Introduction
गैर नवीकरणीय ईंधन और उनके संबद्ध उत्पादों गिरावट की वैश्विक आपूर्ति के रूप में, वैज्ञानिकों संयंत्र व्युत्पन्न स्रोतों 1 से इसी तरह के ईंधन और रसायनों बनाने के लिए चुनौती दी गई है। इस काम का एक महत्वपूर्ण पहलू पौधों की प्रजातियों में जैव ईंधन और biomaterials 2,3 के उत्पादन के लिए उपयुक्त हो सकता है, जो निर्धारित है। आमतौर पर, इन feedstocks लिग्निन, सेल्यूलोज, और hemicellulose सामग्री के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं; के रूप में अच्छी तरह से साथ या बाद एंजाइम शर्करीकरण बिना, थर्मल, यांत्रिक, और / या रासायनिक pretreatment के माध्यम से विखंडन (अवज्ञा) के लिए अपनी संवेदनशीलता के रूप में। अधिक विस्तृत विश्लेषण की जरूरत लिग्निन और hemicellulose अंशों की विशिष्ट रचना के साथ ही इष्टतम एंजाइम गतिविधियों का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है। आंतरिक रूप से वांछित वस्तुओं के लिए जैव रासायनिक या thermochemical रूपांतरण के लिए आदर्श लक्षण के अधिकारी नहीं है कि पौधों की ट्रांसजेनिक संशोधनों के बर्तन का एक बहुत विस्तृत स्रोत के साथ शोधकर्ताओं प्रदान की हैential feedstocks 4। छोटा सा नमूना सेट के लिए काफी उपयोगी है, जबकि एक संयंत्र की रासायनिक लक्षण बढ़ाता के लिए मानक विश्लेषणात्मक तरीकों, नमूने 5-7 सैकड़ों या हजारों की तेजी से जांच के लिए अनुपयुक्त हैं। यहाँ बताया HTP तरीकों तेजी से और कुशलता thermochemical और / या एंजाइमी गिरावट के लिए सेल की दीवार अवज्ञा में परिवर्तन के लिए बायोमास वेरिएंट की बड़ी संख्या का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया है।
यह HTP स्क्रीनिंग assays के साथ वर्णित रूपांतरण या उपज को अधिकतम करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है कि समझने के लिए महत्वपूर्ण है। उद्देश्य संबंधित बायोमास नमूनों की आंतरिक अवज्ञा में रिश्तेदार मतभेदों को निर्धारित करने के लिए है। नतीजतन, विश्लेषण कदम के कई उद्देश्य अधिकतम रूपांतरण दर या हद तक प्राप्त करने के लिए है, जहां "विशिष्ट" बायोमास रूपांतरण assays, से भिन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, कम pretreatment के कठोर अनुशासन और कम एंजाइम हाइड्रोलिसिस बार अलग अधिकतम करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंनमूने के बीच ences। ज्यादातर मामलों में, अपेक्षाकृत उच्च एंजाइम लोडिंग काफी परिणाम तिरछा कर सकता है जो एंजाइम की गतिविधि में प्रयोगात्मक भिन्नता के कारण मतभेदों को कम करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
संयंत्र सेल दीवारों और मोनोमेरिक शर्करा की संरचना का निर्धारण करने के लिए रैपिड तकनीक एंजाइमी शर्करीकरण अवरक्त ऐसे कंपन स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में रोबोटिक्स, अनुकूलित, thermochemically संगत 96 अच्छी तरह प्लेटें, और मानक प्रयोगशाला तरीकों 8-11 के संशोधनों और वाद्य प्रोटोकॉल (शामिल निम्नलिखित मुक्त कराया (आईआर), लगभग अवरक्त (NIR), या रमन) और परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) 12-17। इन तरीकों प्रयोगात्मक में कटौती करने के लिए