Abstract
Som gliaceller i hjärnan, astrocyter har olika funktionella roller i det centrala nervsystemet. I närvaro av skadliga stimuli, astrocyter ändra sina funktionella och strukturella egenskaper, ett tillstånd som kallas reaktiv astroglios. Här är ett protokoll för utvärdering av de morfologiska egenskaperna hos astrocyter presenteras. Detta protokoll omfattar kvantifiering av 12 olika parametrar dvs yta och volym av vävnaden som omfattas av en astrocyternas (astrocyternas territoriet), hela astrocyternas inklusive filialer, cellkroppen och kärnan, samt total längd och antal grenar, intensiteten fluorescens immunreaktivitet av antikroppar som används för astrocyternas detektering och astrocyternas täthet (antal / 1000 pm 2). För detta ändamål skapades tredimensionella (3D) konfokala mikroskopiska bilder och 3D bildanalys program som Volocity 6,3 användes för mätningar. Råtta hjärnvävnad exponerad för amyloid beta 1-40 1-40) med eller utan en terapeutisk intervention användes för att presentera metoden. Detta protokoll kan också användas för 3D morfometrisk analys av andra celler från antingen in vivo eller in vitro-betingelser.
Introduction
I friska centrala nervsystemet (CNS), astrocyter spelar en viktig roll i regleringen av blodflödet, energimetabolism, synaptisk funktion och plasticitet, och extracellulär jon och signalsubstans homeostas 1-3. Dessutom astrocyter reagera på olika skadliga stimuli och onormala tillstånd såsom trauma, infektion, ischemi eller neurodegeneration via reaktiv astroglios som kännetecknas av hypertrofi, spridning och funktionell ombyggnad av astrocyter 4,5.
Reaktiv astroglios kan konstruera det inflammatoriska svaret och reparationsprocess i vävnaden och kan därför påverka den kliniska utfallet av terapeutiska ingrepp. Följaktligen har astrocyter fått uppmärksamhet från neuroforskare under de senaste decennierna som potentiella mål för terapeutiska ingrepp för en rad olika sjukdomar som drabbar centrala nervsystemet.
Astrocyter har normalt en stel form med väl defined grenar som sprider runt soma 6. I ett sjukdomstillstånd i hjärnan, astrocyternas grenar blir invecklad och visa svullna ändar 7, till exempel i närvaro av amyloid-beta (AP).
I denna artikel presenteras ett protokoll för att analysera 3D-bilder av astrocyter som förvärvats av konfokalmikroskopi. Tolv olika kvantitativa parametrar för varje astrocyternas mättes: de ytor och volymer av astrocyternas territoriet (vävnaden som omfattas av en astrocyt), hela cellen (inklusive filialer), cellkroppen och kärna; den totala längden och antalet grenar; fluorescensintensiteten hos antikroppar som används för astrocyternas detektering; och tätheten av astrocyter (antal / 1000 ^ m 2). För detta ändamål har vi använt hjärnsektioner från råttor som exponerats för intrahippocampal injektion av Ap 1-40 med eller utan genistein behandling som en anti-inflammatorisk substans. Den beskrivna protokollet kan användas för morfometrisk enALYS av olika celltyper in vitro eller in vivo i olika förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie genomfördes i enlighet med de riktlinjer som anges i Guide för skötsel och användning av försöksdjur (NIH) har godkänts av Ethic kommitté Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran).
1. Djur, Kirurgi och Prov Förberedelser
OBS: Förbered hjärnvävnad för 3D konfokala mikroskopisk analys.
- Divide djur slumpmässigt in i två grupper: Ap 1-40 -injection (n = 8), och Ap 1-40 -injection med genistein behandling (n = 8); administrera genistein (10 mg / kg spädd i ett fordon såsom polyetoxylerad ricinolja) genom sondmatning en timme före operation.
- Söva djuren med ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg). Bekräfta korrekt anestesi av brist på tillbakadragande reflex efter nypa tån. Använd salva på ögon under operation för att förhindra torrhet.
- Placera djur i stereotaxic apparater och rakning huvudet. Applicera IODine-lösning för att rengöra hårbotten före snittet och hålla operationsplatsen steril under operation för att minska risken för infektion. Injicera Ap 1-40 stereotaxically (4 pl) i hippocampus vid -3,5 mm posteriort bregma, ± 2 mm lateralt mittlinjen, och -2.8 mm under dura, enligt råtthjärna atlas 8. För stereotaktisk metod se föregående publicering 9.
