Introduction
4 - आहार वसा, और लिपिड में घुलनशील दवाओं और विटामिन के अवशोषण आंतों के अध्ययन के लिए एक लिम्फ नालव्रण मॉडल 1 का उपयोग करके विवो में आयोजित किया जा सकता है। हालांकि, इसमें शामिल शल्य चिकित्सा तकनीक ही चुनौतीपूर्ण है, लेकिन यह भी महंगा नहीं कर रहे हैं। इन विवो उपयोग किया जा सकता मल विश्लेषण पर आधारित दृष्टिकोण है, वे जठरांत्र पथ 2,5 द्वारा प्रतिशत तेज निर्धारित करने के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं। इस पत्र में वर्णित इन विट्रो मॉडल और अधिक लागत प्रभावी है, और शामिल तकनीकों यकीनन कम चुनौती दे रहे हैं। आनुवंशिक संशोधन अध्ययनों से यह भी समय लेने वाली है कि वे इस के लिए इन विट्रो मॉडल का उपयोग किया जाता है जब अधिक किफायती और कम कर रहे हैं।
Enterocytes द्वारा लिया जाता है कि लिपिड में घुलनशील सामग्री लिपो प्रोटीन 6,7 में पैक कर रहे हैं, लिपो प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए इस में इन विट्रो मॉडल की प्रभावशीलता के लिए महत्वपूर्ण है। दो मुख्य intestinaएल लिपो प्रोटीन chylomicrons और बहुत कम घनत्व लिपो प्रोटीन (वीएलडीएल) कर रहे हैं। लिपिड जठरांत्र लुमेन में बहुतायत से मौजूद हैं, जब व्यास में 80 एनएम या अधिक के साथ लिपो प्रोटीन के रूप में परिभाषित Chylomicrons, छोटी आंत से सख्ती से उत्पादित कर रहे हैं। वे सबसे बड़ी लिपो प्रोटीन होते हैं, chylomicrons क़यास सबसे कुशल लिपिड ट्रांसपोर्टरों हैं। Chylomicrons 8 उत्पादन में सक्षम है जो इस में इन विट्रो मॉडल, आहार वसा अवशोषण, पेट से लिपिड में घुलनशील विटामिन अवशोषण, और मौखिक lipophilic दवा जैव उपलब्धता अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। लिपोप्रोटीन अंश में लिपिड में घुलनशील अणु, विटामिन, या दवाओं की उपस्थिति छोटी आंत से उनके अवशोषण का सूचक है। पहले चर्चा की, इस मॉडल मौखिक lipophilic दवा जैव उपलब्धता 6 में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
इस पत्र में Caco-2 कोशिकाओं पारगम्य झिल्ली या नियमित रूप से टिशू कल्चर व्यंजन, कैसे लिपिड मील में बनाए रखा जाना चाहिए बताता है कि कैसेलिपोप्रोटीन उत्पादन प्रेरक के लिए xture lentivirus अभिव्यक्ति प्रणाली प्रभावी overexpression प्राप्त करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, कैसे तैयार किया जाना चाहिए, और अलग लिपोप्रोटीन कैसे विश्लेषण किया जाना चाहिए।
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Protocol
Caco-2 कोशिकाओं 1. रखरखाव
- नियमित रूप से टिशू कल्चर व्यंजन का प्रयोग
- (एफ बी एस एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी रखकर एक जमे हुए शीशी से Caco-2 कोशिकाओं पिघलना, और तुरंत पूर्व गर्म विकास मीडिया (15% भ्रूण गोजातीय सीरम के 10 मिलीग्राम से युक्त एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान के लिए उन्हें जोड़ने ) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM)) में।
- Caco-2 कोशिकाओं 50-70% संगम तक पहुँच चुके हैं, उन्हें 1 विभाजित: वे अलग कर रहे हैं जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% trypsin / 0.53 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं incubating द्वारा 6 (15 मिनट) । , सेल clumping से बचने के कोमल pipetting द्वारा कोशिकाओं को कई बार मिश्रण करने के लिए। पूर्व गर्म विकास मीडिया के 10 मिलीग्राम से युक्त एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान trypsinized कोशिकाओं के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
- धीरे से एक बाई ओर और दाहिनी ओर दिशा के बाद आगे और पीछे की दिशा में बर्तन कई बार हिला। व्यंजन घूमता से बचेंके रूप में यह एक असमान सेल फैलाव में हो सकता है।
