jours post-confluentes (figure 1). Puisque les cellules finiront par devenir moins efficace dans la production de lipoprotéines, utiliser des cellules qui sont entre 13 à 17 jours post-confluentes 8. Passez à l'étape 3 sur la façon de mener l'expérience.
  2. Utilisation du système de membrane perméable
    1. Ensemencer les cellules Caco-2 dans l'insert de membrane perméable tel que décrit à l'étape 1.1.1.1. ci-dessus. Évitez d'utiliser des cellules à partir d'un flacon congelé parce que leur croissance cellulaire est normalement plus lent (période de récupération). En bref, ajouter 0,5 ml des cellules trypsinisées à la chambre apicale (compartiment supérieur) contenant 10 ml de milieu de culture préchauffé. En outre, ajouter 10 ml de milieu de croissance préchauffé à la chambre basolatérale (compartiment inférieur).
      Remarque: Pour la meilleure pratique, ajouter les milieux de croissance à la chambre apicale d'abord, puis à la chambre basolatérale. Lorsque vous retirez les anciens médias, retirez le support basolatérale devant les médias apical. Évitez piquer la membrane de polycarbonate comme il peut rompre la membrane.
    2. En raison de la visibilité de la cellule pauvres à travers la membrane de polycarbonate, ensemencer les cellules Caco-2 dans un plat régulière de culture de tissu avec une densité similaire, et utiliser ce plat de juger de la confluence des cellules.
    3. Suivez steps 1.1.2-1.1.6 ci-dessus.

