Introduction
Studier av intestinala absorptionen av fett och fettlösliga läkemedel och vitaminer kan utföras in vivo genom att använda en lymfa fistel modell 1 - 4. Kirurgiska tekniker som deltar är emellertid inte bara en utmaning, men också kostsamt. Även in vivo metoder baserade på fekal analys kan användas, används de huvudsakligen för att bestämma den procentuella upptag av mag-tarmkanalen 2,5. In vitro-modell som beskrivs i detta dokument är mer kostnadseffektiv, och tekniker som är utan tvekan mindre utmanande. Genetiska modifieringsstudier är också mer ekonomiskt och mindre tidskrävande när de utförs med hjälp av denna in vitro-modell.
Eftersom fettlösliga material som tas upp av enterocyter förpackas i lipoproteiner 6,7, är avgörande effektiviteten i denna in vitro-modell för att producera lipoproteiner. De två huvud intestinal lipoproteiner är kylomikroner och mycket low-density lipoprotein (VLDL). Kylomikroner, definierade som lipoproteiner med 80 nm eller mer i diameter, produceras strikt tunntarmen när lipider är högst närvarande i mag-lumen. Eftersom de är de största lipoproteiner, kylomikroner är möjligen de mest effektiva lipid transportörer. Denna modell in vitro, vilken är kapabel att producera kylomikroner 8, kan användas för att studera dietary fettabsorption, lipidlösligt vitamin absorption av tarmen, och oralt lipofilt läkemedel biotillgänglighet. Närvaron av lipidlösliga molekyler, vitaminer eller läkemedel i lipoproteinfraktionen är en indikator på deras absorption genom tunntarmen. Som tidigare diskuterats, kan denna modell användas för att förbättra oral lipofilt läkemedel biotillgänglighet 6.
Detta dokument beskriver hur Caco-2-celler bör bibehållas i membran eller regelbundna vävnadsodlingsskålar, hur lipid mixture för att stimulera lipoprotein produktion bör förberedas, hur lentivirus expressionssystem kan användas för att uppnå en effektiv uttryck, och hur de isolerade lipoproteiner bör analyseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Underhåll av Caco-2-celler
- Använda vanliga vävnadsodlingsskålar
- Tina Caco-2-celler från en fryst ampull genom att placera ampullen i ett 37 ° C vattenbad, och omedelbart lägga till dem i en 10 cm vävnadsodlingsskål innehållande 10 ml förvärmda tillväxtmedier (15% fetalt bovint serum (FBS ) i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM)).
- När de Caco-2-celler har nått 50-70% konfluens, dela upp dem en: 6 genom att inkubera cellerna med 3 ml 0,05% trypsin / 0,53 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) vid 37 ° C tills de är fristående (15 min) . För att undvika cellklumpning, blanda cellerna flera gånger genom försiktig pipettering. Lägg 0,5 ml av de trypsiniserade cellerna till en 10 cm vävnadsodlingsskål innehållande 10 ml av förvärmda tillväxtmedia.
- Skaka försiktigt rätter flera gånger i en framåt och bakåt följt av en åt vänster och höger riktning. Undvik virvlande rättereftersom det kan leda till en ojämlik celldispersion.
- Placera skålarna på en plan yta i en 37 ° C inkubator levereras med 5% CO2. Sneda ytor kan också resultera i en ojämn celldispersion.
- Ändra tillväxtmedier en dag efter start av inkubation.
- Övervaka cellerna och registrera den dag de når sammanflödet. Det tar ca 1 vecka för cellerna att nå sammanflödet från den dag de är uppdelade.
- Ändra tillväxtmediet två gånger i veckan innan cellerna når sammanflytning. När cellerna har nått konfluens, ändra tillväxtmedium varannan dag. Efter det att cellerna är 7-dagar efter sammanflytande, ändra tillväxtmediet dagligen.
Obs: Cellerna är redo för experiment när de är 13-dagar efter sammanflytande (Figur 1). Eftersom cellerna så småningom kommer att bli mindre effektiv i att producera lipoproteiner, använder celler som är mellan 13 till 17-dagar efter sammanflytande 8. Gå till steg 3 om hur man genomför försöket.
- Tina Caco-2-celler från en fryst ampull genom att placera ampullen i ett 37 ° C vattenbad, och omedelbart lägga till dem i en 10 cm vävnadsodlingsskål innehållande 10 ml förvärmda tillväxtmedier (15% fetalt bovint serum (FBS ) i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM)).