- 5% सीओ 2 के साथ आपूर्ति की एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक सपाट सतह पर बर्तन रखें। Slanted सतहों भी एक असमान सेल फैलाव में हो सकता है।
- ऊष्मायन शुरू करने के बाद विकास मीडिया के एक दिन बदलें।
- कोशिकाओं को मॉनिटर और वे संगम तक पहुँचने दिन रिकॉर्ड है। कोशिकाओं वे विभाजित कर रहे हैं जिस दिन से संगम तक पहुँचने के लिए लगभग 1 सप्ताह का समय लगेगा।
- कोशिकाओं संगम तक पहुँचने से पहले दो बार एक सप्ताह के विकास मीडिया बदलें। कोशिकाओं संगम तक पहुँच चुके हैं एक बार, हर दूसरे दिन वृद्धि मीडिया बदल जाते हैं। कोशिकाओं को 7 दिनों के बाद मिला हुआ हैं, के बाद दैनिक विकास मीडिया बदल जाते हैं।
नोट: वे 13 दिनों के बाद मिला हुआ (चित्रा 1) कर रहे हैं जब कोशिकाओं के प्रयोगों के लिए तैयार हैं। कोशिकाओं अंततः लिपो प्रोटीन के उत्पादन में कम प्रभावी हो जाएगा, 8 के बाद मिला हुआ 13-17 दिनों के बीच हैं कि कोशिकाओं का उपयोग करें। प्रयोग आचरण करने के तरीके पर 3 चरण पर जाएँ।
- (एफ बी एस एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी रखकर एक जमे हुए शीशी से Caco-2 कोशिकाओं पिघलना, और तुरंत पूर्व गर्म विकास मीडिया (15% भ्रूण गोजातीय सीरम के 10 मिलीग्राम से युक्त एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान के लिए उन्हें जोड़ने ) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM)) में।
- पारगम्य झिल्ली प्रणाली का प्रयोग
- कदम 1.1.1.1 में वर्णित के रूप में पारगम्य झिल्ली डालने में Caco-2 कोशिकाओं बीज। ऊपर दिए गए। उनके सेल के विकास (वसूली की अवधि) सामान्य रूप से धीमी है क्योंकि एक जमे हुए शीशी से कोशिकाओं का उपयोग करने से बचें। संक्षेप में, पूर्व गर्म विकास मीडिया के 10 एमएल में शामिल है कि शिखर कक्ष (ऊपरी डिब्बे) को trypsinized कोशिकाओं के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। इसके अलावा, basolateral कक्ष (कम डिब्बे) के पूर्व गर्म विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
नोट: सबसे अच्छा अभ्यास के लिए, basolateral चैम्बर के लिए पहली और फिर शिखर चैम्बर के लिए विकास मीडिया जोड़ें। पुराने मीडिया को हटाने, जब शिखर मीडिया के सामने basolateral मीडिया को हटा दें। यह झिल्ली टूटना हो सकता है के रूप में पॉली कार्बोनेट झिल्ली poking से बचें। - कारण पॉली कार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से गरीब सेल दृश्यता के लिए, इसी तरह के घनत्व के साथ एक नियमित रूप से टिशू कल्चर पकवान में Caco-2 कोशिकाओं बीज, और सेल संगम न्याय करने के लिए इस पकवान का उपयोग करें।
- एस का पालन करेंteps 1.1.2-1.1.6 से ऊपर।
- कदम 1.1.1.1 में वर्णित के रूप में पारगम्य झिल्ली डालने में Caco-2 कोशिकाओं बीज। ऊपर दिए गए। उनके सेल के विकास (वसूली की अवधि) सामान्य रूप से धीमी है क्योंकि एक जमे हुए शीशी से कोशिकाओं का उपयोग करने से बचें। संक्षेप में, पूर्व गर्म विकास मीडिया के 10 एमएल में शामिल है कि शिखर कक्ष (ऊपरी डिब्बे) को trypsinized कोशिकाओं के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। इसके अलावा, basolateral कक्ष (कम डिब्बे) के पूर्व गर्म विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
2. जीन overexpression
- नियमित अभिकर्मक दृष्टिकोण का प्रयोग
- इसके बाद के संस्करण 1.1.1.1.-1.1.4 में वर्णित के रूप में एक टिशू कल्चर पकवान पर Caco-2 कोशिकाओं बीज।
नोट: कोशिकाओं के बारे में 40-50% मिला हुआ हैं, वे ट्रांसफ़ेक्ट होने के लिए तैयार कर रहे हैं। - एक microcentrifuge ट्यूब में कम सीरम मीडिया के 472 μl अभिकर्मक अभिकर्मक के 67 μl जोड़ें। ट्यूब की दीवार के साथ undiluted अभिकर्मक अभिकर्मक के संपर्क से बचें।
- PLL3.7 के 23 माइक्रोग्राम अभिकर्मक अभिकर्मक / कम सीरम मीडिया मिश्रण में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) 9 बढ़ाया जोड़ें।
