Introduction
Studi di assorbimento intestinale dei grassi alimentari e farmaci e vitamine liposolubili possono essere condotti in vivo, utilizzando un modello di fistola linfatica 1-4. Tuttavia, le tecniche chirurgiche coinvolte non sono solo una sfida, ma anche costoso. Sebbene in vivo approcci basati sull'analisi fecale possono essere utilizzati, sono utilizzati principalmente per determinare la percentuale di assorbimento dal tratto gastrointestinale 2,5. Il modello in vitro descritto in questo documento è più conveniente, e le tecniche coinvolte sono forse meno impegnativo. Studi modificazione genetica sono anche più economici e quando sono condotti utilizzando questo modello in vitro in termini di tempo di meno.
Poiché i materiali liposolubili che sono presi da enterociti sono confezionati in lipoproteine 6,7, l'efficacia di questo modello in vitro per produrre lipoproteine è cruciale. Le due intestina principalel lipoproteine sono chilomicroni e molto lipoproteine a bassa densità (VLDL). Chilomicroni, definiti come lipoproteine a 80 nm o più di diametro, sono prodotti rigorosamente dal piccolo intestino quando sono abbondantemente presenti nel lume gastrointestinale lipidi. Dal momento che sono i più grandi lipoproteine, chilomicroni sono plausibilmente i trasportatori lipidici più efficienti. Questo modello in vitro, che è capace di produrre chilomicroni 8, può essere usato per studiare l'assorbimento grassi, liposolubile vitamina assorbimento da parte dell'intestino e biodisponibilità orale lipofilo. La presenza di molecole liposolubili, vitamine o farmaci nella frazione lipoproteina è un indicatore della loro assorbimento da parte dell'intestino tenue. Come discusso in precedenza, questo modello può essere utilizzato per migliorare la biodisponibilità orale farmaco lipofila 6.
Questo documento descrive come cellule Caco-2 dovrebbero essere mantenute in membrana permeabile o regolari piastre di coltura dei tessuti, come le mi lipidixture per stimolare la produzione di lipoproteine dovrebbe essere preparato, come il sistema di espressione lentivirus può essere impiegato per realizzare sovraespressione efficace, e come dovrebbe essere analizzato lipoproteine isolate.
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Protocol
1. Manutenzione delle cellule Caco-2
- Utilizzando regolari piastre di coltura tissutale
- Scongelare le cellule Caco-2 da una fiala congelata ponendo la provetta in un bagno d'acqua a 37 °, e subito aggiungerli a un piatto di coltura di tessuto al 10 cm contenente 10 ml di terreni di crescita (siero bovino fetale pre-riscaldato 15% (FBS ) in Dulbecco modificato (DMEM)).
- Quando le cellule Caco-2 hanno raggiunto 50-70% di confluenza, dividerle 1: 6 incubando le cellule con 3 ml di 0,05% tripsina / 0.53 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) a 37 ° C fino a quando sono staccati (15 min) . Per evitare aggregazione cellulare, mescolare le cellule più volte delicatamente pipettando. Aggiungere 0,5 ml di cellule trypsinized ad un piatto di coltura di tessuto al 10 cm contenente 10 ml di terreni di crescita pre-riscaldato.
- Agitare delicatamente i piatti più volte in avanti e indietro, seguito da una direzione verso sinistra e verso destra. Evitare vorticoso i piattiin quanto può provocare una dispersione delle cellule disuguale.
- Porre le capsule su una superficie piana in un incubatore a 37 ° in dotazione con il 5% di CO 2. Superfici inclinate possono anche provocare una dispersione cellulare disuguale.
- Modificare i media di crescita di un giorno dopo l'avvio l'incubazione.
- Monitorare le cellule e registrare la giornata raggiungono confluenza. Ci vorrà circa 1 settimana per le cellule di raggiungere confluenza dal giorno in cui sono divisi.
