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Bioengineering

सेल लेबलिंग और superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों के साथ लक्षित

Published: October 19, 2015 doi: 10.3791/53099
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 2,5, 1
1Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 2Division of Engineering, Mayo Clinic, 3School of Medicine, Pharmacy and Health, Durham University, 4Regional Center for Applied Molecular Oncology, Masaryk Memorial Cancer Institute, 5Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic

Abstract

कोशिकाओं और चिकित्सीय एजेंटों के लक्षित वितरण बंद लक्ष्य साइटों के लिए हानिकारक प्रभाव को कम करते हुए लक्ष्य साइट पर उपचारात्मक प्रभाव ध्यान केंद्रित करके जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला को लाभ होगा। चुंबकीय सेल को लक्षित एक कुशल, सुरक्षित, और सीधा प्रसव तकनीक है। Superparamagnetic लोहे के आक्साइड नैनोकणों (SPION) biocompatible, biodegradable हैं, और चुंबकीय क्षेत्र के लिए उत्तरदायी उन्हें प्रस्तुत करने के लिए कोशिकाओं में endocytosed जा सकता है। संश्लेषण की प्रक्रिया मैग्नेटाइट (फ़े 3 हे 4) का निर्माण शामिल है एक पाली (लैक्टिक-सह-एसिड) (पीएलजीए) कोटिंग के रूप में करने के लिए उच्च गति पायसीकरण द्वारा पीछा नैनोकणों। पीएलजीए-मैग्नेटाइट SPIONs लगभग 10 एनएम व्यास मैग्नेटाइट कोर सहित व्यास में लगभग 120 समुद्री मील दूर हैं। संस्कृति के माध्यम में रखा है, SPIONs स्वाभाविक रूप से कोशिकाओं द्वारा endocytosed और cytoplasmic endosomes के भीतर छोटे समूहों के रूप में जमा हो जाती है। इन कणों की कोशिकाओं के लिए पर्याप्त चुंबकीय द्रव्यमान प्रदानचुंबकीय क्षेत्र के भीतर लक्षित करने के लिए अनुमति देने के लिए। कई सेल छँटाई और लक्ष्य अनुप्रयोगों चुंबकीय क्षेत्र के लिए उत्तरदायी विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं प्रतिपादन से सक्षम हैं। SPIONs के रूप में अच्छी तरह से ट्यूमर चिकित्सा या ऊतक टांका लगाने के लिए स्थानीय अतिताप के एक मेडिकल इमेजिंग विपरीत एजेंट के रूप में उपयोग करते हैं, लक्षित दवा या जीन वितरण, नैदानिक ​​assays, और पीढ़ी सहित अन्य जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक किस्म है।

Protocol

मैग्नेटाइट जेल 1. संश्लेषण

  1. एथिल शराब के बाद विआयनीकृत पानी के बाद केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग करके सभी कांच के बने पदार्थ को धो लें। अधिमानतः एक सुखाने ओवन में हे / एन सूखे की अनुमति दें।
    चेतावनी! हाइड्रोक्लोरिक एसिड हानिकारक है - एक धूआं हुड में व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और काम पहनते हैं; एथिल शराब हानिकारक है - व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने।
  2. डी-गैस के लिए विआयनीकृत एच 2 ओ की 500 मिलीलीटर धीरे 30 मिनट के लिए एन 2 गैस बुदबुदाती द्वारा एक Dreschel बोतल का उपयोग करें।
  3. सेट अप एक रासायनिक धूआं हुड के भीतर मैग्नेटाइट संश्लेषण उपकरण।
    1. एक isomantle हीटर के भीतर एक 500 मिलीलीटर तीन गर्दन दौर नीचे कुप्पी प्लेस और एक क्लैंप का उपयोग करते हुए केंद्र गर्दन को सुरक्षित और खड़े हो जाओ।
    2. दौर नीचे कुप्पी की ओर गर्दन में से एक में एक रबर पट और शेष ओर गर्दन में एक रबर पट के साथ एक भाटा कंडेनसर स्थापित करें। लगातार भाटा कंडेनसर के माध्यम से ठंडे पानी चला रहे हैं।
    3. पंचर वेंई दौर नीचे कुप्पी के रबर एक एन 2 गैस लाइन से जुड़ा एक सुई के साथ पट और एक bubbler के लिए चल रहे एक गैस लाइन से जुड़ा एक सुई के साथ भाटा कंडेनसर के रबर पट पंचर (यानी, पानी के साथ कुप्पी) गैस बहिर्वाह कल्पना करने के लिए।
    4. एक चप्पू एडाप्टर के माध्यम दौर नीचे कुप्पी के केंद्र गर्दन में एक ब्लेड चप्पू स्थापित करें। एक स्टैंड पर मुहिम शुरू की भूमि के ऊपर एक दोषी को ब्लेड चप्पू शाफ्ट संलग्न।
  4. एन 2 गैस के साथ दौर नीचे कुप्पी मिटाएँ और एक कम है, लेकिन पता लगाने योग्य दर पर बहने एन 2 गैस छोड़ दें।
  5. दौर नीचे कुप्पी से भाटा कंडेनसर निकालें और लोहे (तृतीय) क्लोराइड, लोहे की 0.6125 ग्राम (द्वितीय) क्लोराइड tetrahydrate की 1.000 ग्राम जोड़ने के लिए, और डी-मार डाला एच 2 ओ के 50 मिलीलीटर
    चेतावनी! लोहे (तृतीय) क्लोराइड और आयरन (II) क्लोराइड tetrahydrate हानिकारक हैं - व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने।
  6. 50 के लिए हीटिंग, जबकि भाटा कंडेनसर बदलें और 1000 rpm पर हलचलसी। इन परिस्थितियों में सरगर्मी 10 एनएम व्यास मैग्नेटाइट नैनोकणों पैदा करता है।
  7. एक बार 50 डिग्री सेल्सियस पर, अभी भी सरगर्मी जबकि दौर नीचे फ्लास्क में रबर पट के माध्यम से इंजेक्शन लगाने के द्वारा 28% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
    चेतावनी! अमोनियम हाइड्रॉक्साइड हानिकारक है - व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने।
    नोट: अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान मैग्नेटाइट वेग के लिए प्रयोग किया जाता है और समाधान काला बारी चाहिए।
  8. अभी भी सरगर्मी जबकि अमोनिया गैस बंद फोड़ा करने के लिए 90 डिग्री सेल्सियस के दौर नीचे कुप्पी और गर्मी से रबर पट और एन 2 गैस लाइन निकालें।
    नोट: यह भाटा कंडेनसर के रबर पट puncturing द्वारा दौर नीचे फ्लास्क में एन 2 के प्रवाह को बनाए रखने के लिए वैकल्पिक है, तथापि, maghemite को मैग्नेटाइट के ऑक्सीकरण इस कदम के दौरान नगण्य है।
  9. अभी भी सरगर्मी जबकि एक बार 90 डिग्री सेल्सियस पर, दौर नीचे फ्लास्क ओलिक एसिड के 1 मिलीलीटर जोड़ें। ओलिक एसिड ना कोट करने के लिए मैग्नेटाइट प्रयोग किया जाता हैnoparticles मैग्नेटाइट जेल बनाने के लिए।
    चेतावनी! ओलिक एसिड हानिकारक है - व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने।
  10. दौर नीचे कुप्पी पर रबर पट और एन 2 गैस लाइन बदलें और भाटा कंडेनसर हटा दें।
  11. 2 घंटे के लिए 500 rpm पर गर्मी और हलचल को बंद कर दें।
  12. Isomantle हीटर से दौर नीचे कुप्पी निकालें और मैग्नेटाइट जेल बनाए रखने के लिए कुप्पी के नीचे के खिलाफ आयोजित एक मजबूत चुंबक का उपयोग करते समय किसी भी शेष तरल छानना।
    चेतावनी! क्षति या चोट से बचने के लिए अत्यधिक ध्यान के साथ मजबूत चुंबक संभाल।
  13. (वैकल्पिक) / एन हवा शुष्क हे मैग्नेटाइट जेल की अनुमति दें।

मैग्नेटाइट जेल 2. शुद्धीकरण

  1. मैग्नेटाइट जेल भंग करने दौर नीचे फ्लास्क में हेक्सेन के 40 मिलीलीटर जोड़ें
    चेतावनी! हेक्सेन हानिकारक है - एक धूआं हुड में व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और काम पहनते हैं।
  2. अवशिष्ट एच 2 ओ fro दूर करने के लिए डी-मार डाला एच 2 ओ के 40 मिलीलीटर के साथ एक जुदा कीप का प्रयोग करेंमैग्नेटाइट समाधान हूँ।
    1. धीरे धीरे जुदा कीप भीतर एच पर मैग्नेटाइट समाधान 2 हे डालो और धीरे 5 मिनट के लिए दो चरण तरल ज़ुल्फ़।
    2. बाहर नाली और कम जलीय अंश त्यागें।
    3. धीरे धीरे मैग्नेटाइट समाधान के नीचे बैठती है कि इस तरह जुदा कीप करने के लिए डी-मार डाला एच 2 ओ के 40 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे चक्कर आने और पहले की तरह नाली।
    4. तीसरी बार धोने के लिए दोहराएँ।
  3. , एक Erlenmeyer फ्लास्क को मैग्नेटाइट समाधान स्थानांतरण निर्जल सोडियम सल्फेट के लायक कुछ spatulas जोड़ने के लिए, और चक्कर आने मैग्नेटाइट समाधान से किसी भी शेष अवशिष्ट एच 2 ओ दूर करने के लिए।
  4. सोडियम सल्फेट और अवशिष्ट एच 2 ओ दूर करने के लिए एक फिल्टर कीप में 1 माइक्रोन फिल्टर पेपर के माध्यम से मैग्नेटाइट समाधान फ़िल्टर
    नोट: वैक्यूम सहायता की सिफारिश की है।
  5. एक 50 मिलीलीटर वाष्पन फ्लास्क मैग्नेटाइट समाधान स्थानांतरण और के लिए हेक्सेन लुप्त हो जाना एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोगनिम्न शर्तों के साथ 2 घंटे: मध्यम घूर्णन गति, वैक्यूम एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कुप्पी वाष्पन, आवेदन किया है, और 24 डिग्री सेल्सियस पानी के कंडेनसर के माध्यम से घूम।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, पीएलजीए के साथ कोटिंग करने से पहले मैग्नेटाइट जेल की दुकान।

पीएलजीए शैल के साथ मैग्नेटाइट नैनोकणों 3. कोटिंग

  1. एक 1.5% (एम / वी) समाधान बनाने के लिए एथिल एसीटेट की 240 मिलीलीटर में पीएलजीए की 3.60 ग्राम (75/25 मिश्रण) भंग। चेतावनी: एथिल एसीटेट हानिकारक है - एक धूआं हुड में व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और काम पहनते हैं।
  2. एक 5.0% (एम / वी) समाधान बनाने के लिए एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर de-मार डाला एच 2 ओ की 500 मिलीलीटर में Pluronic एफ 127 की 25.00 ग्राम भंग।
    नोट: Pluronic एफ 127 एक biocompatible surfactant के रूप में कार्य करता है कि एक गैर ईओण amphiphilic ब्लॉक copolymer है। यह कदम 3.3.2 में तेल-में-पानी पायस को स्थिर करने में मदद करता है।
  3. एक microspatula का उपयोग करना, भारित कांच की शीशियों के भीतर छह 0.040 ग्राम aliquots में मैग्नेटाइट जेल इकट्ठा। Perfप्रत्येक विभाज्य निम्नलिखित कोटिंग और कपड़े धोने की प्रक्रिया Orm।
    नोट: aliquots चरण 4 में गिरावट से पहले फ्रीज सुखाने को कम करते हुए पवित्रता और उपज को अधिकतम जाएगा, जो कुशल हैंडलिंग और चुंबकीय निस्तारण सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं।
    1. 10 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर में एक 0.040 ग्राम मैग्नेटाइट जेल से विभाज्य और एक प्लास्टिक बीकर और sonicate को पीएलजीए समाधान के 40 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. प्लास्टिक बीकर Pluronic समाधान के 80 मिलीलीटर जोड़ें और 7 मिनट एक तेल में पानी पायस रूप मैग्नेटाइट नैनोकणों पर पीएलजीए कोटिंग के रूप में करने के लिए तुरंत उच्चतम सेटिंग में एक प्रयोगशाला मिक्सर के साथ पायसी।
    3. इसके तत्काल बाद एथिल एसीटेट लुप्त हो जाना एक रासायनिक धूआं हुड में 1 घंटे के लिए विआयनीकृत एच 2 ओ और sonicate का 1 एल में SPION समाधान पतला।
    4. SPION समाधान करने के लिए अगले एक मजबूत चुंबक प्लेस और धीरे चुंबक पर भूरा SPIONs इकट्ठा करने के लिए हलचल।
      नोट: यह रहकर कई घंटे के लिए हलचल करने के लिए आवश्यक हो सकता हैसमाधान से पहले एस SPIONs का सबसे एकत्र किया गया है कि यह दर्शाता है श्वेताभ बदल जाता है।
    5. चुंबक के साथ बीकर में SPIONs बनाए रखते हुए जलीय समाधान छानना।
    6. इस प्रकार के रूप SPIONs तीन बार धोएं।
      1. विआयनीकृत एच 2 ओ का 1 एल में SPIONs निलंबित
      2. 20 मिनट के लिए SPION समाधान Sonicate।
      3. SPION समाधान करने के लिए अगले एक मजबूत चुंबक प्लेस और धीरे चुंबक पर भूरा SPIONs इकट्ठा करने के लिए हलचल। यह समाधान SPIONs का सबसे एकत्र किया गया है यह दर्शाता है कि स्पष्ट बदल जाता है से पहले रुक-रुक कर कई घंटे के लिए हलचल करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
      4. चुंबक के साथ बीकर में SPIONs बनाए रखते हुए जलीय समाधान छानना।
  4. एक जलीय निलंबन के रूप में एक भी भारित कांच की शीशी में छह मैग्नेटाइट जेल aliquots में से प्रत्येक से संश्लेषित SPIONs लीजिए। जरूरत के रूप में वैकल्पिक रूप से चुंबकीय अतिरिक्त पानी छानना।

4. रुकSPIONs की -drying

  1. SPION समाधान रुक।
  2. रुक सूखे के एक lyophilizer में SPION समाधान हे / एन।
  3. फ्रीज सूखे SPIONs वजन। सेल लेबलिंग के लिए प्रयोग किया जाता है जब तक फ्रीज सूखे SPIONs -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    नोट: -20 डिग्री सेल्सियस नाटकीय रूप से भंडारण गिरावट कैनेटीक्स कम कर देता है और शेल्फ जीवन बढ़ता है।

SPIONs के साथ कोशिकाओं के 5. लेबलिंग

  1. 40 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में SPIONs के एक विभाज्य सस्पेंड और 30 मिनट के लिए sonicate।
  2. सेल संस्कृति के माध्यम से 5 μl / एमएल की एकाग्रता में कोशिकाओं की एक लगभग मिला हुआ फ्लास्क SPION समाधान जोड़ें। धीरे कुप्पी कमाल ने भी वितरण सुनिश्चित करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. धीरे संस्कृति के माध्यम महाप्राण और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
  5. चुंबकीय लेबल की कोशिकाओं को इकट्ठा करने और प्रयोगों के लिए इस्तेमाल करते हैं।
  6. अप्रयुक्त SPION समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है और हमें होना चाहिएकुछ ही महीनों के भीतर एड। प्रत्येक उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए Sonicate।

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Representative Results

मैग्नेटाइट नैनोकणों 50 डिग्री सेल्सियस और 1000 आरपीएम (चित्रा 1) में लोहा (तृतीय) क्लोराइड और आयरन (II) क्लोराइड tetrahydrate का एक जलीय समाधान सरगर्मी का एक परिणाम के रूप में व्यास में लगभग 10 एनएम हैं। इन परिणामों के मैग्नेटाइट नैनोकणों के सफल संश्लेषण प्रदर्शित करता है। यह पहली बार के लिए संश्लेषण का प्रयास करते समय बैच का एक छोटा सा नमूना से लिया मैग्नेटाइट नैनोकणों के आकार और आकार को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) इन कणों दृश्यमान करने के लिए पसंदीदा तरीका है। बैच खारिज किया जाना चाहिए और मैग्नेटाइट नैनोकणों व्यास में नहीं लगभग 10 समुद्री मील दूर हैं और अगर चित्रा 1 में गोलाकार रूप में दिखाया गया संश्लेषण फिर से प्रयास किया जाना चाहिए।

120 एनएम (चित्रा 2) की एक व्यास के साथ पीएलजीए-मैग्नेटाइट SPIONs में एक उच्च गति पायसीकारकों परिणामों का उपयोग पीएलजीए के साथ मैग्नेटाइट नैनोकणों कोटिंग। इन परिणामों के सफल प्रदर्शितपीएलजीए-मैग्नेटाइट SPIONs के संश्लेषण। यह पहली बार के लिए संश्लेषण का प्रयास करते समय बैच का एक छोटा सा नमूना से लिया पीएलजीए-मैग्नेटाइट SPIONs के आकार और आकार को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) इन कणों दृश्यमान करने के लिए पसंदीदा तरीका है। बैच खारिज किया जाना चाहिए और पीएलजीए-मैग्नेटाइट SPIONs 120 व्यास में एनएम और चित्रा 2 में दिखाया गया है बड़े या छोटे कणों कुछ अनुप्रयोगों के लिए वांछनीय हो सकता है गोलाकार।, रचना अज्ञात होगा नहीं लगभग रहे हैं, तो संश्लेषण फिर से प्रयास किया जाना चाहिए और इसलिए लेबलिंग, चुंबकीय संवेदनशीलता सेल, और cytotoxicity अप्रत्याशित हो जाएगा।

नैनोकणों के endocytosis में 16 घंटा परिणाम (चित्रा 3) के लिए SPIONs के साथ खून परिणाम endothelial कोशिकाओं के ऊष्मायन। इन परिणामों के SPIONs के साथ कोशिकाओं के सफल लेबलिंग प्रदर्शित करता है। से लिया कोशिकाओं के भीतर SPIONs की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण हैबैच का एक छोटा सा नमूना पहली बार के लिए लेबलिंग का प्रयास करते। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इन SPION लेबल की कोशिकाओं दृश्यमान करने के लिए पसंदीदा तरीका है। कोशिकाओं खारिज किया जाना चाहिए और लेबलिंग 3 चित्र में दिखाया गया है पीएलजीए-mangetite SPIONs साइटोप्लास्मिक endosomes के भीतर एक साथ क्लस्टर काले कण दौर के रूप में प्रकट नहीं करते हैं तो फिर से प्रयास किया जाना चाहिए। इसके अलावा, SPIONs की कम सांद्रता को निशाना चुंबकीय सेल सक्षम करने के लिए विफल हो सकता है और SPIONs की उच्च सांद्रता साइटोटोक्सिक हो सकता है। यदि आवश्यक हो, लेबल कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया SPIONs की एकाग्रता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।

कोशिकाओं में भरी हुई लोहे की मात्रा लौह प्रत्यारोपण चिकित्सा उपकरणों (चित्रा 4) के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं की चुंबकीय कब्जा प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है। इन परिणामों के सफल SPION की मध्यस्थता चुंबकीय सेल लक्ष्यीकरण प्रदर्शित करता है। प्रभाव को निशाना बनाने के लिए एक मजबूत सेल वांछित है, पसंदीदा रणनीति increa के लिए हैउत्पन्न या लागू चुंबकीय क्षेत्र 8,30 की ताकत या ढाल से। लेबल कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया SPIONs की एकाग्रता में वृद्धि के कारण ही cytotoxicity चिंताओं के लिए एक अंतिम उपाय के रूप में करने की कोशिश की जानी चाहिए। में सुधार सेल व्यवहार्यता वांछित है, लेबल कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया SPIONs की एकाग्रता में कमी आनी चाहिए।

चित्र 1
संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) के रूप में देखा मैग्नेटाइट नैनोकणों चित्रा 1. मंदिर छवि। मैग्नेटाइट नैनोकणों व्यास में लगभग 10 एनएम हैं। कण आकार में गोलाकार और एक समान हैं। स्केल बार = 100 एनएम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2 इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) स्कैनिंग के रूप में देखा /> चित्रा 2. पीएलजीए-मैग्नेटाइट SPIONs की SEM छवि। पीएलजीए लेपित मैग्नेटाइट SPIONs व्यास में लगभग 120 समुद्री मील दूर हैं। कण आकार में गोलाकार और एक समान हैं। स्केल बार = 500 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
एक चुंबकीय लेबल endothelial सेल की चित्रा 3. मंदिर छवि। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) द्वारा कल्पना एक चुंबकीय लेबल रक्त परिणाम endothelial सेल। SPIONs स्वाभाविक रूप से कोशिकाओं द्वारा endocytosed और cytoplasmic endosomes भीतर छोटे समूहों में जमा हो जाती है। वाम पैमाने बार = 2 माइक्रोन और सही पैमाने बार = 0.5 माइक्रोन। 24 से अनुमति के साथ फिर से प्रिंट।/files/ftp_upload/53099/53099fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चुंबकीय सेल पर कब्जा चित्रा 4 प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि। चुंबकीय लेबल endothelial कोशिकाओं एक गैर चुंबकीय स्टेंट (बाएं) की तुलना में काफी उच्च दर पर एक ferromagnetic संवहनी स्टेंट (दाएं) की ओर आकर्षित कर रहे हैं। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन =। फिर से प्रिंट 24 से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

किसी भी nanoparticle संश्लेषण प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, अभिकारक रसायनों की पवित्रता न्यूनतम साइटोटोक्सिक प्रभाव पड़ेगा कि उच्च गुणवत्ता SPIONs को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह ओलिक एसिड (≥99%), आयरन (II) क्लोराइड tetrahydrate (≥99.99%), लोहा (तृतीय) क्लोराइड (≥99.99%), एथिल एसीटेट सहित बहुत शुद्ध अभिकर्मकों की खरीद करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है (एचपीएलसी ग्रेड, ≥99.9% ), हेक्सेन (एचपीएलसी ग्रेड, ≥97.0%), अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (≥99.99%), और सोडियम सल्फेट (≥99.0%)। यह अपेक्षाकृत महंगा हो सकता है, जो बहुत शुद्ध और उच्च गुणवत्ता पीएलजीए, खरीद करने के लिए विशेष महत्व का है। इसके अलावा, सभी कांच के बने पदार्थ को अच्छी तरह से हाइड्रोक्लोरिक एसिड, विआयनीकृत पानी, और एथिल शराब के साथ धोया और उपयोग करने से पहले सूखे की अनुमति दी जानी चाहिए।

इसी प्रकार, प्रोटोकॉल के भीतर शुद्धि और वाशिंग चरणों अंतिम SPIONs उच्च गुणवत्ता का हो और कम से कम साइटोटोक्सिक प्रभाव पड़ेगा यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। मैग्नेटाइट जेल से मुक्त होना चाहिएपीएलजीए के साथ कोटिंग से पहले संभव के रूप में ज्यादा अमोनियम हाइड्रॉक्साइड, पानी, और हेक्सेन के रूप में। तदनुसार, प्रोटोकॉल के ज्यादा मैग्नेटाइट जेल की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए समर्पित है। बाद में, पीएलजीए-मैग्नेटाइट SPIONs एथिल एसीटेट, Pluronic, और अतिरिक्त पीएलजीए से मुक्त होना चाहिए। अंतिम SPION धोने कदम प्रोटोकॉल के हिस्से को सबसे अधिक समय लेने हैं, लेकिन उच्च शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए पूरा किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, प्रत्येक धोने कदम दौरान कणों की चुंबकीय संग्रह बहुत समय लगता हो सकता है। समाधान सरगर्मी बहुत कण संग्रह की गति बढ़ा सकते हैं, लेकिन चुंबकीय हलचल सलाखों इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। एक कम गति पर परिचालन ओवरहेड stirrers तेजी कण संग्रह के लिए सबसे प्रभावी साधन हैं। SPIONs की एक बड़ी भूरा संग्रह सुनिश्चित चुंबक पर दिखाई देता है और समाधान decanting से पहले सफेद या स्पष्ट दिखाई देता है। इस बार सरगर्मी के कई घंटे की आवश्यकता होती है सकते हैं, लेकिन एक उच्च अंतिम उपज में परिणाम होगा। चुंबकीय निस्तारण कदम भी केवल magn सुनिश्चित करने के लिए की सेवासभी गैर-चुंबकीय सामग्री खारिज कर रहे हैं, जबकि etic कणों को रखा जाता है।

अत्यधिक लोहे के स्तर साइटोटोक्सिक किया जा सकता है, तो इस तकनीक का उपयोग कर एक सेल को दिया जा सकता है कि चुंबकीय द्रव्यमान की मात्रा सीमित है। लोहे की एकाग्रता विशेष रूप से संवेदनशील प्रकार की कोशिकाओं के लिए कम या विशेष रूप से कमजोर चुंबकीय क्षेत्र के लिए वृद्धि की जरूरत हो सकती है, लेकिन यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सुरक्षा और प्रभावकारिता को संतुलित करने के लिए एक सिद्ध प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल के द्वारा संश्लेषित SPIONs पीएलजीए के लिए मैग्नेटाइट के द्रव्यमान से एक 01:15 के अनुपात के साथ एक समाधान से बना रहे हैं और SPIONs सेल संस्कृति के माध्यम से 200 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में कोशिकाओं के लिए पेश कर रहे हैं। इन मानकों में से या तो आवश्यक के रूप में प्रत्येक कोशिका से endocytosed लोहे की मात्रा को बदलने के लिए समायोजित किया जा सकता है।

SPIONs मानव आरोपण के लिए सुरक्षित कर रहे हैं और समय (लगभग 40-50 दिनों के आधे जीवन) 31 से अधिक biodegrade होगा। मैग्नेटाइट और पीएलजीए दोनों हानिरहित degrad फार्मव्यावहारिक उत्पादों और प्राकृतिक रास्ते 32 के माध्यम से शरीर से बाहर हो रहे हैं। SPIONs के लिए biodegradable प्रकृति किसी साइटोटोक्सिक प्रभाव समय के साथ कम हो जाएगा मतलब है, लेकिन यह भी कुछ ही महीनों से परे अपने चुंबकीय गुणों को बनाए रखने के लिए कोशिकाओं की आवश्यकता नहीं है कि उन लोगों के लिए संभावित अनुप्रयोगों को सीमित करता है। SPIONs भी कोशिकाओं लेबलिंग और सतह प्रोटीन के लिए आवश्यकता के बिना अपने चुंबकीय प्रभाव प्रदान करने और न ही जैविक वातावरण 33,34 के लिए जोखिम पर एक प्रोटीन प्रभामंडल के गठन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं कि ligands को निशाना बनाने का फायदा है।

कोशिकाओं के लिए चुंबकीय गुण प्रदान लक्षित सेल वितरण की आवश्यकता होती है या 29 छँटाई जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों का एक व्यापक सरणी के लिए उपयोगी है। सेल प्रकार की एक किस्म को सुरक्षित रूप से mesenchymal स्टेम सेल 35, endothelial पूर्वज कोशिकाओं 36, बीटा आइलेट कोशिकाओं को 37, और तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को 38 सहित SPIONs endocytose करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है। चुंबकीय सेलएल लक्ष्यीकरण वितरण की स्थिति पर नियंत्रण का एक उच्च डिग्री आवश्यक है जब तकनीक को निशाना अन्य सेल से अधिक पसंद किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metal basis Sigma-Aldrich 338818-100ML  Harmful reagent - wear personal protective equipment
Dreschel bottle, 500 ml Ace Glass 5516-16
Ethyl Acetate, CHROMASOLVR Plus, for HPLC, 99.9%  Sigma-Aldrich 650528-1L Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Harmful reagent - wear personal protective equipment
Evaporating flask, 50 ml, 24/40 joint Sigma-Aldrich Z515558 For use with rotoevaporator
Filter paper, 3 cm dia, grade 1 Fisher 09-805P For use with glass filter funnel
Glass beakers, 1 L Fisher FB-101-1000 For washing SPIONs
Glass filter funnel, vacuum hose adapter, fits 24/40, 30 mL Fisher K954100-0344 
Glass vial caps Fisher 03-391-46 For use with glass vials
Glass vials, 2 ml Fisher 03-391-44 For collecting magnetite gel & SPIONs
Hexane, CHROMASOLVR, for HPLC, ≥97.0% (GC) Sigma-Aldrich 34859-1L  Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758 Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Iron(II) chloride tetrahydrate, ≥99.99% trace metals basis  Sigma-Aldrich 380024-5G Harmful reagent - wear personal protective equipment
Iron(III) chloride anhydrous, powder, ≥99.99% trace metals basis Sigma-Aldrich 451649-1G Harmful reagent - wear personal protective equipment
Isomantle heater, 500 mL Voight Global EM0500/CEX1
Laboratory mixer Silverson L5M-A
Lyophilizer Labconco 7670520
Microspatulas Fisher 21-401-25A For transfering magnetite gel
NdFeB magnet, 1 in x 1 in x 1 in Amazing Magnets C1000H-M Very strong magnet, handle with care
Oleic acid, ≥99% (GC) Sigma-Aldrich O1008-5G  Store in freezer; Harmful reagent - wear personal protective equipment
Overhead stirrer IKA 2572201
Overhead stirrer clamp IKA 2664000 For use with overhead stirrer
Overhead stirrer H-stand IKA 1412000 For use with overhead stirrer
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010-023
Plastic beakers, 250 ml Fisher 02-591-28
PLGA PURASORB PDLG (75/25 blend) Purac PDLG 7502 PDLG 7502A may be used as well; Store in freezer
Pluronic F-127 powder, BioReagent, suitable for cell culture Sigma-Aldrich P2443-250G 
PTFE expandable blade paddle, 8 mm dia SciQuip SP4018
PTFE vessel adapter, fits 24/40, 8 mm dia paddle Monmouth Scientific PTFE Vessel Adaptor A480 For use with PTFE expandable blade paddle
Recirculating chiller Clarkson 696613 For use with rotoevaporator
Reflux condenser, fits 24/40, 250 mm Ace Glass 5997-133
Rotoevaporator Clarkson 216949
Rubber septa, fits 24/40 Ace Glass 9096-56
Separatory funnel with stopper, 250 ml Fisher 10-438E
Sodium sulfate ACS reagent, ≥99.0%, anhydrous, granular Sigma-Aldrich 239313-500G 
Three neck round bottom flask, angled, 24/40 joints, 500 ml Ace Glass 6948-16
Ultrasonic cleaner perforated pan Fisher 15-335-20A For use with ultrasonic cleaner
Ultrasonic cleaner, 2.8 L Fisher 15-335-20
Vacuum controller Clarkson 216639 For use with rotoevaporator (optional)
Vacuum pump Clarkson 219959 For use with rotoevaporator

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 104 समचुंबक चुंबकीय SPION पीएलजीए मैग्नेटाइट फे Ferrofluid biodegradable कब्जा वितरण छँटाई
सेल लेबलिंग और superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों के साथ लक्षित
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Tefft, B. J., Uthamaraj, S., Harburn, J. J., Klabusay, M., Dragomir-Daescu, D., Sandhu, G. S. Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (104), e53099, doi:10.3791/53099 (2015).

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