2. La surexpression Gene

  1. En utilisant l'approche régulière de transfection
    1. Ensemencer les cellules Caco-2 sur une boîte de culture de tissu comme décrit dans 1.1.1.1.-1.1.4 ci-dessus.
      Remarque: Lorsque les cellules sont environ 40-50% de confluence, ils sont prêts à être transfectées.
    2. Ajouter 67 ul du réactif de transfection de 472 ul du milieu de sérum réduit dans un tube de microcentrifugation. Eviter le contact du réactif de transfection non-dilué avec la paroi du tube.
    3. Ajouter 23 pg de pLL3.7 protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) 9 dans le réactif de transfection / réduit mélange des médias de sérum.
    4. Incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante.
    5. Remplacer le milieu de croissance des cellules Caco-2 avec 8 ml de 10% de FBS dans du DMEM.
    6. Ajouter le mélange / réactif de transfection d'ADN médias / réduite de sérum goutte à goutte à l'antenne.
    7. Secouer doucement les plats à plusieurs reprises dans un avant et backward direction suivie par une direction vers la gauche et vers la droite.
    8. Placer le plat dans le 37 ° C incubateur.
    9. Remplacez le support dans le plat avec 10 ml de milieu de croissance par jour après le début de l'incubation.
    10. Surveiller l'expression des gènes.
      1. Surveiller l'expression des gènes sans 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). En utilisant un microscope à fluorescence, déterminer le pour cent de cellules qui sont en vert. Le pourcentage représente l'efficacité de transfection.
      2. Surveiller l'expression génique avec DAPI.
        1. Laver les cellules avec une solution saline tamponnée phosphate (PBS) à trois reprises.
        2. Fixer les cellules par addition de 10 ml de formaldehyde à 4% dans du PBS (10 minutes d'incubation à la température ambiante).
        3. Laver les cellules avec du PBS à trois reprises.
        4. Incuber les cellules dans l'obscurité pendant 15 min à température ambiante avec 8 ml de PBS contenant 1 500: 1, DAPI% de BSA, 0,01% de digitonine.
        5. Laver les cellules avec du PBS à trois reprises.
        6. Uchanter un microscope à fluorescence, déterminer le nombre de cellules qui sont vert / bleu par rapport à ceux qui sont bleu (panneau supérieur Figure 2). Le pourcentage calculé représente l'efficacité de transfection.
  2. Utilisation du système de surexpression 10 lentivirus
    1. Seed humaines embryonnaires de rein (HEK), les cellules 293T dans une boîte de culture tissulaire de 15 cm (10% de FBS dans du DMEM que leur milieu de croissance).
      Remarque: Lorsque les cellules sont environ 60-70% de confluence, ils sont prêts à être transfectées.
    2. Ajouter 162 ul de réactif de transfection à 1133 ul de médias de sérum réduit dans un tube de microcentrifugeuse 11. Eviter le contact du réactif de transfection non-dilué avec la paroi du tube.
    3. Ajouter 24 pg de pLL3.7 eGFP (ou un autre produit d'assemblage), 15,6 ug de l'élément de réponse Rev (RRE), 6,0 ug de REV, et 8,4 pg du vésiculeuse glycoprotéine du virus de la stomatite (VSVG) dans le réactif de transfection / réduqué mélange des médias de sérum.
    4. Incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante.
    5. Remplacez le support de croissance avec 16 ml de 10% de FBS dans du DMEM.
    6. Ajouter le mélange / réactif de transfection d'ADN médias / réduite de sérum goutte à goutte à l'antenne.
    7. Secouer doucement les plats à plusieurs reprises dans une direction vers l'avant et vers l'arrière suivie d'une direction vers la gauche et vers la droite. Il est normal de voir quelques-unes des cellules HEK293T détachés à ce point.
    8. Placer le plat dans l'incubateur.
    9. Après 24 heures d'incubation, remplacez les médias dans le plat avec 25 ml de milieu de croissance.
    10. Le lendemain, recueillir le milieu de croissance contenant le lentivirus (première collecte).
    11. Répétez l'étape 2.2.10 de recueillir plus de lentivirus (la deuxième collecte).
    12. Mutualiser la première et la deuxième collection, et enlever les débris cellulaires par centrifugation (2500 g pendant 5 min).
    13. Filtrer la collection avec un filtre sur flacon jetable (0,45 um pores), etconcentrer le virus par centrifugation la collection à 31 400 g pendant 2 heures à température ambiante (JA-20 rotor). Marquer le fond du tube de centrifugation où la pastille se trouve. Décanter le surnageant, et de laisser le tube inversé à température ambiante pendant environ 15 min.
    14. Remettre en suspension le culot contenant le virus avec 100 ul de PBS 1X. Éviter les bulles.
    15. Stocker le virus concentrée à -80 ° C. Éviter les cycles de gel-dégel.
    16. Déterminer la quantité optimale de virus nécessaire pour transduire les cellules Caco-2 par titrage. Pour réduire les coûts, utiliser une plaque de 24 puits (0,3 ml de milieu de croissance / puits) à la place d'une boîte de 10 cm de culture de tissus pour le titrage.
      1. Ajouter des quantités croissantes du virus concentré (0, 1, 2, 5, 10, 25, et 50 ul / puits) additionné de polybrène (concentration finale = 5 pg / ml) à 40-70% de la confluence des cellules Caco-2. Agiter la plaque de 24 puits doucement comme décrit dans 1.1.2.
      2. Surveiller l'expression de gène (étape 2.1.10.) (Figure 2 bas4 panneaux).
    17. Étant donné que l'expression de transgène est généralement soutenue, maintenir les cellules transduites pour des expériences futures et surveiller en permanence leur expression des gènes (étape 1.2.10.).