- Använda det permeabla membransystemet
- Seed Caco-2-celler i det permeabla membranet insatsen såsom beskrivs i steg 1.1.1.1. ovan. Undvik att använda celler från en frusen flaska eftersom deras celltillväxt är normalt långsammare (återhämtningsperiod). I korthet, tillsätt 0,5 ml av de trypsiniserade cellerna till den apikala kammaren (övre utrymmet) som innehåller 10 ml av förvärmda tillväxtmedia. Dessutom, tillsätt 10 ml av förvärmda odlingsmedier till basolaterala kammaren (nedre kammaren).
Obs: För bästa praxis, lägga tillväxtmedia till apikala kammaren först och sedan till basolateral kammaren. När du tar bort den gamla medier tar du bort den basolaterala media innan de apikala media. Undvik att peta i polykarbonatmembran som det kan brista membranet. - På grund av dålig cell sikten genom polykarbonatmembran, ympa Caco-2-celler i en regelbunden vävnadsodlingsskål med liknande densitet, och använda denna maträtt att bedöma cell konfluens.
- Följ arpakterna 1.1.2-1.1.6 ovan.
- Seed Caco-2-celler i det permeabla membranet insatsen såsom beskrivs i steg 1.1.1.1. ovan. Undvik att använda celler från en frusen flaska eftersom deras celltillväxt är normalt långsammare (återhämtningsperiod). I korthet, tillsätt 0,5 ml av de trypsiniserade cellerna till den apikala kammaren (övre utrymmet) som innehåller 10 ml av förvärmda tillväxtmedia. Dessutom, tillsätt 10 ml av förvärmda odlingsmedier till basolaterala kammaren (nedre kammaren).
2. Gen Expression
- Använda vanliga transfektion metod
- Seed Caco-2-celler på en vävnadsodlingsskål som beskrivs i 1.1.1.1.-1.1.4 ovan.
Anmärkning: När cellerna är ca 40-50% sammanflytande, är de redo att transfekteras. - Lägg 67 pl av transfektionsreagens till 472 pl av de reducerade serum media i ett mikrocentrifugrör. Undvik kontakt med outspädd transfektionsreagens med rörväggen.
- Lägg 23 pg av pLL3.7 förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) 9 in i transfektionsreagens / reducerad blandning serummedier.
- Inkubera blandningen i 20 min vid rumstemperatur.
- Ersätta de Caco-2-celler 'tillväxtmedia med 8 ml av 10% FBS i DMEM.
- Lägg DNA / transfektionsreagens / minskad serummedieblandningen droppvis till skålen.
- Skaka försiktigt rätter flera gånger i en framåt och backward riktning följt av en åt vänster och höger riktning.
- Placera skålen i 37 ° C inkubator.
- Byt ut media i skålen med 10 ml tillväxtmedium per dag efter start av inkubation.
- Övervaka genuttryck.
- Övervaka genuttryck utan 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) färgning. Med hjälp av en fluorescerande mikroskop, fastställa vilken procent av celler som är grön. Procent representerar transfektionseffektivitet.
- Övervaka genuttryck med DAPI-färgning.
- Tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tre gånger.
- Fixera cellerna genom tillsats av 10 ml 4% formaldehyd i PBS (10 min inkubation vid RT).
- Tvätta cellerna med PBS tre gånger.
- Inkubera cellerna i mörker under 15 min vid RT med 8 ml PBS innehållande 1: 500 DAPI, 1% BSA, 0,01% digitonin.
- Tvätta cellerna med PBS tre gånger.
- Usjunga en fluorescerande mikroskop, bestämma antalet celler som är grön / blå i förhållande till dem som är blå (Figur 2 övre panelen). Den beräknade procentsatsen representerar transfektionseffektivitet.
- Seed Caco-2-celler på en vävnadsodlingsskål som beskrivs i 1.1.1.1.-1.1.4 ovan.
- Använda lentivirus överuttryck systemet 10
- Seed humana embryonjur (HEK) 293T-celler i en 15 cm vävnadsodlingsskål (10% FBS i DMEM som deras tillväxtmedier).
Obs: När cellerna är ca 60-70% sammanflytande, de är redo att transfekteras. - Lägg 162 pl av transfektionsreagens till 1,133 il av de reducerade serum media i ett mikrocentrifugrör 11. Undvik kontakt med outspädd transfektionsreagens med rörväggen.