- आरटी पर 20 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं।
- DMEM में 10% FBS की 8 मिलीलीटर के साथ Caco -2 'कोशिकाओं की वृद्धि मीडिया की जगह।
- बूंद-वार डिश के लिए डीएनए / अभिकर्मक अभिकर्मक / कम सीरम मीडिया मिश्रण जोड़ें।
- धीरे से एक आगे और बीए में बर्तन में कई बार मिलानेएक बाई ओर और दाहिनी ओर दिशा द्वारा पीछा ckward दिशा।
- 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पकवान रखें।
- ऊष्मायन शुरू करने के बाद विकास मीडिया के 10 एमएल के एक दिन के साथ पकवान में मीडिया की जगह।
- जीन अभिव्यक्ति की निगरानी करें।
- '4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) धुंधला बिना जीन अभिव्यक्ति की निगरानी करें। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, हरा कर रहे हैं कि कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करते हैं। प्रतिशत अभिकर्मक दक्षता का प्रतिनिधित्व करता है।
- DAPI धुंधला के साथ जीन अभिव्यक्ति की निगरानी करें।
- फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) तीन बार के साथ कोशिकाओं को धो लें।
- पीबीएस (आरटी पर 10 मिनट ऊष्मायन) में 4% formaldehyde के 10 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें।
- पीबीएस तीन बार के साथ कोशिकाओं को धो लें।
- 500 DAPI, 1% बीएसए, 0.01% digitonin: 1 युक्त पीबीएस के 8 मिलीलीटर के साथ आरटी पर 15 मिनट के लिए अंधेरे में कोशिकाओं को सेते हैं।
- पीबीएस तीन बार के साथ कोशिकाओं को धो लें।
- यूएक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन गाना नीला (चित्रा 2 शीर्ष पैनल) कर रहे हैं कि उन लोगों के लिए हरी / नीले रिश्तेदार हैं कि कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं। परिकलित प्रतिशत अभिकर्मक दक्षता का प्रतिनिधित्व करता है।
- इसके बाद के संस्करण 1.1.1.1.-1.1.4 में वर्णित के रूप में एक टिशू कल्चर पकवान पर Caco-2 कोशिकाओं बीज।
- Lentivirus के overexpression प्रणाली 10 का उपयोग
- एक 15 सेमी टिशू कल्चर पकवान में बीज मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T कोशिकाओं (DMEM में 10% FBS के उनके विकास मीडिया के रूप में)।
नोट: कोशिकाओं के बारे में 60-70% मिला हुआ हैं, वे ट्रांसफ़ेक्ट होने के लिए तैयार कर रहे हैं। - एक microcentrifuge ट्यूब 11 में कम सीरम मीडिया के 1,133 μl अभिकर्मक अभिकर्मक के 162 μl जोड़ें। ट्यूब की दीवार के साथ undiluted अभिकर्मक अभिकर्मक के संपर्क से बचें।
- जोड़ें 24 pLL3.7 EGFP (या किसी अन्य निर्माण) के माइक्रोग्राम, 15.6 रेव प्रतिक्रिया तत्व की माइक्रोग्राम (आरआरई), रेव की 6.0 माइक्रोग्राम, और अभिकर्मक अभिकर्मक / आर में vesicular मुखशोथ वायरस ग्लाइकोप्रोटीन के 8.4 माइक्रोग्राम (VSVG)educed सीरम मीडिया मिश्रण।
- आरटी पर 20 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं।
- DMEM में 10% FBS की 16 मिलीलीटर के साथ विकास मीडिया बदलें।
- बूंद-वार डिश के लिए डीएनए / अभिकर्मक अभिकर्मक / कम सीरम मीडिया मिश्रण जोड़ें।
- धीरे से एक बाई ओर और दाहिनी ओर दिशा के बाद आगे और पीछे की दिशा में बर्तन कई बार हिला। यह इस बात पर अलग HEK293T कोशिकाओं में से कुछ देखने के लिए सामान्य है।
- इनक्यूबेटर में पकवान रखें।
- ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, विकास मीडिया के 25 एमएल के साथ पकवान में मीडिया की जगह।
- अगले दिन, lentivirus (पहला संग्रह) युक्त विकास मीडिया इकट्ठा।
- दोहराएँ चरण 2.2.10 अधिक lentivirus (दूसरा संग्रह) लेने के लिए।
- (5 मिनट के लिए 2500 XG) पहले और दूसरे संग्रह पूल, और centrifugation द्वारा सेल मलबे को हटा दें।