- Modificare i mezzi di crescita due volte la settimana prima che le cellule raggiungono confluenza. Una volta che le cellule hanno raggiunto confluenza, modificare i mezzi di crescita ogni altro giorno. Dopo che le cellule sono 7 giorni post-confluenti, modificare i mezzi di crescita giornaliera.
Nota: Le cellule sono pronte per esperimenti quando sono 13 giorni post-confluenti (Figura 1). Dal momento che le cellule diventeranno meno efficace nel produrre lipoproteine, usare le cellule che si trovano tra i 13 ei 17 giorni dopo confluenti 8. Andare al punto 3 su come condurre l'esperimento.
- Scongelare le cellule Caco-2 da una fiala congelata ponendo la provetta in un bagno d'acqua a 37 °, e subito aggiungerli a un piatto di coltura di tessuto al 10 cm contenente 10 ml di terreni di crescita (siero bovino fetale pre-riscaldato 15% (FBS ) in Dulbecco modificato (DMEM)).
- Utilizzando il sistema di membrana permeabile
- Seme le cellule Caco-2 nel foglietto membrana permeabile come descritto al punto 1.1.1.1. sopra. Evitare l'uso di cellule da un flaconcino congelato perché la loro crescita cellulare è normalmente più lento (periodo di recupero). Brevemente, aggiungere 0,5 ml delle cellule trypsinized alla camera apicale (scomparto superiore) contenente 10 ml di terreni di crescita pre-riscaldato. Inoltre, aggiungere 10 ml di terreni di crescita pre-riscaldato alla camera basolaterale (scomparto inferiore).
Nota: per le migliori prassi, aggiungere i media di crescita alla camera apicale e poi alla camera basolaterale. Durante la rimozione dei vecchi media, rimuovere il supporto basolaterale prima che i media apicali. Evitare colpendo la membrana di policarbonato in quanto potrebbe rompere la membrana. - Grazie alla visibilità delle cellule poveri attraverso la membrana in policarbonato, seminare le cellule Caco-2 in un piatto di coltura tissutale regolare con densità simile, e utilizzare questo piatto per giudicare la confluenza delle cellule.
- Segui steps 1.1.2-1.1.6 sopra.
- Seme le cellule Caco-2 nel foglietto membrana permeabile come descritto al punto 1.1.1.1. sopra. Evitare l'uso di cellule da un flaconcino congelato perché la loro crescita cellulare è normalmente più lento (periodo di recupero). Brevemente, aggiungere 0,5 ml delle cellule trypsinized alla camera apicale (scomparto superiore) contenente 10 ml di terreni di crescita pre-riscaldato. Inoltre, aggiungere 10 ml di terreni di crescita pre-riscaldato alla camera basolaterale (scomparto inferiore).
2. Gene Overexpression
- Utilizzando l'approccio trasfezione regolare
- Seme le cellule Caco-2 su un piatto di coltura di tessuti, come descritto nella 1.1.1.1.-1.1.4 sopra.
Nota: Quando le cellule sono circa il 40-50% confluenti, sono pronti per essere transfettate. - Aggiungere 67 ml di reagente trasfezione a 472 l di media siero ridotti in una provetta. Evitare il contatto del reagente di trasfezione diluito con la parete del tubo.
- Aggiungere 23 mg di pLL3.7 rafforzata proteina fluorescente verde (eGFP) 9 in / ridotto miscela Mezzi di siero di reagenti di trasfezione.
- Incubare la miscela per 20 minuti a RT.
- Sostituire mezzi di crescita delle cellule Caco-2 'con 8 ml di 10% FBS in DMEM.
- Aggiungere il composto DNA / reagente trasfezione / ridotto supporto siero goccia a goccia al piatto.
- Agitare delicatamente i piatti più volte in un avanti e badirezione ckward seguita da una direzione verso sinistra e verso destra.
- Porre la capsula nel C incubatore 37 °.
- Sostituire il supporto nel piatto con 10 ml di terreni di crescita giorno dopo l'avvio l'incubazione.