- Lägg 24 pg av pLL3.7 EGFP (eller annan konstruktion), 15,6 mikrogram av Rev responselement (RRE), 6,0 mikrogram av REV och 8,4 mikrogram av vesikulärt stomatitvirus glykoprotein (VSVG) i transfektionsreagens / reduced serummedieblandningen.
- Inkubera blandningen i 20 min vid rumstemperatur.
- Ersätt tillväxtmediet med 16 ml av 10% FBS i DMEM.
- Lägg DNA / transfektionsreagens / minskad serummedieblandningen droppvis till skålen.
- Skaka försiktigt rätter flera gånger i en framåt och bakåt följt av en åt vänster och höger riktning. Det är normalt att se några av de HEK293T cellerna lossnat vid denna tidpunkt.
- Placera skålen i inkubatorn.
- Efter 24 timmars inkubation, byt media i skålen med 25 ml tillväxtmedium.
- Följande dag uppsamlades den tillväxtmedia innehållande lentivirus (första samlingen).
- Upprepa steg 2.2.10 att samla in mer lentivirus (den andra samling).
- Pool den första och den andra samlingen, och avlägsna cellrester genom centrifugering (2500 x g under 5 min).
- Filtrera samlingen med en engångsflaska-toppfiltret (0,45 ^ m porstorlek), ochkoncentrera viruset genom centrifugering av insamling vid 31.400 xg under 2 h vid RT (JA-20 rötor). Märks botten av centrifugröret där pelleten är belägen. Dekantera supernatanten, och lämnar röret inverteras vid RT under cirka 15 min.
- Resuspendera virusinnehållande pelleten med 100 | il av 1 x PBS. Undvika bubblor.
- Förvara koncentrerade viruset vid -80 ° C. Undvik frysnings-upptiningscykler.
- Bestämma den optimala mängden virus som behövs för att transducera de Caco-2-celler genom titrering. För att spara kostnader, använder en 24-brunnars platta (0,3 ml tillväxtmedia / brunn) i stället för en 10 cm vävnadsodlingsplatta för titrering.
- Lägg ökande mängder av det koncentrerade viruset (0, 1, 2, 5, 10, 25, och 50 | j, l / brunn) supplementerat med polybren (slutlig koncentration = 5 | ig / ml) till 40 till 70% konfluenta Caco-2-celler. Skaka 24-brunnar försiktigt som beskrivs i 1.1.2.
- Övervaka deras genuttryck (Steg 2.1.10.) (Figur 2 botten4 paneler).
- Eftersom uttrycket av transgenen i allmänhet ihållande, behålla de omvandlade celler för framtida experiment och kontinuerligt övervaka deras genuttryck (Steg 2.1.10.).
- Seed humana embryonjur (HEK) 293T-celler i en 15 cm vävnadsodlingsskål (10% FBS i DMEM som deras tillväxtmedier).
3. Stimulera Lipoprotein Sekre
- Med de vanliga vävnadsodlingsskål
- Förbered en 100X lipidblandning genom blandning av 50 mg oljesyra, 40 mg lecitin och 48 mg natriumtaurokolat. Bringa volymen till 900 pl med PBS (tillräckligt för 8 rätter). Vortex lipidblandningen kraftigt.
- Lägg 900 pl av 100X lipidblandningen i 89,1 ml tillväxtmedium. Blanda och filtrera lipidinnehållande media. De slutliga koncentrationerna (1x) av oljesyra, lecitin, och natriumtaurokolat är 2,0 mM, 1,36 mM och 1,0 mM, respektive.
- Lägg 10 ml av lipidinnehållande media till cellerna.
- Inkubera cellerna med lipidinnehållande media för 4 h i en 37° C inkubator.
- Tvätta cellerna med PBS tre gånger.
- Lägg 10 ml av tillväxtmediet till cellerna för att samla lipoproteinet sekretion.
- Inkubera i 2 h i en 37 ° C inkubator.
- Samla lipoproteinet innehållande medium.
- Använda det permeabla membransystemet
- Följ steg 3.1.1-3.1.2 att förbereda lipidblandningen.
- Lägg 10 ml av lipidinnehållande media till den apikala kammaren och 10 ml av tillväxtmediet till den basolaterala kammaren.
- Inkubera i 4 h i en 37 ° C inkubator. Samla lipoproteinet innehållande media i den basolaterala kammaren.