- एक डिस्पोजेबल बोतल टॉप फिल्टर (0.45 माइक्रोन ताकना) के साथ संग्रह फिल्टर, औरआर टी (जावेद-20 रोटर) में 2 घंटे के लिए 31,400 XG पर संग्रह centrifuging द्वारा वायरस ध्यान केंद्रित। गोली जहां स्थित है अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे चिह्नित करें। सतह पर तैरनेवाला छानना, और लगभग 15 मिनट के लिए आरटी पर उल्टे ट्यूब छोड़ दें।
- 1X पीबीएस के 100 μl के साथ वायरस युक्त गोली Resuspend। बुलबुले से बचें।
- -80 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित वायरस स्टोर। फ्रीज पिघलना चक्र से बचें।
- अनुमापन द्वारा Caco-2 कोशिकाओं transduce करने की जरूरत वायरस के अधिकतम राशि का निर्धारण करते हैं। लागत बचाने के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली (अच्छी तरह से विकास मीडिया / के 0.3 मिलीग्राम) के बजाय अनुमापन के लिए एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान का उपयोग करें।
- केंद्रित वायरस की बढ़ती मात्रा में जोड़ें (0, 1, 2, 5, 10, 25, और 50 μl / अच्छी तरह से) 40-70% मिला हुआ Caco-2 कोशिकाओं को polybrene (अंतिम एकाग्रता = 5 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक। 1.1.2 में वर्णित के रूप में धीरे 24 अच्छी तरह से थाली हिला।
- उनके जीन अभिव्यक्ति की निगरानी (चरण 2.1.10।) (चित्रा 2 नीचे4 पैनल)।
- Transgene की अभिव्यक्ति आम तौर पर निरंतर है के बाद से, भविष्य के प्रयोगों के लिए transduced कोशिकाओं को बनाए रखने और लगातार उनके जीन अभिव्यक्ति की निगरानी (चरण 2.1.10।)।
- एक 15 सेमी टिशू कल्चर पकवान में बीज मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T कोशिकाओं (DMEM में 10% FBS के उनके विकास मीडिया के रूप में)।
3. लिपोप्रोटीन स्राव उत्तेजक
- नियमित रूप से टिशू कल्चर पकवान का प्रयोग
- ओलिक एसिड के 50 मिलीग्राम, लेसितिण के 40 मिलीग्राम, और सोडियम taurocholate के 48 मिलीग्राम मिश्रण से एक 100X लिपिड मिश्रण तैयार करें। (8 व्यंजनों के लिए पर्याप्त) पीबीएस के साथ 900 μl मात्रा लाओ। सख्ती लिपिड मिश्रण भंवर।
- विकास मीडिया के 89.1 मिलीलीटर में 100X लिपिड मिश्रण के 900 μl जोड़ें। मिक्स, और लिपिड युक्त मीडिया फिल्टर। ओलिक एसिड, लेसितिण, और सोडियम taurocholate के अंतिम सांद्रता (1x) 2.0 मिमी, 1.36 मिमी, और क्रमश: 1.0 मिमी, कर रहे हैं।
- कोशिकाओं के लिए लिपिड युक्त मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
- एक 37 में 4 घंटे के लिए लिपिड युक्त मीडिया के साथ कोशिकाओं को सेतेसी इनक्यूबेटर °।
- पीबीएस तीन बार के साथ कोशिकाओं को धो लें।
- लिपोप्रोटीन स्राव इकट्ठा करने के लिए कोशिकाओं को विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
- एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए सेते हैं।
- लिपोप्रोटीन युक्त मीडिया लीजिए।
- पारगम्य झिल्ली प्रणाली का प्रयोग
- चरणों का पालन करें 3.1.1-3.1.2 लिपिड मिश्रण तैयार करने के लिए।
- शिखर चैम्बर के लिए लिपिड युक्त मीडिया के 10 एमएल और basolateral चैम्बर के लिए विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
- एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए सेते हैं। Basolateral कक्ष में लिपोप्रोटीन युक्त मीडिया लीजिए।
4. लिपोप्रोटीन अलगाव (चित्रा 3)
- Centrifugation (5 मिनट के लिए 2,000 XG) द्वारा लिपोप्रोटीन युक्त मीडिया से सेल मलबे को हटाने।
- एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में मीडिया छानना।
- मीडिया के लिए सोडियम क्लोराइड के 5.95 छ जोड़ें।
- SA हैंmple मंदिर से विश्लेषण किया जाएगा, लिपो प्रोटीन की अखंडता को बनाए रखने के लिए 1 protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल गोली जोड़ें।
- पानी के साथ 23 मिलीलीटर की मात्रा (1.2 ग्राम / मिलीलीटर NaCl घनत्व समाधान) लाओ।