- Monitorare l'espressione genica.
- Monitorare l'espressione genica senza 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) colorazione. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, determinare la percentuale di cellule che sono verde. La percentuale rappresenta l'efficienza di trasfezione.
- Monitorare l'espressione genica con colorazione DAPI.
- Lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS) tre volte.
- Fissare le cellule aggiungendo 10 ml di formaldeide al 4% in PBS (10 min di incubazione a RT).
- Lavare le cellule con PBS per tre volte.
- Incubare le cellule al buio per 15 minuti a RT con 8 ml di PBS contenente 1: 500 DAPI, 1% BSA, 0,01% digitonina.
- Lavare le cellule con PBS per tre volte.
- Ucantare un microscopio a fluorescenza, determinare il numero di cellule che sono verde / blu rispetto a quelli che sono blu (Figura 2 pannello superiore). La percentuale calcolata rappresenta l'efficienza di trasfezione.
- Seme le cellule Caco-2 su un piatto di coltura di tessuti, come descritto nella 1.1.1.1.-1.1.4 sopra.
- Utilizzando il sistema sovraespressione lentivirus 10
- Seme umano rene embrionale (HEK) le cellule 293T in un 15 centimetri piatto di coltura tissutale (10% FBS in DMEM come loro mezzi di crescita).
Nota: Quando le cellule sono circa il 60-70% confluenti, sono pronti per essere transfettate. - Aggiungere 162 ml di reagente trasfezione di 1.133 l di media siero ridotti in una provetta 11. Evitare il contatto del reagente di trasfezione diluito con la parete del tubo.
- Aggiungere 24 mg di pLL3.7 eGFP (o un altro costrutto), 15,6 mg di elemento risposta Rev (RRE), 6.0 mg di REV, e 8,4 mg di vescicolare glicoproteina virus della stomatite (VSVG) nel reagente trasfezione / reduced miscela Mezzi di siero.
- Incubare la miscela per 20 minuti a RT.
- Sostituire il supporto di crescita con 16 ml di 10% FBS in DMEM.
- Aggiungere il composto DNA / reagente trasfezione / ridotto supporto siero goccia a goccia al piatto.
- Agitare delicatamente i piatti più volte in avanti e indietro, seguito da una direzione verso sinistra e verso destra. E 'normale vedere alcune delle cellule HEK293T distaccati a questo punto.
- Porre la capsula in incubatrice.
- Dopo 24 ore di incubazione, sostituire il supporto nel piatto con 25 ml di terreni di crescita.
- Il giorno seguente, raccogliere i mezzi di crescita contenente il lentivirus (prima raccolta).
- Ripetere il punto 2.2.10 per raccogliere più lentivirus (la seconda raccolta).
- PISCINA La prima e la seconda raccolta, e rimuovere detriti cellulari mediante centrifugazione (2500 xg per 5 min).
- Filtrare la collezione con un filtro a perdere per bottiglia (0,45 micron pori), econcentrare il virus mediante centrifugazione dalla collezione 31.400 xg per 2 ore a temperatura ambiente (JA-20 rotore). Contrassegnare il fondo della provetta in cui si trova il pellet. Decantare il surnatante, e lasciare la provetta capovolta a temperatura ambiente per circa 15 min.
- Risospendere il pellet contenente il virus con 100 ml di PBS 1X. Evitare bolle.
- Conservare il virus concentrato a -80 ° C. Evitare cicli di congelamento-scongelamento.
- Determinare la quantità ottimale di virus necessari per trasdurre cellule Caco-2 mediante titolazione. Per risparmiare sui costi, utilizzare una piastra da 24 pozzetti (0,3 ml di crescita media / pozzo) invece di un piatto di coltura di tessuti 10 centimetri per la titolazione.