3. Stimuler la sécrétion des lipoprotéines

  1. Utilisation de la boîte de culture de tissu régulière
    1. Préparer un mélange lipidique par mélange 100X 50 mg d'acide oléique, 40 mg de lécithine et 48 mg de taurocholate de sodium. Porter le volume à 900 pl avec du PBS (suffisant pour 8 plats). Vortexer le mélange lipidique vigoureusement.
    2. Ajouter 900 ul du mélange lipidique 100X dans 89,1 ml de milieu de croissance. Mélanger et filtrer les médias contenant des lipides. Les concentrations finales (1 x) d'acide oléique, la lécithine, et le taurocholate de sodium sont de 2,0 mM, 1,36 mM et 1,0 mM, respectivement.
    3. Ajouter 10 ml d'un milieu contenant le lipide aux cellules.
    4. Incuber les cellules avec le support contenant des lipides pendant 4 heures dans un 37° C incubateur.
    5. Laver les cellules avec du PBS à trois reprises.
    6. Ajouter 10 ml de milieu de croissance pour les cellules afin de recueillir la sécrétion des lipoprotéines.
    7. Incuber pendant 2 heures dans un incubateur à 37 ° C.
    8. Recueillir les médias contenant des lipoprotéines.
  2. Utilisation du système de membrane perméable
    1. Suivre les étapes 3.1.1-3.1.2 pour préparer le mélange de lipides.
    2. Ajouter 10 ml d'un milieu contenant le lipide à la chambre apicale et 10 ml du milieu de culture à la chambre basolatérale.
    3. Incuber pendant 4 heures dans un incubateur à 37 ° C. Recueillir les médias contenant des lipoprotéines dans la chambre basolatérale.

4. Isolement des lipoprotéines (Figure 3)

  1. Retirer les débris cellulaires à partir du support contenant des lipoprotéines par centrifugation (2000 xg pendant 5 min).
  2. Décanter les médias dans un tube de 50 ml.
  3. Ajouter 5,95 g de chlorure de sodium pour les médias.
  4. Si le SAmple sera analysée par le TEM, ajouter une protéase tablette de cocktail inhibiteur de maintenir l'intégrité des lipoprotéines.
  5. Porter le volume à 23 ml avec de l'eau (1,2 g / ml de solution de NaCl densité).
  6. Dissoudre les solutés complètement.
  7. Décanter la totalité de la solution dans un tube d'ultracentrifugation polycarbonate.
  8. Superposer délicatement la solution de densité de 1,2 g / ml avec 0,5 ml d'eau (1,0 g / ml densité).
  9. Équilibrer le tube en poids et pas en volume.
  10. Charger doucement les tubes dans le rotor de T865.
  11. Faites tourner les échantillons dans l'ultracentrifugation à 429 460 g pendant 24 heures à 4 ° C.
  12. Immédiatement isoler le top 0,5 ml de solution par pipetage doux. Garder le tube aussi immobile que possible.

5. Analyse TEM

  1. Préparer 5 ml d'acide phosphotungstique 2% (p / v) et ajuster le pH à 6,0.
  2. Filtrer l'acide phosphotungstique à 2% d'un filtre à seringue (taille des pores: 0,2 um).
  3. Déposer 20 ul de l'échantillon de lipoprotéine sur un plat stérile.
  4. Déposer 20 ul de l'acide phosphotungstique à 2% filtrée à côté de l'échantillon sur le même plat.
  5. Laissez tomber doucement une grille d'EM avec le côté mat reposant sur l'échantillon.
  6. Incuber à température ambiante pendant 1 min.
  7. Tapoter doucement le côté de la grille EM sur un papier filtre pour retirer l'échantillon de la grille.
  8. Laissez tomber doucement la grille de EM avec le côté mat reposant sur l'acide phosphotungstique à 2%.
  9. Incuber à température ambiante pendant 1 min.
  10. Tapoter doucement le côté de la grille EM sur un papier filtre pour éliminer l'acide phosphotungstique de la grille.
  11. Utilisation d'un TEM, capturer les images des lipoprotéines (figure 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1 affiche post-confluentes cellules Caco-2 normales de 13 jours. L'apparition de structures en forme de dôme et des gouttelettes lipidiques intracellulaires sont caractéristiques de Caco-2 différenciées des cellules. Lorsque les cellules Caco-2 ne sont pas dispersés aussi pendant les semis, ils vont agglutiner et proliférer dans certaines zones du plat; et il y aura quelques zones dans le plat sans cellules. Tourbillonnement et en plaçant le plat sur une surface inclinée doit être évitée. Il est également important de noter que post-confluentes cellules Caco-2 sont plus sensibles au détachement lorsqu'un nouveau média de croissance est ajouté aux cellules trop rudement. Par conséquent, les nouveaux médias devraient être ajoutés doucement pour éviter le détachement des cellules.