- पूरी तरह से विलेय भंग।
- एक polycarbonate ultracentrifuge ट्यूब में समाधान के सभी छानना।
- धीरे 0.5 मिलीलीटर पानी (1.0 ग्राम / मिलीलीटर घनत्व) के साथ 1.2 ग्राम / मिलीलीटर घनत्व समाधान उपरिशायी।
- मात्रा से वजन से और नहीं ट्यूब शेष।
- धीरे T865 रोटर में ट्यूब लोड।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 429,460 XG पर ultracentrifuge में नमूने स्पिन।
- इसके तत्काल बाद कोमल pipetting द्वारा शीर्ष 0.5 मिलीलीटर समाधान अलग। के रूप में संभव के रूप में अभी भी ट्यूब रखें।
5. मंदिर विश्लेषण
- (W / v) और 6.0 पीएच को समायोजित 2% phosphotungstic एसिड के 5 मिलीलीटर तैयार करें।
- (: 0.2 माइक्रोन रोमकूप आकार) एक सिरिंज फिल्टर के साथ 2% phosphotungstic एसिड फ़िल्टर।
- एक बाँझ पकवान पर लिपोप्रोटीन नमूना के 20 μl गिरा।
- अगले एक ही थाली पर नमूना करने के लिए फ़िल्टर 2% phosphotungstic एसिड के 20 μl गिरा।
- धीरे सुस्त पक्ष नमूना पर आराम के साथ एक EM ग्रिड ड्रॉप।
- 1 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
- धीरे ग्रिड से नमूना दूर करने के लिए एक फिल्टर पेपर पर उन्हें ग्रिड की ओर टैप करें।
- धीरे सुस्त ओर 2% phosphotungstic एसिड पर आराम के साथ उन्हें ग्रिड ड्रॉप।
- 1 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
- धीरे ग्रिड से phosphotungstic एसिड को दूर करने के लिए एक फिल्टर पेपर पर उन्हें ग्रिड की ओर टैप करें।
- एक मंदिर का प्रयोग, लिपो प्रोटीन (चित्रा 4) की छवियों पर कब्जा।
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Representative Results
1 प्रदर्शित करता है सामान्य 13 दिनों के बाद मिला हुआ Caco-2 कोशिकाओं चित्रा। गुंबद के आकार का संरचनाओं और intracellular लिपिड बूंदों की शक्ल में भेदभाव Caco-2 कोशिकाओं के लक्षण हैं। Caco-2 कोशिकाओं को बोने के दौरान समान रूप से तितर-बितर नहीं कर रहे हैं, वे पेड़ों का झुरमुट और पकवान के कुछ क्षेत्रों में अधिक बढ़ना होगा; और किसी भी कोशिकाओं के बिना डिश में कुछ ऐसे क्षेत्र हो जाएगा। घूमता है और एक slanted सतह पर पकवान रखकर बचा जाना चाहिए। यह पोस्ट मिला हुआ Caco-2 कोशिकाओं नए विकास मीडिया भी मोटे तौर पर कोशिकाओं के लिए जोड़ा गया है जब सेना की टुकड़ी के लिए अतिसंवेदनशील हैं कि नोट करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। इसलिए, नए मीडिया सेल टुकड़ी को रोकने के लिए धीरे जोड़ा जाना चाहिए।
इन अध्ययनों के आधार पर, Caco-2 कोशिकाओं के अभिकर्मक दक्षता 30-60% (चित्रा 2 शीर्ष पैनल) के बीच था। इसके विपरीत, lentivirus अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर Caco -2 के पारगमन क्षमता लगभग 100% थी (चित्रा 2 चित्रा 2 भी केंद्रित lentivirus के अधिकतम राशि 10 μl था कि पता चला है। transduced Caco-2 कोशिकाओं को 12 अंश अप करने के लिए बनाए रखा गया। दिखाया गया है, के बाद भी 12 अंश transduced कोशिकाओं को अभी भी EGFP व्यक्त किया। पारगमन दक्षता स्पष्ट रूप से lentivirus एकाग्रता पर निर्भर करता है। अभिकर्मक / पारगमन क्षमता की पुष्टि के लिए महत्वपूर्ण है, और वास्तविक प्रयोगों के लिए पहले एक नियमित प्रारंभिक विश्लेषण के रूप में किया जाना चाहिए। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण जीन की अभिव्यक्ति का प्रतिशत वृद्धि का अनुमान किया जा सकता है, यह अभिकर्मक / पारगमन क्षमता का निर्धारण करने के लिए प्राथमिक विधि नहीं होना चाहिए।