अग्रणी, उच्च सेलूलोज या कम लिग्निन सामग्री, या उच्चतम ग्लूकोज, सिलोज़, इथेनॉल उपज की उम्मीद उन लोगों के, आदि इन विधियों बायोमास और उपभोक्ता वस्तुओं की छोटी मात्रा में रोजगार कि downscaled विश्लेषण के लिए सक्षम है के साथ feedstocks को अलग-थलग करने के लिए महत्वपूर्ण हैं खर्च 18 9, चिनार 8,10, गन्ना खोई 8, और switchgrass 8 के रूप में लोकप्रिय है feedstocks, सफलतापूर्वक इन HTP तरीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया है।
कुल लिग्निन और लिग्निन मोनोमेरिक रचना भी आमतौर पर बायोमास लक्षण मात्रा निर्धारित कर रहे हैं। लिग्निन सामग्री में कटौती पॉलीसैकराइड 19,20 के enzymatic पाचनशक्ति को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। लिग्निन मोनोमेरिक अनुपात (अक्सर syringyl / guaiacyl (एस / जी) सामग्री के रूप में रिपोर्ट) भूमिका की है कि जांच के तहत अब भी है संयंत्र सेल की दीवार के विखंडन में खेलता है। कुछ रिपोर्टों से संकेत दिया है कि एस / जी में कटौतीअन्य अध्ययनों विपरीत प्रवृत्ति 19,22 अनावरण जबकि अनुपात, हाइड्रोलिसिस 21 के बाद बढ़ी हुई ग्लूकोज की पैदावार के लिए नेतृत्व किया। लिग्निन और उसके मोनोमर्स के मूल्यांकन के लिए उच्च तरीकों का कंपन बहुभिन्नरूपी विश्लेषण के साथ युग्मित स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईआर, निर, और रमन 23-26), और pyrolysis आणविक किरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (pyMBMS) 27,28 शामिल हैं।
बायोमास स्क्रीनिंग के लिए HTP तरीकों को विकसित है, कई अभिन्न विचार मन में रखने की जरूरत है। एक महत्वपूर्ण पहलू विधि की जटिलता है। तकनीक के लिए आवश्यक कौशल स्तर क्या है? Chemometric विश्लेषण करती है, उदाहरण के लिए, निर्माण, मूल्यांकन, और भविष्य कहनेवाला मॉडल को बनाए रखने के लिए विशेष कौशल की आवश्यकता होती है। मानक तरीकों अवांछनीय प्रारंभिक या डेटा विश्लेषण कदम दिखा रहे हैं या विषाक्त अभिकर्मकों रोजगार। मॉडल का विकास नए डेटा मॉडल की मजबूती बढ़ाने के लिए समय के साथ मॉडल में शामिल किया जाता है, जहां एक सतत प्रक्रिया है। एक और विचार केeration लागत बचत है और प्रस्तावित उच्च तरीकों की प्रयोगात्मक विश्लेषण बार कमी आई है। विधि काफी तेजी से है, लेकिन बहुत महंगा है, यह कई प्रयोगशालाओं को अपनाने के लिए के लिए एक व्यवहार्य तकनीक नहीं हो सकता। इस पांडुलिपि में सचित्र तरीकों थ्रूपुट क्षमताओं को बढ़ाना संशोधित मानकीकृत तकनीकों के वेरिएंट हैं। इन प्रोटोकॉल मात्रात्मक भविष्य कहनेवाला मॉडल के विकास की जरूरत महसूस बिना ब्याज के बायोमास लक्षण उपाय। मानक मॉडल विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया विश्लेषण के साथ मजबूत सहसंबंध का प्रदर्शन करते हुए यह भविष्य कहनेवाला तरीकों के बाद से इन तकनीकों का एक प्रमुख विशेषता है, वास्तव में नमूने के लिए ब्याज की मात्रा को मापने के रूप में सही नहीं हैं। अनिवार्य रूप से मानक बेंच पैमाने पर विश्लेषणात्मक तरीकों के संस्करणों नीचे पहुंचा रहे हैं तरीकों का इस्तेमाल किया जबकि, सटीकता और परिशुद्धता गति और प्रवाह के लिए कारोबार कर रहे हैं। अधिकतर, इस परिणाम छोटी मात्रा pipetting और वजन में उच्च त्रुटियों की वजह से है; साथ ही बढ़ रहानमूना आकार के रूप में पर्याप्त विविधता में कमी आई है। बड़ा नमूना सेट जांच की और तुलना की जा सकती है, जबकि अलग-अलग अभियान के बीच और बेंच पैमाने परिणामों से तुलना करना, जब बड़ी सावधानी प्रयोग किया जाना चाहिए।