4. lipoprotein Isolation (Figur 3)
- Avlägsna cellrester från lipoproteinet innehållande medium genom centrifugering (2000 x g under 5 min).
- Häll media till en 50 ml rör.
- Lägg 5,95 g natriumklorid till media.
- Om sample kommer att analyseras av TEM, tillsätt en proteasinhibitorcocktail tablett för att upprätthålla integriteten hos de lipoproteiner.
- Bringa volymen till 23 ml med vatten (1,2 g / ml NaCl-densitetslösning).
- Lös de lösta ämnena helt.
- Häll alla av lösningen i en polykarbonat ultracentrifugrör.
- Overlay försiktigt 1,2 g / ml densitet lösning med 0,5 ml vatten (1,0 g / ml densitet).
- Balans röret genom vikt och inte per volym.
- Försiktigt ladda rören i T865 rotorn.
- Snurra proverna i ultracentrifugen vid 429.460 xg under 24 h vid 4 ° C.
- Omedelbart isolera toppen 0,5 ml lösning genom försiktig pipettering. Håll röret så stilla som möjligt.
5. TEM-analys
- Bered 5 ml av 2% fosforvolframsyra (vikt / volym) och justera pH till 6,0.
- Filtrera den 2% fosforvolframsyra med en sprutfilter (porstorlek: 0,2 | j, m).
- Drop 20 ul av lipoprotein provet på en steril skål.
- Drop 20 pl av den filtrerade 2% fosfovolframsyra bredvid provet på samma skålen.
- Försiktigt släppa en EM rutnät med matta sidan vilar på provet.
- Inkubera vid rumstemperatur under 1 minut.
- Knacka försiktigt på sidan av EM rutnät på ett filterpapper för att ta bort provet från nätet.
- Försiktigt släppa EM rutnät med matta sidan vilar på 2% fosforsyra.
- Inkubera vid rumstemperatur under 1 minut.
- Knacka försiktigt på sidan av EM rutnät på ett filterpapper för att ta bort fosfovolframsyra från nätet.
- Med hjälp av en TEM, fånga bilder av lipoproteiner (Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar normala 13-dagar efter sammanflytande Caco-2-celler. Uppträdandet av kupolformade strukturer och intracellulära lipiddroppar är karakteristiska för differentierade Caco-2-celler. När de Caco-2-celler inte är dispergerade lika under sådd, kommer de klumpar och växa över i vissa delar av skålen; och det kommer att finnas ett fåtal områden i skålen utan celler. Virvlande och placera skålen på en lutande yta bör undvikas. Det är också viktigt att notera att efter-konfluenta Caco-2-celler är mer mottagliga för lösgöring när ny tillväxt medium tillsätts till cellerna alltför grovt. Därför bör de nya medierna tillsättas försiktigt för att förhindra cell lossnar.
Baserat på dessa studier, transfektionseffektiviteten av Caco-2-celler var mellan 30-60% (figur 2 toppanelerna). Däremot transduktionseffektiviteten av Caco-2 med användning av lentivirus-expressionssystemet var ungefär 100% (fig 2 Figur 2 visar också att den optimala mängden av koncentrerad lentivirus var 10 fil. De transducerade Caco-2-celler upprätthölls upp till 12 passager. Som visas, även efter 12 passager de omvandlade celler uttryckte fortfarande EGFP. Den transduktionseffektiviteten beror tydligt på lentivirus koncentrationen. Bekräftelsen av transfektion / transduktionseffektiviteten är kritisk, och bör utföras som en rutin preliminär analys innan själva experiment. Även Western blot-analys kan användas för att uppskatta ökningen av genuttryck procent, bör det inte vara den primära metoden för att fastställa transfektion / transduktionseffektiviteten.
Med användning av NaCl-densitetsgradient ultracentrifugeringsmetod (fig 3), lipoproteinerna utsöndras av Caco-2-celler isolerades och analyserades på en TEM. Några av de chylomikroner, lipoproteiner större än 80 nm i diameter, som visas i figur4. De mindre lipoproteiner, VLDLs, var också närvarande. Det är viktigt att bekräfta den framgångsrika isoleringen av både kylomikroner och VLDLs på en TEM. Som tidigare diskuterats 8, bör biokemisk analys inte vara den primära metoden för bekräftelse. Frånvaron av lipoproteiner, speciellt kylomikroner, indikerar att lipidtransport av Caco-2-celler är inte effektiv. Därför kommer de inte att fungera som en bra modell för att studera lipidtransport. Antalet kylomikron partiklar i förhållande till det totala antalet lipoproteinpartiklar kan räknas åtta. En stor andel anger effektiv lipidtransport.