- Ge postoperativ observation / vård tills djuren är vid fullt medvetande att säkerställa bekvämligheten hos djuren. Hålla djuren varma under återhämtning, och inte returnera dem till en bur med andra djur tills full återhämtning. Var uppmärksam på alla tecken på infektion hos djuren efter operationen.
- Söva djuren djupt av ketamin (150 mg / kg) tre veckor efter operationen. Utför transcardial fixering genom perfusion djuren med 0,9% saltlösning följt av 4% paraformaldehyd i 0,1 M PBS (pH = 7,4), sedan bort och fixa hjärnan som beskrivs i 10 </ sup>.
- Post-fix hjärnorna i 4% paraformaldehyd under 2-3 dagar vid 4 ° C.
- Bädda vävnaden i paraffinblock med hjälp av vävnad bädda utrustning, och undvika underfyllning eller över fyller kassetten eftersom det kan störa korrekt inriktning eller snittning. Var uppmärksam på orienteringen av vävnaden i paraffin blocket.
OBS: råtta hippocampus, till exempel, är nära bakre delen av den cerebrala hemisfären. Sålunda bör vävnaden bäddas på ett sätt som sektione börjar vid bakre delen av hjärnan. Använd Paxinos atlas 8 som en guide för att nå den önskade anatomiska strukturen. - Placera mikrotomen bort från luftdrag eller dörröppningar, eftersom luftrörelserna gör hanteringen av avsnitten svårt.
- Använd sektioner med en tjocklek ≥20 pm som detta djup med bli nödvändigt att producera Z-stack bilder av kompletta astrocyter. Använd inte de första par avsnitt, eftersom de kan ha oönskade tjocklek på grund av termisk eXpansion.
- Placera sektioner på ytan av varmt vatten (5 ± 2 ˚C, under smälttemperaturen för paraffin) precis tillräckligt länge för att platta sektionerna.
OBS: Över expansion av sektionen kan störa morfologin av strukturen. Använd liten pensel för att noggrant överföra delar. Samla två till tre sektioner på varje bild. - Förvara glasen i ett rack i upprätt läge och låt dem torka vid 37 C under flera timmar eller O / N.
2. Immunohistokemi
- Avparaffinera sektioner i xylen, 2 x 10 min och rehydrera genom alkohol-gradient (99,8%, 95%, och 70%, 10 min var) och PBS.
- Inkubera med antikroppar mot gliafibrillärt surt protein (GFAP) utspädd 1: 1500 i PBS innehållande 0,25% bovint serumalbumin (BSA), 0,25% Triton X-100 och 3,5% normalt serum (O / N vid 4 ° C).
- Tvätta sektioner i PBS i 3 x 5 min.
- Inkubera med sekundär alkaliskt fosfat-konjugerat antibodies under 1 h (1: 100, 21 C, späddes i PBS).
- Tvätta avsnitt i PBS för 3 x 5 min.
OBS: Det är viktigt att tvätta delarna ordentligt efter sekundära antikroppar för att minimera bakgrundsfärgning. - Inkubera avsnitt i mörker med Liquid Permanent Red kromogen (15-20 min). Obs: Bered lösningen högst 30 minuter före användning.
- Tvätta sektioner i PBS i 3 x 5 min.
- Slutligen, färga kärnor med 4-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 1: 500, utspädd i PBS) före täcka-halka. Förvara bilderna i kylskåp 24-48 timmar före mikroskopi.
3. konfokalmikroskopi
OBS: För kvantitativ utvärdering (se nedan), välj ett astrocyternas med en väl synlig DAPI-färgade kärna med ett minimum av överlappande grenar för att minska risken för fel. Producerar z-stack bilder är tidskrävande. Ha tålamod och inte sluta under bearbetning. Upprätt konfokala laserskanning mikroskop är used att skapa 3D-bilder från astrocyter.
- Sätt bilden på mikroskop scenen och välj 63x mål.
- Öppna bildbehandlingsprogram och klicka på Start-system. Klicka på fliken Lokalisera. Gå till Tilldela och välj GFP att justera rätt ljus.
- Öppna avtryckaren för att reflektera ljus. Hitta Reflektor Revolver på den högra sidan av Shutter och välj den färg som bör återspeglas av astrocyter (grön, röd eller violett); röd färg (FSet20 wf) användes här.
OBS: Glöm inte att fokusera bilden direkt i okulär mikroskopets. - För att hitta den bästa fokus, klicka på All stängd, sätta mikroskopet stiftet i skärmsläge, och klicka på fliken Acquisition.