सबसे अधिक समय लेने कदम बायोमास के भौतिक हेरफेर शामिल। पीस नमूने नमूनों के बीच चक्की बाहर की सफाई सहित नमूना प्रति कई मिनट लग सकते हैं। मैन्युअल, उतराई, और सफाई हॉपर लोड हो रहा है और भरने और चाय बैग और नमूना बैग खाली भी बहुत श्रम गहन है। हर कदम एक मिनट या अधिक समय लग सकता है, जबकि नमूनों की कर रही है हजारों कई घंटे या दिन लग सकते हैं। रोबोट के बारे में 3 से 4 घंटे या 6 -1 प्लेटों 8 दिन के लिए रोबोट में बायोमास के साथ एक ठेठ रिएक्टर प्लेट लोड कर सकते हैं -1। इस स्थिति के रूप में अच्छी तरह से परीक्षण किया जा करने के लिए प्रकार और बायोमास की राशि के रूप में इस्तेमाल परिशुद्धता मापदंडों पर निर्भर करता है। पानी के साथ रिएक्टर प्लेटों भरने, एसिड पतला, या एंजाइम जल्दी से एक तरल से निपटने रोबोट का उपयोग किया जाता है। पीएक प्लेट ढेर (1 से 20 रिएक्टर प्लेट) के उपचार विधानसभा शांत हो जाओ, जब बीच 1 और 3 घंटा लेता है, और disassembly शामिल किया गया है। एनजाइम हाइड्रोलिसिस 3 दिन लगते हैं और चीनी के विश्लेषण के परिणाम परख को पूरा करने और पढ़ने के लिए प्रस्तुत करने का समय के बारे में 1 घंटा प्लस रिएक्टर प्रति प्लेट 10 मिनट की आवश्यकता है। सेट pretreatment और विश्लेषण दिनों की एक साप्ताहिक कार्यक्रम एक निरंतर आधार पर प्रति सप्ताह ~ 800 से 1000 नमूने परख के मानवीय घटक के लिए अजीब-घंटे और सप्ताह के अंत में प्रयासों को कम करने, एक उचित काम अनुसूची accommodates और प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है। अधिकतम प्रवाह ज्यादा हार्डवेयर (रोबोट, रिएक्टरों प्लेटें, आदि) और कितना "सॉफ्टवेयर" (यानी, स्टाफ) मैनुअल काम करने के लिए उपलब्ध हैं मुख्य रूप से कैसे, कई कारकों पर निर्भर करता है। व्यावहारिक ऊपरी सीमा 2,500 से 3,000 नमूने / सप्ताह है; हालांकि, कि उत्पादन 7 दिन एक सप्ताह का संचालन और कई छात्र इंटर्न और तकनीशियनों की आवश्यकता है। इसकी तुलना में, एचपीएलसी द्वारा 3,000 नमूने सैम के लगभग 125 दिनों की आवश्यकता होगीमिसाल के विश्लेषण के साथ साथ मैन्युअल विश्लेषण करने से पहले रिएक्टरों और छानने के नमूनों में नमूने वजन के अतिरिक्त श्रम।
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Protocol
ग्लूकोज और सिलोज़ पैदावार की 1. उच्च throughput निर्धारण एंजाइमी शर्करीकरण 9,29 फ़ॉलो
- नमूना तैयार (डी-starching, पीस, निकालना, pretreatment)
- एक विले चक्की, इस तरह के कणों एक 20 जाल के माध्यम से पारित है कि (850 माइक्रोन) स्क्रीन का प्रयोग करके प्रत्येक बायोमास नमूना के कम से कम 300 मिलीग्राम पीस लें। विरोधी स्थैतिक ज़िप टॉप बैग पर स्थानांतरण (आमतौर पर बार कोड) और बारकोड डेटाबेस के लिए रिकॉर्ड नमूना जानकारी।