NaCl घनत्व ढाल ultracentrifugation विधि (चित्रा 3) का उपयोग करना, Caco-2 कोशिकाओं द्वारा स्रावित लिपो प्रोटीन पृथक और एक मंदिर पर विश्लेषण किया गया। Chylomicrons में से कुछ, व्यास में बड़ा से अधिक 80 एनएम लिपो प्रोटीन, चित्रा में दर्शाया गया4। छोटे लिपो प्रोटीन, VLDLs, भी उपस्थित थे। यह एक मंदिर पर दोनों chylomicrons और VLDLs के सफल अलगाव की पुष्टि के लिए आवश्यक है। पहले से 8 चर्चा की, जैव रासायनिक विश्लेषण पुष्टि की प्राथमिक विधि नहीं होना चाहिए। लिपो प्रोटीन के अभाव, विशेष रूप से chylomicrons, Caco-2 कोशिकाओं द्वारा लिपिड परिवहन कुशल नहीं है कि इंगित करता है। नतीजतन, वे लिपिड परिवहन अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल के रूप में काम नहीं करेगा। लिपोप्रोटीन कणों की कुल संख्या के सापेक्ष chylomicron कणों की संख्या 8 में गिना जा सकता है। एक उच्च प्रतिशत कुशल लिपिड परिवहन इंगित करता है।
चित्रा 13 दिन के बाद मिला हुआ Caco-2 कोशिकाओं के 1. प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ। Intracellular लिपिड बूंदों कुछ कोशिकाओं (लाल तीर) में दिखाई दे रहे हैं। अद्वितीय गुंबद के आकार का संरचनाओं (काला तीर) के लिएकुछ Caco-2 कोशिकाओं द्वारा rmed कोशिकाओं संगम पर पहुँच गए हैं के बाद ही आम तौर पर मौजूद हैं। आवर्धन = 100X। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा लिपिड आधारित अभिकर्मक की प्रभावशीलता और lentivirus अभिव्यक्ति प्रणाली 2. तुलना शीर्ष पैनल:। Caco-2 कोशिकाओं गैर liposomal अभिकर्मक अभिकर्मक (स्केल बार = 20 माइक्रोन) का उपयोग pLL3.7 EGFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। निचला 4 पैनल: Caco-2 कोशिकाओं pLL3.7 EGFP केंद्रित lentivirus (एल.वी.) की मात्रा बदलती (1, 2, 5, या 10 μl) के साथ lentivirus अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करने के साथ transduced थे। प्रदर्शित कोशिकाओं मूल transduced कोशिकाओं के 12 वें पारित होने से थे। छोड़ दिया पैनलों DAPI धुंधला दिखाने के लिए, बीच देहातNels GFP प्रतिदीप्ति दिखाने के लिए, और सही पैनल विलय छवियों को दिखाने के। lentivirus अभिव्यक्ति प्रणाली जाहिर लिपिड आधारित अभिकर्मक की तुलना में अधिक प्रभावी था। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
NaCl घनत्व ढाल ultracentrifugation का उपयोग कर आंतों लिपो प्रोटीन की चित्रा 3. अलगाव। लिपोप्रोटीन युक्त मीडिया के घनत्व NaCl के उचित मात्रा में जोड़ने के द्वारा ग्राम / मिलीलीटर 1.2 निकाला जाता है। यह पतन को रोकने के लिए पूरे ultracentrifuge ट्यूब भरना होगा तो यह है कि नमूने की मात्रा भी समायोजित करने की जरूरत है। एक घनत्व ढाल को प्राप्त करने के लिए, पानी के 0.5 मिलीलीटर 1.2 ग्राम / मिलीलीटर घनत्व समाधान पर धीरे मढ़ा है। नमूना तो एक T865 उपयोग करते हुए 24 घंटा के लिए 429,460 XG पर घूमती हैरोटर (2.15 स्वेडबर्ग इकाइयों के समकक्ष)। आंतों लिपो प्रोटीन तुरंत कोमल pipetting द्वारा बरामद किया जाना चाहिए। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Caco-2 कोशिकाओं द्वारा निर्मित लिपो प्रोटीन की चित्रा 4. प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। NaCl घनत्व ढाल ultracentrifugation द्वारा पृथक लिपो प्रोटीन को नकारात्मक रूप से 2% phosphotungstic एसिड (पीएच 6.0) के साथ दाग रहे थे। Chylomicrons, लिपिड कणों से बड़ा 80 व्यास में एनएम, और VLDLs, उन छोटे से अधिक 80 एनएम, दोनों मौजूद हैं। स्केल बार = 100 एनएम। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस पत्र में इस्तेमाल किया जा सकता है कि दो प्रणालियों Caco-2 कोशिकाओं, अर्थात्, नियमित रूप से टिशू कल्चर पकवान और पारगम्य झिल्ली वर्णित हैं बनाए रखने के लिए। पारगम्य झिल्ली प्रणाली का उपयोग कर के लाभों के शिखर की जुदाई और basolateral डिब्बों, और लिपिड मिश्रण सेते हैं और एक साथ लिपोप्रोटीन स्राव को इकट्ठा करने की क्षमता शामिल है। हालांकि, पारगम्य झिल्ली आवेषण महंगी हैं, और उनके पॉली कार्बोनेट झिल्ली अच्छा सेल दृश्यता के लिए अनुमति नहीं है। इस के लिए इन विट्रो मॉडल के फायदों में से एक आनुवंशिक हेरफेर पढ़ाई और अधिक किफायती और कम समय लेने वाली हो जाएगा। बेहतर प्रभाव के लिए, lentivirus अभिव्यक्ति प्रणाली का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। transduced Caco-2 कोशिकाओं को आम तौर पर उनके transgene की अभिव्यक्ति बनाए रखें।