Sur la base de ces études, l'efficacité de transfection de cellules Caco-2 est comprise entre 30 à 60% (Figure 2 panneaux supérieurs). En revanche, l'efficacité de transduction des cellules Caco-2 en utilisant le système d'expression de lentivirus a été d'environ 100% (Figure 2 La figure 2 montre également que la quantité optimale de lentivirus concentré était de 10 ul. Les cellules Caco-2 ont été maintenues transduites jusqu'à 12 passages. Comme le montre, même après 12 passages les cellules transduites ont exprimé encore eGFP. L'efficacité de transduction dépend évidemment de la concentration de lentivirus. La confirmation de l'efficacité de transfection / transduction est critique et doit être effectuée comme une analyse préliminaire de routine avant les expériences réelles. Bien que l'analyse par transfert de Western peut être utilisée pour estimer l'augmentation de pour cent de l'expression génique, il ne devrait pas être la principale méthode pour déterminer l'efficacité de transfection / transduction.

En utilisant le procédé d'ultracentrifugation à gradient de densité de NaCl (Figure 3), les lipoprotéines sécrétées par les cellules Caco-2 ont été isolés et analysés sur un TEM. Certains des chylomicrons, les lipoprotéines supérieure à 80 nm de diamètre, ont été représentés sur la figure4. Les petites lipoprotéines, VLDL, étaient également présents. Il est essentiel de confirmer l'isolement réussi de deux chylomicrons et VLDL sur un TEM. Tel que discuté précédemment 8, analyse biochimique ne devrait pas être la principale méthode de confirmation. L'absence de lipoprotéines, notamment les chylomicrons, indique que le transport des lipides par les cellules Caco-2 est pas efficace. Par conséquent, ils ne seront pas servir comme un bon modèle pour étudier le transport des lipides. Le nombre de particules de chylomicrons par rapport au nombre total de particules de lipoprotéines peut être compté huit. Un pourcentage élevé indique un transport efficace des lipides.