- ध्यान से, चाय बैग (स्याही या मार्कर का उपयोग नहीं करते, पेंसिल के साथ) को रोकने के लिए बायोमास से अधिक सिरों गुना करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा teabags ऊपर रोल एक गिने करने के लिए लगभग 250 मिलीग्राम या विरोधी स्थैतिक बैग से जमीन बायोमास के और अधिक जोड़ने डी-starching और निकासी के दौरान नुकसान।
- टिन-लेपित तांबे के तार का उपयोग बंद कर दिया teabag लपेटें। प्रत्येक बारकोड वाले नमूने के लिए teabag संख्या रिकॉर्ड है।
- वाणिज्यिक एंजाइमों (आमतौर पर, 0.25% (वी / वी) glucoamylase (~ 1600 AGU / एल) और से डी-starching एंजाइम समाधान तैयार1.5% (वी / वी) अल्फा amylase 0.1 एम सोडियम एसीटेट में (~ 2900 KNU-एस / एल) (पीएच 5.0))। थोक बायोमास के ग्राम प्रति 16 मिलीलीटर या 120 teabag नमूने प्रति 500 मिलीलीटर की तैयारी। नोट: जमीन बायोमास से स्टार्च को हटाने में सक्षम लोडिंग एंजाइम लोडिंग और अनुपात की एक सीमा के साथ पाचन के बाद स्टार्च के लिए परीक्षण द्वारा अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए।
- एक प्लास्टिक कंटेनर में, थोक जमीन बायोमास की 1 ग्राम प्रति डे-starching एंजाइम समाधान के 16 मिलीलीटर जोड़ें। एक बैच डे-starching प्रोटोकॉल के लिए, बफर एंजाइम समाधान के 500 मिलीलीटर के लिए 120 teabags जोड़ें।
- संभव स्टार्च को दूर करने के लिए 120 rpm पर 24 (± 4) घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन में सेते हैं।
- डी-starching ऊष्मायन के बाद कुल्ला और 30 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी के कई लीटर में बायोमास लेना। झरना के लिए गर्म तरल इथेनॉल, जिससे समाधान के स्तर में अचानक और हिंसक वृद्धि में परिणाम कर सकते हैं कि समाधान में गैस के बुलबुले की मार (गठन पैदा कर सकता है कि बफर लवण दूर करने के लिए इस प्रक्रिया को दो अतिरिक्त बार दोहराएँनिकासी के दौरान प्रतिक्रिया पोत) से बाहर।
- डी-रस्मी बायोमास के संपूर्ण rinsing के बाद, निकासी के लिए Soxhlet स्तंभ में teabags जगह है। कोई नोक इस कदम के लिए आवश्यक है।
- 95% इथेनॉल का उपयोग, Soxhlet भाटा की स्थापना की और 24 घंटे के लिए नमूने निकाल सकते हैं।
- Soxhlet रिएक्टर से teabags निकालें और एक फ्लैट ट्रे पर एक परत में फैल गए।
- नमूने एक धूआं हुड में कमरे के तापमान पर रातोंरात सूखे की अनुमति दें।
- Teabags उतारना और मूल बारकोड वाले विरोधी स्थैतिक बैग को सूखे बायोमास वापसी।
नोट: विरोधी स्थैतिक बैग हैंडलिंग विशेषताओं, बायोमास में स्थैतिक बिजली को कम करने में सुधार लाने के कुशल हैं। अन्य भंडारण विकल्प का इस्तेमाल कर रहे हैं, तो अतिरिक्त बायोमास के कारण भंडारण कंटेनर की ओर करने के लिए बायोमास पकड़ करने की जरूरत हो सकती है। - एक बारकोड वाले हॉपर को सूखे बायोमास के कम से कम 50 मिलीग्राम स्थानांतरण (अधिक माल का उपयोग सही वितरण के लिए बेहतर है)। एसविरोधी स्थैतिक बैग व प्राप्त हॉपर की बारकोड सटीक नमूना ट्रैकिंग सुनिश्चित करने के लिए कर सकते हैं।
- ठोस रैक में नमूने के आदेश के करीब ध्यान दे, रोबोट वजन पर लोड हॉपर। इस्तेमाल किया प्लेटों की संख्या के आधार पर वितरण प्रोटोकॉल सभी नमूनों होते हैं और चयन करने के लिए पर्याप्त रिएक्टर प्लेटों लोड करें।