- Klicka på Smart Inställningar under fliken Förvärv; ett fönster öppnas. Välj rätt fluoroforen (dvs. DAPI och Alexa Fluor 555, i det aktuella projektet) från listan. Färgen väljs automatiskt.
- Klicka på Best signal, och Apply och klicka sedan på Ställ in exponerings; datorn kommer sedan automatiskt ställa in exponeringsparametrar.
- För att optimera bilden, gå till Kanaler fönstret. Avmarkera TRACK2 markerar Track1 och klicka på Live. Fokusera bilden om det behövs.
- I Kanaler fönstret justera följande knappar; klicka på 1AU för att automatiskt optimera hål. Det är mycket viktigt att göra detta steg annars konfokala bilder kommer att vara icke-optimalt. Justera Gain ha den bästa intensitet (behålla den här inställningen under 800 för att minska extra buller). Slutligen ställer Digital Gain mellan 2 och 3.
- Avmarkera Track1, klicka på TRACK2 och upprepa steg 3,8 för TRACK2. Stoppa sedan Live.
- Gå till inställningsmoden fönstret. Förbättra bilden genom att optimera Frame storlek och medelvärde. För att ändra bildstorleken gå till X * Y och välj 1024 x 1024. Välj en långsam hastighet för att skapa en bättre bild.
- Gå till medelvärde och välj ett nummer ≥4. Denna medelvärdes värde anger antalet genomsökningar som ska genomsnitt att produktionene den förvärvade bilden. Klicka nu på Snap-knappen, och spara den tagna 2D-bilden.
- För 3D-röntgen, markera Z-Stack post under Smart Setup orsakar Z-Stack fönstret för att öppna.
- Ställ de första och sista positionerna för Z-stack, dvs djupet av cellen. Klicka först på Live. Använd sedan fokus bilresa från mikroskop för att fokusera på det översta läget av astrocyternas i vävnaden, där Z-Stack är att starta. Klicka på Set Första. Fokusera sedan ner till den lägsta positionen av astrocyt i vävnaden, där Z-stack avsökning bör stoppas. Klicka på knappen Set Last. Stoppa sedan Live.
- Välj intervall; 1,01 um används i den aktuella studien; väljer intervall kan göras genom att klicka på Optimal att ställa in antalet skivor.
- Klicka på Start Experiment. Spara bilderna när skanningen är klar. Den här bilden kommer att användas för att mäta följande parametrar: yta och volym av astrocyternas territoriet, hela astrocyt inklusive behånches, cellkroppen, och kärnan.
- Skaffa en 2D-bild med hjälp av en 10X eller 20X mål som beskrivs i steg 3.6-3.11. Denna bild kan användas för mätning av intensiteten av fluorescens immunoreaktivitet av antikroppar och astrocyt densitet (antal / 1000 ^ m 2).
4. astrocyt Densitet och GFAP + fluorescensintensitet
- Öppna 20X 2D-bild. Klicka på Histo (Hisogram) på vänster sida av bildfönstret.
- För att beräkna astrocyternas täthet, väljer tre på varandra följande visuella fält under 20X mål. Räkna antalet astrocyter som uppvisar en tydlig soma med minimum, överlappande grenar inom områdena.
- För att kvantifiera fluorescensintensitet, välja ett lämpligt verktyg (rektangel eller cirkel) på sidfoten på bildfönstret, och välj ett område för mätningen. Notera medelvärdet och standardavvikelse visas automatiskt under bilden. I den aktuella studien, en 0,7 mm 2 rektangulärt område mellan striatum och mediala blad av gyrus dentatus användes.
5. astrocyt Grenar
- För att kvantifiera längden och det totala antalet kontor, använder 3D-bilder (som förvärvats med 20X) i bildanalysprogram. Rita en linje manuellt utmed längden av varje gren av den valda astrocyt. Välj sedan mätningsverktyget som är specialiserad för att mäta linje längd. För att kvantifiera antalet filialer, välj räkna-verktyg för att räkna antalet markerade objekt.
6. Volym och Surface Area
OBS: Markera en struktur manuellt i 3D bildanalysmjukvara kräver fokus och utbildning. Öva flera gånger innan ett experiment.
- För att kvantifiera volymen och ytan av astrocyternas kärnan, soma, cellkroppen och territorium, överföra 3D-bilder (som förvärvats i steg 3.1-3.16) till en 3D-bildanalysprogram som Volocity 6.1.
- Öppna mjukvaran och skapa ett nyttbibliotek. Dra alla bilder till vänster grå kolumn i det nya biblioteket. Välj sedan en 3D-bild. Till höger finns olika kanaler med olika färger. Slå på en kanal av intresse; till exempel den blå kanalen för DAPI vid mätning av kärnan. Ändra ljusstyrka manuellt för att få en optimal kontrast.