Figure 1
Figure 1. micrographie représentant de 13 jours post-confluentes cellules Caco-2. Intracellulaire gouttelettes lipidiques sont visibles dans certaines cellules (flèche rouge). Les structures en forme de dôme uniques (flèche noire) foconfirmé par des cellules Caco-2 sont généralement présents seulement après que les cellules ont atteint la confluence. Agrandissement = 100X. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Comparaison de l'efficacité de la transfection à base de lipides et le système d'expression lentivirus supérieur: Panneau. Cellules Caco-2 ont été transfectées avec pLL3.7 eGFP en utilisant le réactif de transfection non liposomale (barre d'échelle = 20 um). Panneaux de fond 4: cellules Caco-2 ont été transduites avec pLL3.7 eGFP en utilisant le système d'expression de lentivirus avec des quantités variables (1, 2, 5, ou 10 ul) du concentré lentivirus (LV). Les cellules étaient affichés à partir de la 12 ème passage des cellules transduites originaux. Les panneaux de gauche montrent la coloration DAPI, la pa milieuNels montrent la fluorescence de la GFP, et les panneaux de droite montrent les images fusionnées. Le système d'expression lentivirus était évidemment plus efficace que la transfection à base de lipides. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Isolement des lipoprotéines intestinales en utilisant NaCl ultracentrifugation en gradient de densité. La densité des milieux contenant la lipoprotéine-est ajusté à 1,2 g / ml par addition de la quantité appropriée de NaCl. Le volume de l'échantillon doit également être ajusté afin qu'il remplira la totalité du tube d'ultracentrifugation pour éviter l'effondrement. Pour obtenir un gradient de densité, 0,5 ml d'eau est superposé sur la doucement g / ml de solution 1,2 de densité. L'échantillon est ensuite centrifugé à 429 460 xg pendant 24 heures en utilisant un T865rotor (équivalente à 2,15 unités Svedberg). Les lipoprotéines intestinales devraient être immédiatement récupérés par pipetage doux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. micrographie électronique représentant des lipoprotéines produits par les cellules Caco-2. Les lipoprotéines isolées par gradient de densité de NaCl ultracentrifugation ont été colorées négativement avec 2% d'acide phosphotungstique (pH 6,0). Les chylomicrons, des particules lipidiques supérieure à 80 nm de diamètre, et VLDL, plus petites que celles 80 nm, sont tous deux présents. Barre d'échelle = 100 nm. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dans ce document, les deux systèmes qui peuvent être utilisés pour maintenir les cellules Caco-2 sont décrits, à savoir, la boîte de culture de tissu normal et la membrane perméable. Les avantages de l'utilisation du système de membrane perméable comprend la séparation de la apical et basolatéral des compartiments, et la capacité à incuber le mélange de lipides et de recueillir la sécrétion des lipoprotéines en même temps. Cependant, les inserts de membrane perméable sont chers, et leur membrane en polycarbonate ne permet pas une bonne visibilité de la cellule. L'un des avantages de ce modèle in vitro est que les études de manipulation génétique seront plus économique et moins de temps. Pour une meilleure efficacité, le système d'expression doit être utilisé lentivirus. Les cellules Caco-2 transduites conservent généralement l'expression de leur transgène.

La capacité des cellules Caco-2 pour produire chylomicrons est d'une importance primordiale. Sans cette capacité, cellules Caco-2 ne seraient pas en mesure de EFFICIEntly transporter des matériaux lipophiles, y compris, mais sans s'y limiter, les médicaments lipophiles, vitamine A, D, E et K, et les éléments nutritifs solubles dans les lipides. Les méthodes appropriées pour contester cellules Caco-2 pour produire les deux particules VLDL et chylomicrons sont décrits. L'isolement réussi de ces particules de lipoprotéines doit être confirmé sur un TEM. Basé sur la littérature actuelle, ce modèle Caco-2 offre le transport des lipides la plus efficace parmi d'autres Caco-2 modèles 12 - 14. Toutefois, le modèle de cathétérisme lymphatique in vivo transporte encore lipides plus efficacement que n'importe quel modèle in vitro. Les raisons qui sous-tendent ont récemment été discuté 8, notamment parce cellules Caco-2 produisent deux isoformes différentes de l'apolipoprotéine B, cellules Caco-2 ne peuvent pas synthétiser les triglycérides de monoglycérides, et le composant de sérum critique pour chylomicrons biogenèse peuvent être plus faibles dans le milieu de croissance . Il est également important de réaliser la limitation de la présente enmodèle in vitro; ce modèle in vitro exclut certains facteurs importants potentiels, tels que la motilité intestinale, l'anatomie de l'intestin, et l'interaction avec d'autres systèmes d'organes.

Les principaux facteurs qui permettent aux cellules Caco-2 pour produire des chylomicrons sont efficacement le type / quantité de lipides utilisés et la différenciation cellulaire 8. Sans la bonne combinaison de ces facteurs, cellules Caco-2 ne seront pas produire un nombre important de chylomicrons 8. Fait à noter, NaCl gradient de densité ultracentrifugation devrait être effectué correctement. L'isolement des lipoprotéines succès dépend du moment (immédiate et sans retard significatif), de la bonne manipulation des échantillons (solide, sans beaucoup d'agitation), et pipetage attention (obtenir seule la couche supérieure). Une bonne technique peut être pratiquée à l'aide de lipides pré-tachée pour aider à visualiser la couche de lipoprotéines 8. Outre TEM, analyses biochimiques, à savoir, d'apolipoprotéine B et de triglycérides analyses, peuvent également être used pour confirmer l'isolement succès des lipoprotéines. Ces analyses biochimiques, dont nous avons déjà signalés 8, peuvent également servir de méthodes de quantification de l'absorption. Cependant, TEM doit encore être réalisée en raison de la tendance des lipoprotéines de regrouper deux, ce qui provoque une surestimation potentiel de production de chylomicrons.