- रोबोट एसिड प्रतिरोधी स्टेनलेस स्टील 96 अच्छी तरह प्लेटों में (0.3 मिलीग्राम ±) सूखे नमूनों की 5 मिलीग्राम वजन। किसी भी स्थानीय विविधताओं को कम से कम करने के लिए थाली के चारों ओर वितरित प्रत्येक नमूने की 3 प्रतिकृति वजन।
- परख प्रदर्शन को ट्रैक करने के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता बायोमास मानक सामग्री के 8 नियंत्रण बायोमास के नमूने शामिल हैं। कई प्लेटों के लिए, कई मानक बायोमास हॉपर का उपयोग दोहराया वितरण चक्र पर हॉपर में sieving की वजह से कण आकार के बहाव को कम कर देंगे।
नोट: प्रत्येक थाली में, 3 प्रतिकृति, विआयनीकृत पानी और एंजाइम से मिलकर 4 कारतूस, और 8 विवाद के साथ 24 नमूने नहीं होनी चाहिएरास, पहले से विशेषता मानक बायोमास का उपयोग कर। प्लेट के 4 कोनों में से प्रत्येक के तीन कोने कुओं चीनी मानकों के लिए आरक्षित हैं। - गुमराह बायोमास कणों के लिए खाली और चीनी मानक कुओं चेक करें और अगर मौजूद है हटा दें।
- अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए विआयनीकृत पानी के 250 μl जोड़ें, और सिलिकॉन चिपकने वाला समर्थित polytetrafluoroethylene (PTFE) टेप के साथ प्लेटों सील।
- एक 1/8 "टांका लोहे टिप का उपयोग करना, एक थाली के लिए प्रत्येक भाप पोर्ट (117 कुल) पर PTFE टेप घुसाना। एक गाइड के रूप में सील रिएक्टर प्लेट पर खड़ी एक खाली प्लेट का प्रयोग करें और PTFE फिल्म आंदोलन को प्रतिबंधित करने के लिए।
- कसकर ऊपर और ढेर के नीचे पर प्लेटें और खाली प्लेटों के बीच 0.031 "मोटी कांच प्रबलित PTFE गास्केट (भाप बंदरगाहों के लिए छेद के साथ पहले से मुक्का मारा) के साथ प्लेटों दबाना। 17.5 मिनट, या वांछित गंभीरता के आधार पर अन्य तापमान / समय संयोजन के लिए 180 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक भाप रिएक्टर का उपयोग कर नमूने Pretreat।
- 50 डिग्री के लिए कूल रिएक्टर प्लेटों; सी विआयनीकृत पानी के साथ बाढ़ से।
- एंजाइमी शर्करीकरण
- 1.0 एम सोडियम साइट्रेट, पीएच 5.0 में 8% (वी / वी) एंजाइम समाधान से मिलकर एक enzymatic शर्करीकरण समाधान तैयार है। रिएक्टर प्रति प्लेट 5 मिलीलीटर तैयार करें। नोट: विशिष्ट शेयर एंजाइम समाधान की गतिविधि और प्रोटीन सामग्री के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए आवश्यक कमजोर पड़ने।
- प्लेटों शांत कर रहे हैं, 20 मिनट के लिए 1,500 XG पर एक झूलते बाल्टी रोटर में उन्हें अपकेंद्रित्र। फिल्म सील निकालें। नोट: ये प्लेटें भारी होते हैं और सेंट्रीफ्यूज विनिर्देशों संगतता के लिए जाँच की जानी चाहिए।
- प्रत्येक अच्छी तरह से (छ बायोमास प्रति 70 मिलीग्राम एंजाइम) के लिए 8% एंजाइम स्टॉक समाधान के 40 μl जोड़ें।
- नई PTFE टेप के साथ reseal। चुंबकीय थाली दबाना में सील कर प्लेट में रखें।
- धीरे उलटा द्वारा नमूने (कम से कम 15 बार) का मिश्रण है, और 70 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- शर्करीकरण यह निष्कर्ष निकाला गया है, उलटा द्वारा मिश्रण और 1500 x में प्लेटें अपकेंद्रित्र20 मिनट के लिए जी।
- चीनी परख