chylomicrons निर्माण करने के लिए Caco-2 कोशिकाओं की क्षमता सर्वोपरि महत्व का है। इस क्षमता के बिना, Caco-2 कोशिकाओं के कुशल संचालन के लिए सक्षम नहीं होगाntly, lipophilic माल परिवहन सहित लेकिन liphophilic दवाओं, विटामिन ए, डी, ई, और कश्मीर, और किसी भी लिपिड में घुलनशील पोषक तत्वों के लिए सीमित नहीं है। उचित तरीके वीएलडीएल कणों और chylomicrons दोनों वर्णित हैं का निर्माण करने के Caco-2 कोशिकाओं को चुनौती देने के लिए। इन लिपोप्रोटीन कणों की सफल अलगाव एक मंदिर पर पुष्टि की जानी चाहिए। 14 - वर्तमान साहित्य के आधार पर, इस Caco -2 मॉडल अन्य Caco -2 मॉडल 12 के बीच सबसे कुशल लिपिड परिवहन प्रदान करता है। हालांकि, इन विवो लिम्फ केन्युलेशन मॉडल अभी भी और अधिक कुशलता से किसी में इन विट्रो मॉडल की तुलना में लिपिड transports। अंतर्निहित कारणों से हाल ही में Caco-2 कोशिकाओं Caco-2 कोशिकाओं मोनोग्लिसरॉइड से ट्राइग्लिसराइड्स synthesize नहीं कर सकते, अपोलीपोप्रोटीन बी के 2 अलग isoforms उपज है, और chylomicron जीवजनन के लिए महत्वपूर्ण सीरम घटक विकास मीडिया में कम हो सकती है अर्थात् क्योंकि, 8 चर्चा की गई है । यह में इस की सीमा को महसूस करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैइन विट्रो मॉडल; इस के लिए इन विट्रो मॉडल इस तरह के पेट गतिशीलता, पेट की शरीर रचना विज्ञान, और अन्य अंग प्रणालियों के साथ बातचीत के रूप में कुछ संभावित महत्वपूर्ण कारक है, शामिल नहीं है।
Caco-2 कोशिकाओं chylomicrons उत्पादन करने की अनुमति मुख्य कारक है कि कुशलता से इस्तेमाल किया लिपिड और सेलुलर भेदभाव 8 के प्रकार / राशि रहे हैं। इन कारकों के उचित संयोजन के बिना, Caco-2 कोशिकाओं chylomicrons 8 की एक महत्वपूर्ण संख्या का उत्पादन नहीं होगा। ध्यान से, सोडियम क्लोराइड घनत्व ढाल ultracentrifugation ठीक से प्रदर्शन किया जाना चाहिए। लिपो प्रोटीन के सफल अलगाव (महत्वपूर्ण देरी के बिना तत्काल) समय पर निर्भर करता है से निपटने अच्छा नमूना (ज्यादा आंदोलन के बिना मजबूत है), और सावधान pipetting (केवल ऊपर परत हो रही है)। उचित तकनीक लिपोप्रोटीन परत 8 कल्पना में मदद करने के लिए पूर्व से सना हुआ लिपिड का उपयोग करके अभ्यास किया जा सकता है। मंदिर के अलावा, जैव रासायनिक विश्लेषण, यानी, अपोलीपोप्रोटीन बी और ट्राइग्लिसराइड का विश्लेषण करती है, भी यू किया जा सकता हैलिपो प्रोटीन के सफल अलगाव की पुष्टि के लिए sed। हम पहले से 8 की सूचना दी है जो इन जैव रासायनिक विश्लेषण, यह भी अवशोषण को बढ़ाता में विधियों के रूप में सेवा कर सकते हैं। हालांकि, मंदिर अभी भी chylomicron उत्पादन का एक संभावित overestimation के कारण, 2 कुल करने के लिए लिपो प्रोटीन की प्रवृत्ति की वजह से किया जाना चाहिए।
यह इन विट्रो मॉडल आहार वसा अवशोषण और lipophilic दवाओं, विटामिन और अन्य लिपिड में घुलनशील पोषक तत्वों का अवशोषण आंतों के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। यह भी मौखिक lipophilic दवाओं के गरीब जैव उपलब्धता में सुधार करने के लिए एक मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं। लिपिड में घुलनशील सामग्री परिसंचरण को परिवहन के लिए enterocytes द्वारा chylomicrons में पैक कर रहे हैं, chylomicron उत्पादक Caco-2 कोशिकाओं lipophilic दवाओं को अवशोषित करने में अधिक कुशल हो जाएगा। इसके अलावा, इस मॉडल जांचकर्ताओं पेट (pharmacogenetics) द्वारा नशीली दवाओं के अवशोषण में एक विशेष जीन की भूमिका निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है। यह भी अनुमति देता हैvestigators मौखिक lipophilic दवा जैव उपलब्धता पर विभिन्न आहार वसा के प्रभाव की तुलना करें। इन आवेदनों में से सभी पहले 6 चर्चा की गई है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | VWR | 16750-112 | Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells |
| FBS | Fisher | 3600511 | We do not heat inactivate our serum |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment |
| Permeable membrane system | Fisher | 7200173 | 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane |
| 10 cm dish | Fisher | 08-772-E | Tissue culture dish |
| 15 cm dish | Fisher | 08-772-24 | Tissue culture dish |
| 24 well plate | Fisher | 12565163 | Tissue culture plate |
| Lipid-based transfection reagent | Fisher | PRE2691 | Can be substituted with other transfection reagent |
| Reduced serum media | Invitrogen | 11058021 | For transfection |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Bottle-top filter | Fisher | 9761120 | 0.45 mm pore |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/ml |
| Oleic acid | Sigma | 01383-5G | Prevent freeze-thaw cycle |
| Lecithin | Fisher | IC10214625 | Egg lecithin |
| Sodium taurocholate | Fisher | NC9620276 | Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956 |
| Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) | Fisher | 5892791001 | Used mainly for samples that need TEM analysis |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Fisher | NC9696153 | Reusing it multiple times will collapse the tube |
| Lid for ultracentrifuge tube | Fisher | NC9796914 | A tool is required to remove the tube/lid from rotor |
| Syringe | Fisher | 50-949-261 | Disposable |
| Syringe filter | Fisher | 09-719C | Pore size = 0.2 mm; nylon |
| Phosphotungstic acid | Fisher | AC208310250 | For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0 |
| Tweezer | Fisher | 50-238-62 | Extra fine and strong tips |
| Formvar/carbon grid | Fisher | 50-260-34 | Formvar/carbon film square grid 400 Copper |
References
- Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
- Nauli, A. M., et al. CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine. Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).
- Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).
- Lo, C. -M., et al. Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).
- Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption. Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).
- Nauli, A. M., Nauli, S. M. Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability. Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).
- Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein. Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).
- Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiol Rep. 2 (6), (2014).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Pottekat, A., et al. Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release. Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).
- Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells. Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).
- Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).
- Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).