Ce modèle in vitro est particulièrement utile pour l'étude de l'absorption de graisses alimentaires et l'absorption intestinale de médicaments lipophiles, les vitamines et autres éléments nutritifs solubles dans les lipides. Il peut également servir de modèle pour améliorer une faible biodisponibilité des médicaments lipophiles orales. Etant donné que les matières solubles dans les lipides sont emballés dans des chylomicrons par les entérocytes pour le transport de la circulation, les cellules Caco-2 de chylomicrons production sera plus efficace dans l'absorption des médicaments lipophiles. En outre, ce modèle permet aux enquêteurs de déterminer le rôle d'un gène spécifique dans l'absorption du médicament par l'intestin (pharmacogénétique). Il permet également àinvestigateurs de comparer l'effet de différentes graisses alimentaires sur la biodisponibilité orale lipophile de drogue. Toutes ces applications ont été discutés précédemment 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM VWR 16750-112 Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells
FBS Fisher 3600511 We do not heat inactivate our serum
Trypsin VWR 45000-660 Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment 
Permeable membrane system Fisher 7200173 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane
10 cm dish Fisher 08-772-E Tissue culture dish
15 cm dish Fisher 08-772-24 Tissue culture dish
24 well plate Fisher 12565163 Tissue culture plate
Lipid-based transfection reagent Fisher PRE2691 Can be substituted with other transfection reagent
Reduced serum media Invitrogen 11058021 For transfection
pLL3.7 eGFP Addgene 11795 https://www.addgene.org/11795/
Bottle-top filter Fisher 9761120 0.45 mm pore
Polybrene Fisher NC9840454 10 mg/ml
Oleic acid Sigma 01383-5G Prevent freeze-thaw cycle
Lecithin  Fisher IC10214625 Egg lecithin 
Sodium taurocholate Fisher NC9620276 Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956
Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) Fisher 5892791001 Used mainly for samples that need TEM analysis
Polycarbonate ultracentrifuge tube Fisher NC9696153 Reusing it multiple times will collapse the tube
Lid for ultracentrifuge tube Fisher NC9796914 A tool is required to remove the tube/lid from rotor
Syringe Fisher 50-949-261 Disposable
Syringe filter Fisher 09-719C Pore size = 0.2 mm; nylon
Phosphotungstic acid Fisher AC208310250 For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0
Tweezer Fisher 50-238-62 Extra fine and strong tips
Formvar/carbon grid Fisher 50-260-34 Formvar/carbon film square grid 400 Copper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
  2. Nauli, A. M., et al. CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine. Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).
  3. Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).
  4. Lo, C. -M., et al. Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).
  5. Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption. Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).
  6. Nauli, A. M., Nauli, S. M. Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability. Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).
  7. Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein. Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).
  8. Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiol Rep. 2 (6), (2014).
  9. Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).
  10. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  11. Pottekat, A., et al. Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release. Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).
  12. Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells. Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).
  13. Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).
  14. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).

Tags

Biologie Moléculaire Numéro 102 lipophile insoluble hydrophobe la drogue l'intestin chylomicrons VLDL les lipoprotéines entérocytes la lymphe l'absorption la sécrétion
Utilisation de cellules Caco-2 à étudier Lipid Transport par l'intestin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nauli, A. M., Whittimore, J. D.… More

Nauli, A. M., Whittimore, J. D. Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine. J. Vis. Exp. (102), e53086, doi:10.3791/53086 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter