Protokol til tredimensionel Konfokal Morfometrisk Analyse af Astrocytter
Summary
Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Abstract
Som gliaceller i hjernen, astrocytter har forskellige funktionelle roller i centralnervesystemet. Ved tilstedeværelse af skadelige stimuli, astrocytter ændre deres funktionelle og strukturelle egenskaber, en tilstand kaldet reaktiv astrogliose. Her er en protokol til vurdering af de morfologiske egenskaber af astrocytter fremlagt. Denne protokol omfatter kvantificering af 12 forskellige parametre dvs det areal og volumen af vævet omfattet af en astrocyt (astrocyt territorium), hele astrocyt herunder filialer, celle krop og kerne, samt total længde og antal filialer, intensiteten af fluorescens immunreaktivitet af antistoffer anvendes til påvisning astrocyt og astrocyt densitet (antal / 1000 um 2). Til dette formål tredimensionale (3D) konfokal mikroskopiske billeder blev skabt, og 3D-billede analyse software såsom Volocity 6.3 blev brugt til målinger. Rotte hjernevæv udsat for amyloid beta 1-40 </sub> (Ap 1-40) med eller uden en terapeutisk intervention blev brugt til at præsentere metoden. Denne protokol kan også anvendes til 3D morfometriske analyse af andre celler fra enten in vivo eller in vitro betingelser.
Introduction
I sundt centralnervesystemet (CNS), astrocytter spille en vigtig rolle i reguleringen af blodgennemstrømningen, energiomsætning, synaptisk funktion og plasticitet, og ekstracellulær ion og neurotransmitter homeostase 1-3. Desuden astrocytter reagere på forskellige skadelige stimuli og unormale tilstande, såsom trauma, infektion, iskæmi eller neurodegeneration via reaktiv astrogliose som er karakteriseret ved hypertrofi, proliferation og funktionelle omformning af astrocytter 4,5.
Reaktiv astrogliose kan ingeniør den inflammatoriske respons og reparationsprocessen i vævet, og derfor kan påvirke det kliniske resultat for terapeutiske indgreb. Følgelig har astrocytter fået opmærksomhed fra neuroscientist løbet af de sidste årtier som potentielle mål for terapeutiske indgreb for en række sygdomme, der påvirker CNS.
Astrocytter normalt har en stjerneformet form med godt defined grene, der spredes omkring soma 6. I en sygdomstilstand i hjernen, astrocyt grenene bliver komplicerede og viser hævede ender 7, for eksempel i nærvær af amyloid beta (Ap).
Denne artikel præsenterer en protokol for analyse af 3D-billeder af astrocytter erhvervet af konfokal mikroskopi. Tolv forskellige kvantitative parametre for hver astrocyt blev målt: de arealer og mængder af astrocyt territorium (det væv dækket af en astrocyt), hele cellen (herunder filialer), celle krop, og kerne; den samlede længde og antal filialer; fluorescensintensiteten af antistoffer anvendes til påvisning astrocyt; og densiteten af astrocytter (antal / 1000 um 2). Til dette formål anvendte vi hjernesnit fra rotter udsat for intrahippocampal injektion af Ap 1-40 med eller uden genistein behandling som et anti-inflammatorisk stof. Den beskrevne protokol kan anvendes til morfometriske enANALYSE forskellige celletyper in vitro eller in vivo i forskellige forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den nuværende protokol, vi ansat 3D konfokal morfometri at vurdere 12 forskellige parametre, der var forbundet med astrocyt morfologi. Til dette formål, hippocampus væv af rotter med Ap 1-40 – blev induceret astrogliose, med eller uden forbehandling genistein som et anti-inflammatorisk middel anvendes. Ved at bruge 3D-billeder og morfometrisk software, var vi i stand til at vise effekten af genistein på astrogliose dvs morfologi astrocytter.
Ændringer i intra- og e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. . A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079 (2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526 (2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry – a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