- Aggiungere quantità crescenti del virus concentrati (0, 1, 2, 5, 10, 25, e 50 ml / pozzetto) supplementato con polibrene (concentrazione finale = 5 mg / ml) al 40-70% confluenti cellule Caco-2. Agitare la piastra da 24 pozzetti dolcemente, come descritto al punto 1.1.2.
- Monitorare la loro espressione genica (Fase 2.1.10.) (Figura 2 bottom4 pannelli).
- Dal momento che l'espressione del transgene è generalmente sostenuta, di mantenere le cellule trasdotte per futuri esperimenti e monitorare continuamente la loro espressione genica (Step 2.1.10.).
- Seme umano rene embrionale (HEK) le cellule 293T in un 15 centimetri piatto di coltura tissutale (10% FBS in DMEM come loro mezzi di crescita).
3. stimolare la secrezione Lipoprotein
- Utilizzando la normale piatto di coltura tissutale
- Preparare una miscela di lipidi 100X mescolando 50 mg di acido oleico, 40 mg di lecitina, e 48 mg di sodio taurocolato. Portare il volume a 900 ml con PBS (sufficiente per 8 piatti). Vortex la miscela lipidica vigorosamente.
- Aggiungere 900 ml di miscela lipidica 100X in 89,1 ml di terreni di crescita. Mescolare e filtrare i media lipidi contenenti. Le concentrazioni finali (1X) di acido oleico, lecitina e sodio taurocolato sono 2,0 mM, 1,36 mM e 1,0 mM, rispettivamente.
- Aggiungere 10 ml di media-lipidico contenente alle cellule.
- Incubare le cellule con i media lipidi contenenti per 4 ore a 37° C incubatore.
- Lavare le cellule con PBS per tre volte.
- Aggiungere 10 ml di mezzi di crescita per le cellule a raccogliere la secrezione delle lipoproteine.
- Incubare per 2 ore in un incubatore a 37 °.
- Raccogliere la media-lipoproteine contenenti.
- Utilizzando il sistema di membrana permeabile
- Seguire i passaggi 3.1.1-3.1.2 per preparare la miscela lipidica.
- Aggiungere 10 ml di media-lipidico contenente alla camera apicale e 10 ml di mezzi di crescita alla camera basolaterale.
- Incubare per 4 ore in un incubatore a 37 °. Raccogliere la media-lipoproteine contenenti nella camera basolaterale.
4. Lipoprotein Isolation (Figura 3)
- Rimuovere i detriti cellulari dal supporto lipoproteine contenenti mediante centrifugazione (2000 xg per 5 min).
- Decantare i mezzi di comunicazione in un tubo da 50 ml.
- Aggiungere 5,95 g di cloruro di sodio ai media.
- Se la sample sarà analizzata dal TEM, aggiungere 1 inibitore della proteasi cocktail della tavoletta per garantire l'integrità delle lipoproteine.
- Portare il volume a 23 ml con acqua (1,2 g / ml NaCl soluzione densità).
- Sciogliere completamente soluti.
- Decantare tutta la soluzione in un tubo di policarbonato ultracentrifuga.
- Sovrapporre delicatamente la soluzione densità di 1,2 g / ml con 0,5 ml di acqua (1,0 g / ml densità).
- Bilanciare il tubo in peso e non in volume.
- Caricare delicatamente i tubi nel rotore T865.
- Spin i campioni nel ultracentrifuga a 429.460 xg per 24 ore a 4 ° C.
- Immediatamente isolare la parte superiore di 0,5 ml di soluzione delicatamente pipettando. Mantenere il tubo più fermi possibile.
Analisi 5. TEM
- Preparare 5 ml di 2% di acido fosfotungstico (w / v) e regolare il pH a 6,0.
- Filtrare l'acido fosfotungstico 2% con un filtro a siringa (dimensione dei pori: 0,2 um).
- Goccia 20 ml di campione lipoproteina su un piatto sterile.
- Goccia 20 ml di 2% di acido fosfotungstico filtrato accanto al campione sullo stesso piatto.
- Cadere delicatamente una griglia EM con il lato opaco appoggiata sul campione.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 min.
- Battere delicatamente il lato della griglia EM su una carta da filtro per rimuovere il campione dalla griglia.
- Rilasciare delicatamente la griglia EM con il lato opaco appoggiato sul acido fosfotungstico 2%.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 min.
- Battere delicatamente il lato della griglia EM su una carta da filtro per rimuovere l'acido fosfotungstico dalla rete.
- Utilizzando un TEM, catturare le immagini delle lipoproteine (Figura 4).
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Representative Results
Figura 1 visualizza normali 13 giorni post-confluenti cellule Caco-2. La comparsa di strutture a forma di cupola e gocce lipidiche intracellulari sono caratteristici di differenziate cellule Caco-2. Quando le cellule Caco-2 non sono dispersi ugualmente durante la semina, si ciuffo e invadere in alcune zone del piatto; e ci saranno alcune aree nel piatto, senza tutte le cellule. Vorticoso e mettendo il piatto su una superficie inclinata deve essere evitata. E 'anche importante notare che il post-confluenti cellule Caco-2 sono più suscettibili al distacco quando nuovi terreni di crescita si aggiunge alle cellule troppo grossolanamente. Pertanto, i nuovi media dovrebbero essere aggiunti delicatamente per evitare il distacco delle cellule.
Sulla base di questi studi, l'efficienza di trasfezione di cellule Caco-2 è stato tra 30-60% (Figura 2 pannelli superiori). Al contrario, l'efficienza di trasduzione di Caco-2 utilizzando il sistema di espressione lentivirus era approssimativamente 100% (Figura 2 Figura 2 ha anche mostrato che la quantità ottimale di lentivirus concentrata è di 10 ml. Le trasdotte cellule Caco-2 sono state mantenute fino a 12 passaggi. Come si vede, anche dopo 12 passaggi le cellule trasdotte ancora espresso eGFP. L'efficienza di trasduzione dipende chiaramente dalla concentrazione lentivirus. La conferma della efficienza di trasfezione / trasduzione è critica e deve essere eseguita come una routine di analisi preliminare prima degli esperimenti reali. Sebbene l'analisi Western blot può essere utilizzato per stimare l'incremento percentuale dell'espressione genica, non dovrebbe essere il metodo principale per determinare l'efficienza di trasfezione / trasduzione.
Utilizzando il gradiente di densità ultracentrifugazione NaCl (figura 3), le lipoproteine secreti dalle cellule Caco-2 sono stati isolati e analizzati su un TEM. Alcuni dei chilomicroni, lipoproteine superiore a 80 nm di diametro, sono stati descritti in Figura4. Le lipoproteine più piccole, VLDL, erano presenti. È essenziale per confermare l'isolamento successo sia chilomicroni e VLDL su un TEM. Come discusso in precedenza 8, analisi biochimica non dovrebbe essere il principale metodo di conferma. L'assenza delle lipoproteine, specificamente chilomicroni, indica che il trasporto dei lipidi da parte delle cellule Caco-2 non è efficiente. Di conseguenza, essi non servire come un buon modello per studiare il trasporto dei lipidi. Il numero di particelle chilomicroni rispetto al numero totale di particelle di lipoproteine può essere contato 8. Una percentuale elevata indica trasporto dei lipidi efficiente.
Figura 1. Micrografia Rappresentante di 13 giorni post-confluenti cellule Caco-2. Intracellulare gocce lipidiche sono visibili in alcune cellule (freccia rossa). Le strutture a forma di cupola unici (freccia nera) foconfermate da alcune cellule Caco-2 sono generalmente presenti solo dopo che le cellule hanno raggiunto confluenza. Ingrandimento = 100X. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Confronto tra l'efficacia della trasfezione base lipidica e il sistema di espressione lentivirus Pannello superiore:. Cellule Caco-2 sono state trasfettate con pLL3.7 eGFP utilizzando il reagente di trasfezione non liposomiale (Scala bar = 20 micron). Fondo 4 pannelli: cellule Caco-2 sono state trasdotte con pLL3.7 eGFP utilizzando il sistema di espressione lentivirus con quantità variabili (1, 2, 5 o 10 mL) del concentrato lentivirus (LV). Le cellule sono state esposte dal 12 passaggi di cellule trasdotte originali. I pannelli a sinistra mostrano la colorazione DAPI, il pa centralenels mostrano la fluorescenza GFP, e pannelli di destra mostrano le immagini unite. Il sistema di espressione lentivirus era evidentemente più efficace della trasfezione base lipidica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Isolamento di lipoproteine intestinali utilizzando NaCl ultracentrifugazione a gradiente di densità. La densità di lipoproteine contenenti supporti viene regolato a 1,2 g / ml aggiungendo la quantità appropriata di NaCl. Deve anche il volume del campione da regolare in modo che possa riempire l'intero tubo un'ultracentrifuga per prevenire il collasso. Per ottenere un gradiente di densità, 0,5 ml di acqua viene sovrapposto delicatamente sul g / ml soluzione densità 1.2. Il campione viene poi filata a 429.460 xg per 24 ore con un T865rotore (equivalente a 2,15 unità Svedberg). Le lipoproteine intestinali devono essere immediatamente recuperati delicatamente pipettando. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Rappresentante al microscopio elettronico delle lipoproteine prodotte dalle cellule Caco-2. Le lipoproteine isolate da NaCl gradiente di densità ultracentrifugazione stati negativamente macchiato con 2% di acido fosfotungstico (pH 6,0). Chilomicroni, particelle lipidiche superiore a 80 nm di diametro, e VLDL, quelli inferiori a 80 nm, sono entrambi presenti. Barra di scala = 100 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo documento, i due sistemi che possono essere utilizzati per mantenere cellule Caco-2 sono descritte, cioè, il piatto di coltura tissutale regolare e la membrana permeabile. I vantaggi di utilizzare il sistema di membrana permeabile includono la separazione del apicale e basolaterale compartimenti, e la capacità di incubare la miscela lipidica e raccogliere la secrezione lipoproteina simultaneamente. Tuttavia, gli inserti membrana permeabile sono costosi, e la loro membrana di policarbonato non consentono una buona visibilità delle cellule. Uno dei vantaggi di questo modello in vitro è che gli studi di manipolazione genetica saranno più economico e meno tempo. Per una migliore efficacia, deve essere utilizzato il sistema di espressione lentivirus. Le trasdotte cellule Caco-2 generalmente mantengono l'espressione del transgene loro.
La capacità di cellule Caco-2 per produrre chilomicroni è di fondamentale importanza. Senza questa capacità, cellule Caco-2, non sarebbe in grado di EFFICIEtrasportare nte materiali lipofile, incluso ma non limitato ai farmaci liphophilic, vitamina A, D, E e K, e di tutte le sostanze nutrienti liposolubili. I metodi adeguati per sfidare cellule Caco-2 per la produzione di entrambe le particelle VLDL e chilomicroni sono descritti. L'isolamento di successo di queste particelle lipoproteiche deve essere confermata su un TEM. Sulla base della letteratura attuale, questo modello Caco-2 offre il trasporto dei lipidi più efficiente tra le altre Caco-2 modelli 12-14. Tuttavia, in vivo linfa modello incannulamento trasporta ancora lipidi in modo più efficiente rispetto a qualsiasi modello in vitro. Le ragioni alla base sono state recentemente discusse 8, vale a dire in quanto cellule Caco-2 producono 2 diverse isoforme di apolipoproteina B, cellule Caco-2, non in grado di sintetizzare i trigliceridi di monogliceridi, e il componente del siero critico per chilomicroni biogenesi possono essere inferiori nei media di crescita . E 'anche importante rendersi conto del limite di questo inmodello in vitro; questo modello in vitro esclude alcuni potenziali fattori importanti, come la motilità intestinale, anatomia intestinale, e l'interazione con altri sistemi organici.
I principali fattori che consentono cellule Caco-2 per la produzione di chilomicroni sono efficientemente il tipo / quantità di lipidi utilizzati e la differenziazione cellulare 8. Senza la corretta combinazione di questi fattori, cellule Caco-2 non produrranno un numero significativo di chilomicroni 8. Da segnalare, NaCl gradiente di densità ultracentrifugazione deve essere eseguita in modo corretto. L'isolamento di successo delle lipoproteine dipende da tempi (immediato senza ritardo significativo), una buona gestione del campione (solido senza troppa agitazione), e attenta pipettaggio (ottenendo solo lo strato superiore). Tecnica corretta può essere praticata utilizzando lipidi pre-tinto per aiutare a visualizzare il livello di lipoproteine 8. Oltre TEM, analisi biochimiche, cioè, apolipoproteina B e trigliceridi analisi, possono anche essere used per confermare l'isolamento di successo delle lipoproteine. Queste analisi biochimiche, che abbiamo precedentemente riportati 8, possono anche servire come metodi nel quantificare l'assorbimento. Tuttavia, TEM deve comunque essere effettuata a causa della tendenza delle lipoproteine ad aggregare 2, causando un potenziale sovrastima della produzione chilomicroni.
Questo modello in vitro è particolarmente utile per studiare l'assorbimento dei grassi alimentari e l'assorbimento intestinale di farmaci lipofili, vitamine e altri nutrienti liposolubili. Può anche servire come modello per migliorare scarsa biodisponibilità dei farmaci lipofili orali. Poiché i materiali liposolubili sono confezionati in chilomicroni di enterociti per il trasporto alla circolazione, cellule Caco-2-chilomicroni producono saranno più efficienti nell'assorbire farmaci lipofili. Inoltre, questo modello permette investigatori per determinare il ruolo di un gene specifico in droga assorbimento dall'intestino (farmacogenetica). Permette anche investigators per confrontare l'effetto di vari grassi alimentari su orale biodisponibilità droga lipofile. Tutte queste applicazioni sono state discusse in precedenza 6.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | VWR | 16750-112 | Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells |
| FBS | Fisher | 3600511 | We do not heat inactivate our serum |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment |
| Permeable membrane system | Fisher | 7200173 | 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane |
| 10 cm dish | Fisher | 08-772-E | Tissue culture dish |
| 15 cm dish | Fisher | 08-772-24 | Tissue culture dish |
| 24 well plate | Fisher | 12565163 | Tissue culture plate |
| Lipid-based transfection reagent | Fisher | PRE2691 | Can be substituted with other transfection reagent |
| Reduced serum media | Invitrogen | 11058021 | For transfection |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Bottle-top filter | Fisher | 9761120 | 0.45 mm pore |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/ml |
| Oleic acid | Sigma | 01383-5G | Prevent freeze-thaw cycle |
| Lecithin | Fisher | IC10214625 | Egg lecithin |
| Sodium taurocholate | Fisher | NC9620276 | Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956 |
| Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) | Fisher | 5892791001 | Used mainly for samples that need TEM analysis |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Fisher | NC9696153 | Reusing it multiple times will collapse the tube |
| Lid for ultracentrifuge tube | Fisher | NC9796914 | A tool is required to remove the tube/lid from rotor |
| Syringe | Fisher | 50-949-261 | Disposable |
| Syringe filter | Fisher | 09-719C | Pore size = 0.2 mm; nylon |
| Phosphotungstic acid | Fisher | AC208310250 | For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0 |
| Tweezer | Fisher | 50-238-62 | Extra fine and strong tips |
| Formvar/carbon grid | Fisher | 50-260-34 | Formvar/carbon film square grid 400 Copper |
References
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