Abstract
細胞および治療剤の標的化送達は、オフターゲット部位への悪影響を最小限に抑えながら、標的部位で治療効果を集中することにより、生物医学的用途の広い範囲に利益をもたらします。磁気細胞標的化は、効率的で、安全で、簡単な配信技術です。超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPION）は、生体適合性、生分解性であり、および磁界に応答してレンダリングするために細胞内に取り込ませることができます。合成プロセスは、マグネタイト鉄（Fe 3 O 4）を作成することを含む、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）コーティングを形成するために、高速乳化続いナノ粒子。 PLGA-マグネタイトSPIONsは約10 nmの直径のマグネタイトコアを含む直径約120nmです。培養培地中に置かれたとき、SPIONsは、天然細胞によってエンドサイトーシスおよび細胞質エンドソーム内の小さなクラスターとして記憶されます。これらの粒子は、細胞に十分な磁気質量を与え磁場内にターゲットを可能にします。多数の細胞選別とターゲットアプリケーションは、磁場に反応する様々な細胞型をレンダリングすることで有効になっています。 SPIONsは、同様に、腫瘍の治療または組織はんだ付けのための医療用イメージング造影剤として使用する、標的薬物や遺伝子デリバリー、診断アッセイ、およびローカル温熱療法の生成を含む他の生物医学的用途の多様性を持っています。
Protocol
マグネタイトゲルの合成1。
- エチルアルコールが続く脱イオン水、続いて濃塩酸を使用して、すべてのガラス器具を洗ってください。好ましくは乾燥炉中で、O / Nを乾燥することができます。
注意！塩酸は危険です - ドラフト内で個人用保護具や作業を着用。エチルアルコールは有害である - 個人用保護具を着用します。 - 脱ガス、脱イオンH 2 Oを 500ミリリットルを静かに30分間N 2ガ スをバブリングすることによりDreschelボトルを使用してください。
- セットアップマグネタイト合成装置を化学ヒュームフード内。
- isomantleヒーター内500mlの三口丸底フラスコを置き、クランプを使用して、中央の口を確保し、スタンド。
- 丸底フラスコの側面口の1つ、残りの側の首にゴム隔壁を還流冷却器にゴム隔膜を取り付けます。連続還流冷却器を通して冷たい水を実行します。
- パンク番目N 2ガ スラインに接続された針を用いて電子丸底フラスコのゴム隔壁とガス流出を可視化するためにバブラー（水とのすなわち、フラスコ）に実行されているガスラインに接続された針で還流冷却器のゴム隔膜を穿刺。
- パドルアダプタを介して丸底フラスコの中央の口にブレードパドルを取り付けます。スタンドに取り付けられたオーバーヘッドスターラーをブレードパドルのシャフトを取り付けます。
- N 2ガ スを用いた丸底フラスコをパージし、低いが検出速度で流れるN 2ガ スを残します。
- 丸底フラスコから還流冷却器を取り外し、塩化鉄（III）、鉄の0.6125グラム（II）塩化物水和物の1.000グラムを追加し、脱気H 2 Oの50ミリリットル
注意！塩化鉄（III）および塩化鉄（II）四水和物は、有害である - 個人用保護具を着用します。 - 50に加熱しながら還流冷却器を取り付け、1000rpmで攪拌°C。これらの条件下で攪拌すると、10 nmの直径のマグネタイトナノ粒子を生成します。
- 一旦、50℃で、さらに攪拌しながら丸底フラスコにゴム隔膜を介して注入することにより、28％水酸化アンモニウム溶液10mlを加えます。
注意！水酸化アンモニウムは有害である - 個人用保護具を着用します。
注：水酸化アンモニウム溶液は、マグネタイトを沈殿させるために使用され、溶液が黒くなるべきです。 - まだ攪拌しながらアンモニアガスを沸騰する90℃に丸底フラスコと熱からゴム隔壁および N 2ガ スラインを外します。
注：これは、還流冷却器のゴム隔壁を穿刺することにより、丸底フラスコに、N 2の流れを維持するために、任意である、しかし、マグヘマイトへの磁鉄鉱 の酸化は、このステップの間に無視できるものです。 - いったん90℃でまだ攪拌しながら、丸底フラスコにオレイン酸の1ミリリットルを追加します。オレイン酸は、マグネタイトNA被覆するために使用されていますマグネタイトのゲルを形成するnoparticles。
注意！オレイン酸は有害である - 個人用保護具を着用します。 - 丸底フラスコにゴム隔壁および N 2ガ スラインを交換し、還流冷却器を取り外します。
- 熱をオフにして、2時間、500rpmで攪拌します。
- isomantleヒーターからの丸底フラスコを取り外し、マグネタイトゲルを保持するために、フラスコの底に対して保持強力な磁石を使用している間、残りの液体をデカント。
注意！損傷または傷害を避けるために、細心の注意を持つ強力な磁石を処理します。 - 空気乾燥O / N（オプション）にマグネタイトゲルを許可します。
マグネタイトゲルの2精製
- マグネタイトゲルを溶解させた丸底フラスコに、ヘキサン40 mlを加え
注意！ヘキサンは有害である - ドラフト内で個人用保護具と仕事を着用してください。 - 残留H 2 Oあちこち除去するために、脱気の H 2 O 40mLで分液漏斗を使用してくださいマグネタイト溶液メートル。
- ゆっくりと分液漏斗内のH 2 Oにマグネタイト液を注ぎ、軽く5分間二相液体を旋回。
- 外排出し、下部の水部分を破棄します。
- ゆっくりマグネタイトソリューションの下に、それが落ち着くように、分液漏斗に脱気したH 2 Oの40ミリリットルを加え、穏やかに旋回し、以前のようにドレイン。
- 三度目の洗浄するために繰り返します。
- 、三角フラスコにマグネタイト液を移し、無水硫酸ナトリウムの価値はいくつかへらを追加し、マグネタイト溶液から、残りの残留H 2 Oを除去するための渦。
- 硫酸ナトリウム及び残留H 2 Oを除去するための濾過漏斗で1ミクロンの濾紙マグネタイト溶液を濾過
注：真空支援が推奨されます。 - 50ミリリットル蒸発フラスコにマグネタイト液を移し、ヘキサンを蒸発させるために、ロータリーエバポレーターを使用以下の条件で2時間：中程度の回転速度、真空度は50℃の水浴でフラスコを蒸発させ、塗布し、24℃の水が凝縮器を循環します。
注：必要に応じて、PLGAでコーティングする前にマグネタイトゲルを保存します。
PLGAシェルを使用したマグネタイトナノ粒子の3コーティング
- 1.5％（M / V）のソリューションを作成するために、酢酸エチル240mlの中のPLGAの3.60グラム（75/25ブレンド）を溶解します。注意：酢酸エチルは有害である - ドラフト内で個人用保護具と仕事を着用してください。
- 5.0％（M / V）溶液を作成するために、磁気スターラーを用いて脱気H 2 O 500ml中のPluronic F-127の25.00グラムを溶解します。
注：プルロニックF-127は、生体適合性界面活性剤として作用する非イオン性両親媒性ブロック共重合体です。なお、ステップ3.3.2で水中油型エマルジョンを安定化するのに役立ちます。 - ミクロを使用して、重み付けされたガラスバイアル内で6 0.040グラムのアリコートにマグネタイトゲルを収集します。 PERF各アリコートについては、以下のコーティング及び洗浄工程をORM。
注：一定分量は、ステップ4で劣化する前に凍結乾燥を最小限に抑えながら、純度と収率を最大れる、効率的な処理および磁気デカンテーションを確保するために必要です。- 10分間超音波洗浄器で0.040グラムのマグネタイトゲルのアリコートおよびプラスチックビーカー超音波処理にPLGA溶液の40ミリリットルを追加します。
- プラスチックビーカーのプルロニック溶液80 mlを加え、すぐに水中油型エマルジョンとしてマグネタイトナノ粒子上のPLGAコーティングを形成するために7分間最高設定で実験室用ミキサーで乳化します。
- すぐに酢酸エチルを蒸発させ、化学換気フード中で1時間脱イオンH 2 O及び超音波処理を1 LにSPION溶液を希釈します。
- SPION溶液に次の強力な磁石を置き、静かに磁石で茶色がかっSPIONsを収集するためにかき混ぜます。
注：これは、断続的に、数時間攪拌する必要があるかもしれません溶液前SはSPIONsのほとんどが収集されたことを示す白っぽくなります。 - 磁石をビーカーにSPIONsを維持しながら水溶液をデカント。
- 次のようにSPIONsを3回洗浄します。
- 脱イオンH 2 O 1LにSPIONsサスペンド
- 20分間SPION液を超音波処理。
- SPION溶液に次の強力な磁石を置き、静かに磁石で茶色がかっSPIONsを収集するためにかき混ぜます。これは、溶液がSPIONsの大部分が回収されたことを示す明確なターン前に断続的に数時間撹拌することが必要であり得ます。
- 磁石をビーカーにSPIONsを維持しながら水溶液をデカント。
- 水性懸濁液のような単一の加重ガラス瓶に6マグネタイトゲルアリコートのそれぞれから合成SPIONsを収集します。必要に応じて、必要に応じて磁気的に余分な水分をデカント。
4.フリーズSPIONsの-drying
- SPIONソリューションをフリーズします。
- 凍結乾燥した凍結乾燥機でSPION液O / Nに。
- 凍結乾燥SPIONsを計量。細胞標識に使用するまで凍結乾燥SPIONsを-20℃で保存することができます。
注：-20°C劇的での保存は、分解速度を減少させ、貯蔵寿命を向上させます。
SPIONsによる細胞の5ラベリング
- 40 mg / mlの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中SPIONsのアリコートを一時停止し、30分間超音波処理します。
- 細胞培養培地を5μl/ mlの濃度で細胞のほぼコンフルエントなフラスコにSPION溶液を加えます。静かにフラスコを揺動することにより均一な分布を確認してください。
- 37℃で16時間細胞をインキュベートします。
- 穏やかに培地を吸引し、PBSで細胞を2回洗浄します。
- 磁気標識細胞を収集し、実験に使用します。
- 未使用SPION溶液は4℃で保存することができ、米国でなければなりません数ヶ月以内にエド。各使用前に30分間超音波処理。
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Representative Results
マグネタイトナノ粒子は、50℃、1000回転（図1）での鉄（III）、塩化鉄（II）塩化物水和物の水溶液を攪拌した結果、直径が約10nmです。これらの結果は、マグネタイトナノ粒子の合成に成功を実証します。これは、最初に合成しようとすると、バッチの少量の試料から採取したマグネタイトナノ粒子のサイズおよび形状を確認することが重要です。透過型電子顕微鏡（TEM）は、これらの粒子を可視化するための好ましい方法です。バッチは破棄されるべきであり、 図1に示すように、マグネタイトナノ粒子は直径および球形で10nm程度でない場合、合成が再試行する必要があります。
120nmで（図2）の直径を有するPLGA-マグネタイトSPIONsの高速乳化剤結果を用いて、PLGAとマグネタイトナノ粒子をコーティングします。これらの結果は、成功した実証しますPLGA-マグネタイトSPIONsの合成。これは、初めて合成をしようとしたときにバッチの小さなサンプルから採取したPLGA-マグネタイトSPIONsの大きさや形状を確認することが重要です。走査型電子顕微鏡（SEM）は、これらの粒子を可視化するための好ましい方法です。バッチは廃棄されるべきであり、 図2に示すように、PLGA-マグネタイトSPIONsがより大きいまたはより小さい粒子は、特定の用途のために望ましいかもしれないが、組成が不明である。直径の球状で120nm程度でない場合、合成を再度試みるべきしたがって、細胞標識、磁化率、および細胞毒性は予測できません。
ナノ粒子のエンドサイトーシスにおける16時間の結果（図3）のためのSPIONsと血液伸長内皮細胞のインキュベーション。これらの結果は、SPIONsでの細胞の成功したラベルを示しています。それから採取された細胞内SPIONsの存在を確認することが重要です初めての標識をしようとバッチの小さなサンプル。透過型電子顕微鏡では、これらのSPION標識細胞を可視化するための好ましい方法です。細胞は廃棄すべきであり、PLGA-mangetite SPIONsは、図3に示すように、細胞質エンドソーム内で一緒にクラスタ化された黒色粒子丸として表示されない場合は、ラベルを再度試みるべきである。また、SPIONsのより低い濃度は、磁気細胞標的化を可能にするために失敗し、 SPIONsのより高い濃度は、細胞傷害性であり得ます。必要に応じて、細胞を標識するために使用されるSPIONsの濃度に応じて調整することができます。
細胞内にロードされた鉄の量は、強磁性植え込み可能な医療装置（図4）と生存細胞の磁気捕捉を達成するのに十分です。これらの結果は、成功したSPION媒介磁気細胞標的化を実証します。効果をターゲットに強力な細胞が所望される場合、好ましい戦略はincreaことです生成または印加磁界8,30の強度や勾配をSE。細胞を標識するために使用さSPIONsの濃度を増加することのみによる細胞毒性の懸念への最後の手段として試みられるべきです。改善された細胞生存率が所望される場合、細胞を標識するために使用されるSPIONsの濃度を減少させるべきです。
マグネタイトナノ粒子の図1のTEM像。マグネタイトナノ粒子は、透過電子顕微鏡（TEM）によって示されるように、直径が約10nmです。粒子のサイズは球状で均一です。スケールバー= 100 nmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
磁気的に標識された内皮細胞の図3のTEM像。透過型電子顕微鏡（TEM）によって可視化し、磁気標識された血液伸長内皮細胞。 SPIONsは自然に細胞によってエンドサイトーシスおよび細胞質エンドソーム内の小さなクラスターに格納されています。左スケールバー=2μmで、右のスケールバー= 0.5ミクロン。 24から許可を得て再印刷します。/files/ftp_upload/53099/53099fig3large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
磁気細胞捕獲の図4蛍光顕微鏡画像は、磁気的に標識された内皮細胞は、非磁 性ステント（左）よりも有意に高い率で強磁性血管ステント（右）に引き寄せられます。スケールバー=100μmです。再印刷24からの許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
任意のナノ粒子合成プロトコルと同様に、反応物質の化学物質の純度は、最小限の細胞毒性効果を持つことになり、高品質のSPIONsを達成するために重要です。これは、オレイン酸（≥99％）、塩化鉄（II）四水和物（≥99.99％）、塩化鉄（III）（≥99.99％）、酢酸エチルなどの非常に純粋な試薬を購入することが重要である（HPLCグレード、≥99.9％ ）、ヘキサン（HPLCグレード、≥97.0％）、水酸化アンモニウム（≥99.99％）、及び硫酸ナトリウム（≥99.0％）。これは、比較的高価であり、非常に純粋な、高品質のPLGAを、購入するために特に重要です。また、すべてのガラス製品は、完全に塩酸、脱イオン水、エチルアルコールで洗浄し、使用前に乾燥させなければなりません。
同様に、プロトコル内の精製工程および洗浄工程は、最終的なSPIONsが高品質であること、最小限の細胞毒性作用を持つことになります確保するために重要です。マグネタイトゲルはあってはなりませんPLGAで被覆する前に可能な限り多くの水酸化アンモニウム、水、及びヘキサン等。したがって、プロトコルの多くはマグネタイトゲルの純度を確保することに専念しています。その後、PLGA-マグネタイトSPIONsは、酢酸エチル、プルロニック、過剰PLGAの自由でなければなりません。最終SPIONの洗浄工程は、プロトコルの中で最も時間のかかる部分ですが、高純度を確保するために完了する必要があります。具体的には、各洗浄工程の間に粒子の磁気回収は非常に時間がかかる可能性があります。溶液を攪拌して大幅に粒子収集の速度を上げることができるが、磁気攪拌棒を使用することができません。低速で動作するオーバーヘッド攪拌機は、急速な粒子収集のための最も有効な手段です。確認SPIONsの大きな茶色がかったコレクションが磁石に表示され、その溶液をデカント前に白またはクリア表示されます。これは多くの場合、攪拌の数時間を必要とすることができますが、より高い最終収量になります。磁気デカンテーションステップはまた、唯一のMAGNを確保するのに役立ちますすべての非磁性材料が廃棄されている間エティックな粒子が保持されます。
過剰な鉄レベルは、細胞傷害性であることができるので、この技術を用いて細胞に付与することができる磁気質量の量が制限されます。鉄の濃度は、特に敏感な細胞型で減少または特に弱い磁場で増加する必要があるかもしれませんが、ここで説明されたプロトコルは、安全性と有効性のバランスをとるための実証済みの出発点を提供します。このプロトコルによって合成SPIONsはPLGAのマグネタイトの質量比が1時15分を有する溶液から作られ、SPIONsは、細胞培養培地に200μg/ mlの濃度で細胞に導入されます。これらのパラメータのいずれかが必要に応じて、各細胞によってエンドサイトーシス、鉄の量を変化させるように調整することができます。
SPIONsは、人間の移植のための安全であり、時間（約40〜50日の半減期）31の上に生分解されます。マグネタイトおよびPLGAの両方が無害degradを形成エーションの製品とは、自然の経路32を介して体内から消去されます。 SPIONsの生分解性の性質は、任意の細胞毒性効果は時間とともに減少することを意味するだけでなく、数ヶ月を超えて、その磁気特性を維持するために、細胞を必要としないものへの潜在的なアプリケーションを制限します。 SPIONsはまた、細胞を標識し、表面タンパク質を必要とせず、その磁気効果を付与も生物学的環境33,34に暴露されると、タンパク質のコロナの形成を受けやすいリガンドを標的にするという利点を有します。
細胞に磁気特性を付与することは、標的細胞の配信を必要とするか、29をソートする生物医学的用途の幅広いするのに便利です。種々の細胞型が安全に間葉系幹細胞35、内皮前駆細胞36、β島細胞37、及び神経幹細胞38を含むSPIONsをエンドサイトーシスする能力を実証しました。磁気CEL配信条件の制御の高度が必要である場合、Lは、標的化技術を標的とする他の細胞よりも好ましいです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metal basis | Sigma-Aldrich | 338818-100ML | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Dreschel bottle, 500 ml | Ace Glass | 5516-16 | |
| Ethyl Acetate, CHROMASOLVR Plus, for HPLC, 99.9% | Sigma-Aldrich | 650528-1L | Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Evaporating flask, 50 ml, 24/40 joint | Sigma-Aldrich | Z515558 | For use with rotoevaporator |
| Filter paper, 3 cm dia, grade 1 | Fisher | 09-805P | For use with glass filter funnel |
| Glass beakers, 1 L | Fisher | FB-101-1000 | For washing SPIONs |
| Glass filter funnel, vacuum hose adapter, fits 24/40, 30 mL | Fisher | K954100-0344 | |
| Glass vial caps | Fisher | 03-391-46 | For use with glass vials |
| Glass vials, 2 ml | Fisher | 03-391-44 | For collecting magnetite gel & SPIONs |
| Hexane, CHROMASOLVR, for HPLC, ≥97.0% (GC) | Sigma-Aldrich | 34859-1L | Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood |
| Iron(II) chloride tetrahydrate, ≥99.99% trace metals basis | Sigma-Aldrich | 380024-5G | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Iron(III) chloride anhydrous, powder, ≥99.99% trace metals basis | Sigma-Aldrich | 451649-1G | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Isomantle heater, 500 mL | Voight Global | EM0500/CEX1 | |
| Laboratory mixer | Silverson | L5M-A | |
| Lyophilizer | Labconco | 7670520 | |
| Microspatulas | Fisher | 21-401-25A | For transfering magnetite gel |
| NdFeB magnet, 1 in x 1 in x 1 in | Amazing Magnets | C1000H-M | Very strong magnet, handle with care |
| Oleic acid, ≥99% (GC) | Sigma-Aldrich | O1008-5G | Store in freezer; Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Overhead stirrer | IKA | 2572201 | |
| Overhead stirrer clamp | IKA | 2664000 | For use with overhead stirrer |
| Overhead stirrer H-stand | IKA | 1412000 | For use with overhead stirrer |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Plastic beakers, 250 ml | Fisher | 02-591-28 | |
| PLGA PURASORB PDLG (75/25 blend) | Purac | PDLG 7502 | PDLG 7502A may be used as well; Store in freezer |
| Pluronic F-127 powder, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PTFE expandable blade paddle, 8 mm dia | SciQuip | SP4018 | |
| PTFE vessel adapter, fits 24/40, 8 mm dia paddle | Monmouth Scientific | PTFE Vessel Adaptor A480 | For use with PTFE expandable blade paddle |
| Recirculating chiller | Clarkson | 696613 | For use with rotoevaporator |
| Reflux condenser, fits 24/40, 250 mm | Ace Glass | 5997-133 | |
| Rotoevaporator | Clarkson | 216949 | |
| Rubber septa, fits 24/40 | Ace Glass | 9096-56 | |
| Separatory funnel with stopper, 250 ml | Fisher | 10-438E | |
| Sodium sulfate ACS reagent, ≥99.0%, anhydrous, granular | Sigma-Aldrich | 239313-500G | |
| Three neck round bottom flask, angled, 24/40 joints, 500 ml | Ace Glass | 6948-16 | |
| Ultrasonic cleaner perforated pan | Fisher | 15-335-20A | For use with ultrasonic cleaner |
| Ultrasonic cleaner, 2.8 L | Fisher | 15-335-20 | |
| Vacuum controller | Clarkson | 216639 | For use with rotoevaporator (optional) |
| Vacuum pump | Clarkson | 219959 | For use with rotoevaporator |
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