Figur 1. Representativa mikrofotografi av 13-dagars post-konfluenta Caco-2-celler. Intracellulära lipiddroppar är synliga i vissa celler (röd pil). De unika kupolformade strukturer (svart pil) formed av några Caco-2-celler är i allmänhet närvarande endast efter det att cellerna har nått konfluens. Förstoring = 100X. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Jämförelse av effektiviteten av lipidbaserade transfektion och lentivirus expressionssystemet Topplatta:. Caco-2-celler transfekterades med pLL3.7 EGFP användning av den icke-liposomala transfektionsreagens (Skalstreck = 20 | im). Botten 4 paneler: Caco-2-celler transducerades med pLL3.7 EGFP med användning av lentivirus-expressionssystemet med olika mängder (1, 2, 5, eller 10 | il) av det koncentrerade lentivirus (LV). De visade cellerna var från 12: e passagen av de ursprungliga transducerade cellerna. Den vänstra panelen visar DAPI färgning, mitt paler visar GFP fluorescens, och de högra panelerna visar de sammanslagna bilderna. Den lentivirus expressionssystem var tydligen mer effektiv än lipid-baserade transfektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Isolering av intestinala lipoproteiner med användning av NaCl densitetsgradient-ultracentrifugering. Densiteten hos lipoprotein-innehållande mediet justeras till 1,2 g / ml genom tillsättning av den lämpliga mängden av NaCl. Volymen av provet måste också justeras så att den kommer att fylla hela ultracentrifugrör att förhindra kollaps. För att uppnå en densitetsgradient, är 0,5 ml vatten överskikt försiktigt på 1,2 g / ml densitet lösning. Provet får därefter centrifugerades vid 429.460 xg under 24 h med användning av en T865rötor (ekvivalent med 2,15 Svedberg-enheter). Tarm lipoproteiner bör omedelbart återvinnas genom försiktig pipettering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representativa elektronmikrofoto av lipoproteinerna som producerats av de Caco-2-celler. De lipoproteiner isolerade genom NaCl-densitet-gradient ultracentrifugering var negativt färgad med 2% fosforvolframsyra (pH 6,0). Kylomikroner, lipidpartiklar större än 80 nm i diameter, och VLDLs, de är mindre än 80 nm, båda är närvarande. Skala bar = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta dokument, för att de två systemen som kan användas bibehålla Caco-2-celler beskrivs, nämligen den vanliga vävnadsodlingsskålen och det permeabla membranet. Fördelarna med att använda det permeabla membransystemet innefattar separationen av den apikala och basolaterala facken, och förmågan att inkubera lipidblandningen och samla lipoproteinet sekre samtidigt. Emellertid, det permeabla membranet skären är dyra, och deras polykarbonatmembran tillåter inte god cell synlighet. En av fördelarna med detta in vitro-modell är att genetiska manipulations studier kommer att vara mer ekonomiskt och mindre tidskrävande. För bättre effektivitet bör lentivirus expressionssystem användas. De omvandlade Caco-2-celler upprätthåller generellt uttryck för deras transgen.
Förmågan hos Caco-2-celler för att producera kylomikroner är av största vikt. Utan denna förmåga skulle Caco-2-celler inte att kunna efficiently transportera lipofila material, inklusive, men inte begränsat till lipofil droger, vitamin A, D, E och K, och eventuella fettlösliga näringsämnen. De korrekta metoder för att utmana Caco-2-celler för att producera både VLDL partiklar och kylomikroner beskrivs. Den framgångsrika isoleringen av dessa lipoproteinpartiklar bör bekräftas på en TEM. Baserat på aktuell litteratur, erbjuder detta Caco-2-modellen den mest effektiva lipidtransport bland annat Caco-2 modeller 12-14. Men transporterar in vivo lymfan kanyle modellen fortfarande lipider mer effektivt än någon in vitro-modell. De bakomliggande orsakerna har nyligen diskuterats 8, nämligen på grund av Caco-2-celler producerar 2 olika isoformer av apolipoprotein B, Caco-2-celler kan inte syntetisera triglycerider från monoglycerider, och serumkomponent avgörande för kylomikron biogenes kan vara lägre i tillväxtmediet . Det är också viktigt att inse begränsningen av detta ivitro-modell; detta in vitro-modell utesluter vissa potentiella viktiga faktorer, såsom tarmmotilitet, anatomi av tarmen, och interaktionen med andra organsystem.
De viktigaste faktorerna som gör att Caco-2-celler för att producera kylomikroner är effektivt den typ / mängd av lipider som användes och cellulär differentiering 8. Utan rätt kombination av dessa faktorer, kommer Caco-2-celler inte producerar ett stort antal kylomikroner 8. Notera bör NaCl densitetsgradient ultracentrifugering utföras på rätt sätt. Den framgångsrika isoleringen av lipoproteiner beror på timing (omedelbar utan större dröjsmål), bra provhantering (robust utan mycket agitation), och noggrann pipettering (få bara det översta lagret). Korrekt teknik kan praktiseras genom användning av pre-färgade lipider för att hjälpa visualisera lipoproteinet skiktet 8. Förutom TEM, biokemiska analyser, dvs, apolipoprotein B och triglyceridanalyser, kan också vara Used att bekräfta framgångsrik isolering av lipoproteiner. Dessa biokemiska analyser, som vi tidigare har rapporterat 8, kan också fungera som metoder att kvantifiera absorption. Emellertid bör TEM fortfarande utföras på grund av tendensen hos lipoproteinerna att aggregera 2, vilket orsakar en potentiellt överskattning av chylomikron produktion.
Denna in vitro-modell är särskilt användbar för att studera fett absorption och intestinala absorptionen av lipofila läkemedel, vitaminer och andra lipid-lösliga näringsämnen. Den kan också tjäna som en modell för att förbättra dålig biotillgänglighet av orala lipofila läkemedel. Eftersom fettlösliga material är förpackade i kylomikroner från enterocyter för transport till cirkulationen kommer kylomikron producerande Caco-2-celler att bli mer effektiva i att absorbera lipofila läkemedel. Dessutom kan denna modell utredare att bestämma rollen av en specifik gen i läkemedelsabsorption genom tarmen (farmakogenetik). Den tillåter också ivestigators att jämföra effekten av olika kostfetter på oral lipofilt läkemedel biotillgänglighet. Alla dessa ansökningar har diskuterats tidigare 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | VWR | 16750-112 | Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells |
| FBS | Fisher | 3600511 | We do not heat inactivate our serum |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment |
| Permeable membrane system | Fisher | 7200173 | 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane |
| 10 cm dish | Fisher | 08-772-E | Tissue culture dish |
| 15 cm dish | Fisher | 08-772-24 | Tissue culture dish |
| 24 well plate | Fisher | 12565163 | Tissue culture plate |
| Lipid-based transfection reagent | Fisher | PRE2691 | Can be substituted with other transfection reagent |
| Reduced serum media | Invitrogen | 11058021 | For transfection |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Bottle-top filter | Fisher | 9761120 | 0.45 mm pore |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/ml |
| Oleic acid | Sigma | 01383-5G | Prevent freeze-thaw cycle |
| Lecithin | Fisher | IC10214625 | Egg lecithin |
| Sodium taurocholate | Fisher | NC9620276 | Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956 |
| Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) | Fisher | 5892791001 | Used mainly for samples that need TEM analysis |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Fisher | NC9696153 | Reusing it multiple times will collapse the tube |
| Lid for ultracentrifuge tube | Fisher | NC9796914 | A tool is required to remove the tube/lid from rotor |
| Syringe | Fisher | 50-949-261 | Disposable |
| Syringe filter | Fisher | 09-719C | Pore size = 0.2 mm; nylon |
| Phosphotungstic acid | Fisher | AC208310250 | For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0 |
| Tweezer | Fisher | 50-238-62 | Extra fine and strong tips |
| Formvar/carbon grid | Fisher | 50-260-34 | Formvar/carbon film square grid 400 Copper |
References
- Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
- Nauli, A. M., et al. CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine. Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).
- Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).
- Lo, C. -M., et al. Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).
- Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption. Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).
- Nauli, A. M., Nauli, S. M. Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability. Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).
- Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein. Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).
- Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiol Rep. 2 (6), (2014).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Pottekat, A., et al. Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release. Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).
- Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells. Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).
- Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).
- Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).