- Välj menyn Verktyg, gå att göra volym och producera en enda 3D-bild av Z-stack bilder. Klicka på Egenskaper i menyn Redigera och vara säker på att X är Y och Z egenskaper presenteras; annars är det omöjligt att utföra 3D-analys.
- Klicka på Freehand-ikonen RIO verktyg i verktygsfältet. För att mäta volymen och ytan av astrocyternas kärnan dra en linje runt DAPI-märkta kärna.
- För att mäta volymen och ytan av astrocyternas cellkroppen dra en linje runt soma exklusive grenar.
- För att mäta volymen och ytan av hela astrocyternas (cellkroppen inklusive filialer) dra en linje runt soma efterytan av alla grenar.
- För att bedöma volymen och ytan av astrocyternas territoriet dra en linje mellan tips av grenarna.
OBS! Tryck på Delete på tangentbordet för att radera oönskade ritningar. - Klicka på Mätningar menyn högst upp på bildfönstret för att skapa en mätprotokoll; ett fönster med olika verktyg öppnas.
- Dra Hitta objekt till överst i fönstret (fönstret). Ge ett beskrivande namn till befolknings 1 väljer tillhörande färg, och klicka på Mät. Ett nytt fönster öppnas.
- Välj en parameter dvs volym eller yta. Klicka på OK. Uppgifterna kommer att visas i en tabell.
- Om du vill spara genom att klicka uppgifter om Measurement menyn och välj Gör Measurement objekt.
- Välj en ny mätning post kallad från det öppnade fönstret. Sedan ge ett namn till data och klicka på OK.
- Slutligen, exportera data till statistik program som Graph pad eller Excel program. Använd t-test för att analysera data, sedan rita 2D graphs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta avsnitt presenteras några exempel på de kvalitativa och kvantitativa observationer som produceras av 3D morfometrisk analys. För fullständiga resultaten av alla 12 parametrar som nämnts tidigare, se vår tidigare offentliggörande 10.
Kvalitativa Observationer
Astrocyter uppvisade tunna eller tjocka grenar som var oftast lång i Ap 1-40 injicerade råttor (Figur 1). Några små stelformade astrocyter med korta grenar observerades i hjärnbarken, och ett kompakt nätverk av astrocyter inträffade i corpus callosum.
Astrocyter i hjärnvävnad från djur med A-beta 1-40 -injection följt av genistein behandling uppvisade en stel form med korta och tunna grenar (Figur 2) 10. Några astrocyter visade en atrofisk utseende.
Astrocyternas Densitet och GFAP +Fluorescensintensitet
Medelantalet astrocyter / 1000 pm 2 var signifikant högre hos råttor med Ap 1-40 -injection i jämförelse med djur i Ap 1-40 -injection och genistein behandlingsgruppen (P <0,0001). Dessutom GFAP + fluorescensintensiteten var signifikant lägre i hjärnan avsnitt med genistein behandling jämfört med icke-behandlade Ap 1-40 injicerade djur (Figur 3).
Morfometrisk Analys av Astrocyter Volym
Volymen av astrocyternas kärnan, cellkroppen, hela astrocyternas och astrocyternas territoriet minskade kraftigt i genistein behandlingsgruppen jämfört med obehandlade djur. Detta resultat tyder på att genistein lindras den astroglios som orsakas av närvaron av amyloid (Figur 4A - D).
Figur 1. Confocal bilden av en astrocyternas. En enskild astrocyt med tjocka och långa grenar (pilspets) och DAPI-märkt kärna (pil) i en råtthjärna utsätts för hippocampus injektion av Ap 1-40. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Confocal bilden av en astrocyternas. En astrocyternas med korta grenar (pilspets). I en råtthjärna utsätts för hippocampus Ap 1-40 -injection och genistein förbehandling genom sondmatning. P hyra klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. GFAP + fluorescensintensitet minskat betydligt i djur med A β 1-40 -. Injektion som fick genistein förbehandling Värdena är medelvärde ± SEM. Femtio astrocyter per djur utvärderades. P <0,05 ansågs vara betydande, och T-test användes för att jämföra data mellan grupper med eller utan behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
g "/>
Figur 4. Den genomsnittliga volymen av kärnan (A), cellkroppen (B), astrocyternas (inklusive filialer, (C), och territoriet (D) i hjärnprover tagna från råttor som utsatts för Ap 1-40 -injection, med eller utan genistein förbehandling. Genistein lindras avsevärt utvidgningen av kärnan, cellkroppen, hela astrocyternas och astrocyternas territoriet (se ref 10). Värdena är medelvärde ± SEM. Femtio astrocyter per djur utvärderades. P <0,05 ansågs vara signifikant, och T-test användes för att jämföra data mellan grupper före och efter behandlingen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det nuvarande protokollet, använde vi 3D konfokala morfometri att utvärdera 12 olika parametrar som var förknippade med astrocyternas morfologi. För detta ändamål hippocampusvävnad av råttor med Ap 1-40 - inducerades astroglios, med eller utan genistein förbehandling som ett anti-inflammatoriskt medel användes. Genom att använda 3D-bilder och morfometrisk programvara, kunde vi visa effekten av genistein på astroglios dvs morfologi astrocyter.
Förändringar i inträ- och extracellulära miljön i hjärnvävnad kan förändra volymen och / eller storleken av celler / vävnad. Dessa förändringar anses patologiska kännetecken i olika hjärnskador 3,11. För att kvantifiera dessa förändringar, är ett antal tekniker användas. De flesta undersökningar bygger på att använda 2D upplösning låg fångas av ljus- eller elektronmikroskopi (EM) som ger information bara om en liten del av cell. För att övervinna denna begränsning, har 3D konfokala morfometri på högupplösta bilder utvecklas 11. En annan fördel med konfokalmikroskopi är som kan studeras arkitekturen i en cell eftersom flera konsekutiva 2D-bilder erhålles medan z-stack avbildning utförs. Dessutom väcker 3D konfokalmikroskopi möjlighet att förbättra kvaliteten på bilderna genom att filtrera bakgrundsljud 11.
Den metod som presenteras här är tidskrävande; med Z-stack bilder med en konfokalmikroskop tar flera minuter för varje enskild cell. Dessutom manuellt märkning en struktur i programvara kräver lite övning, och forskaren kan behöva göra om ritningen flera gånger för att vara säker på att strukturen är korrekt märkt. Det bör nämnas att "Magic" fliken i 3D bildanalys program som Volocity, kan användas för att automatiskt markera alla DAPI-färgade kärnor i en enda bild. Detta alternativ kan användas närastrocyter odlas. De hjärnsektioner innehåller emellertid inte bara astrocyter men också många andra celler såsom mikroglia och neuroner. Detta innebär att många av de DAPI-färgade kärnor inte tillhör astrocyter. Kärnorna är förknippade med astrocyter bör manuellt markeras med bilder som har både DAPI-märkta kärnor och GFAP-immunoreaktiva astrocyter.
I detta protokoll har antikroppar mot GFAP används för att visualisera astrocyter i paraffin. Astrocyter kan också visualiseras genom att använda andra antigener 12,13, eller transgena möss. Utredarna bör vara medvetna om begränsningar av de metoder och använda bästa möjliga experimentell design baserat på deras mål. Begränsningen av att använda antikroppar mot GFAP, till exempel, är att endast 10-15% av cytoskelettet kan detekteras. Denna begränsning kan dock bli en fördel när man studerar astroglios; Ökningen antalet astrocyter och ett tätt nätverk av astrocyter filialer i såtrogliosis kan göra det svårt att identifiera en enda cell om ett större område av cellen detekteras. Även om detta protokoll beskriver kvantifiering av 12 olika parametrar, men utredaren kan välja de som passar deras syfte. Enligt vår erfarenhet kan mätningarna av alla parametrar ge värdefull information om de parametrar som väsentligt påverkas i ett visst tillstånd eller genom en behandling. Kvantifieringen metod som utförs på 3D-bilder tagna i konfokalmikroskop kan också utföras på frysta snitt. Frågan är att behandla proverna (fixering, uttorkning, inbäddning och snittning) på ett liknande sätt eftersom dessa åtgärder kan leda till krympning eller svullnad i vävnaden.
Sammanfattningsvis, 3D konfokal avbildning, i kombination med morfometrisk programvara gör det möjligt att kvantifiera ett flertal parametrar i samband med morfologin hos en cell. Protokollet vi presenteras här kan användas för att utvärdera morfologiska chanGES som visas i en cell, i olika sjukdomstillstånd, eller som effekten av en interventionsstrategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete har finansierats med bidrag från Landstinget i Östergötland (Sverige) och Cell- och molekylärbiologi Research Center vid Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil - Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. A stereotaxic atlas of the rat brain. , Academic. New York. (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079 (2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526 (2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