- 6 ग्लूकोज और 0.014 एम साइट्रेट बफर में सिलोज़ संयुक्त अंशांकन मानकों 0 से 0.750 मिलीग्राम / मिलीलीटर से लेकर (पीएच 5.0) का एक सेट तैयार (0, 0.2, 0.3, 0.45, 0.65, और 0.75 मिलीग्राम / एमएल) की सिफारिश की और 0-0.600 मिलीग्राम / एमएल (0, 0.1, 0.2, 0.35, एमएल सिफारिश 0.45 और 0.6 मिलीग्राम /) क्रमशः ग्लूकोज और सिलोज़, के लिए।
- किट में दिए गए निर्देशों के अनुसार ग्लूकोज oxidase / peroxidase (GOPOD) और सिलोज़ डिहाइड्रोजनेज (XDH) अभिकर्मकों तैयार करें।
- एक विंदुक का प्रयोग, रिएक्टर प्लेट के कोने कुओं (कुल 12 कुओं) से सटे 4 कोने कुओं और बढ़त कुओं से तरल के 200 μl को हटा दें।
- एक विंदुक का उपयोग करना, एक 96 अच्छी तरह पॉलीस्टीरिन फ्लैट नीचे कमजोर पड़ने से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पानी विआयनीकृत 180 μl बांटना। 12 चीनी मानक और कोने कुओं के पानी जोड़ नहीं है (एक 96 चैनल सिर का उपयोग करता है, तो उन सुझावों निकालने के लिए)।
- एक विंदुक का प्रयोग, पीएल ग्लूकोज परख के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 180 μl GOPOD अभिकर्मक बांटनाखा लिया।
- एक विंदुक का प्रयोग, सिलोज़ परख थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 180 μl XDH अभिकर्मक बांटना।
- एक विंदुक का प्रयोग, कमजोर पड़ने की थाली के लिए 96 अच्छी तरह से रिएक्टर की थाली से 20 μl हायड्रोलायसेट aliquots के हस्तांतरण। कुओं के ऊपरी भाग से pipet बायोमास ठोस और कोने कुओं में अवशिष्ट तरल से बचने के लिए। कम से कम 10 चक्रों के लिए विचूर्णन से मिलाएं।
- एक विंदुक का प्रयोग, कमजोर पड़ने की थाली के कोने वेल्स को दो प्रतियों में, चीनी मानकों के 110 μl हस्तांतरण।
- एक विंदुक का प्रयोग, ग्लूकोज और सिलोज़ परख प्लेटों के कमजोर पड़ने की थाली से 20 μl aliquots के हस्तांतरण। विचूर्णन से मिलाएं।
- 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ग्लूकोज और सिलोज़ परख प्लेटें सेते हैं। ध्यान से पढ़ने से पहले किसी भी सतह बुलबुले को तोड़ने। संक्षेप में थाली की सतह पर पारित एक गर्मी बंदूक अच्छी तरह से काम करता है।
- एक पराबैंगनी दिखाई / 96 अच्छी तरह से प्लेट रीडर का उपयोग, 510 एनएम के लिए मापा तरंग दैर्ध्य सेट और एक अभिकर्मक खाली खिलाफ absorbance के रिकॉर्ड है।यह माप ग्लूकोज एकाग्रता के लिए आनुपातिक है जो quinonimine के गठन पर नजर रखता है। ग्लूकोज एकाग्रता 1.3.1 में तैयार अंशांकन मानकों के आधार पर अंशांकन वक्र से गणना की है।
- एक पराबैंगनी दिखाई / 96 अच्छी तरह से प्लेट रीडर का उपयोग, 340 एनएम के लिए मापा तरंग दैर्ध्य सेट और absorbance के रिकॉर्ड है। यह माप सिलोज़ एकाग्रता के लिए आनुपातिक है जो एनएडीएच को NAD + की कमी, नजर रखता है। सिलोज़ एकाग्रता 1.3.1 में तैयार अंशांकन मानकों के आधार पर अंशांकन वक्र से गणना की है।
PyMBMS 28 का उपयोग करते हुए कुल लिग्निन और लिग्निन Monomeric सामग्री 2. उच्च throughput निर्धारण
- नमूना तैयार करना
- पीस लें और कदम 1.1.1, और 1.1.6-1.1.8 में वर्णित विधियों का उपयोग कर बायोमास निकाल सकते हैं। इस पीस और प्रयोगात्मक रूप में नियंत्रण का उपयोग करने के लिए मानकों का एक सेट के निकालने में शामिल हैं।
नोट: pyMBMS measurements नहीं कण आकार निर्भर कर रहे हैं, इसलिए केवल pyMBMS प्रोटोकॉल का उपयोग करता है, तो, बायोमास तैयारी नमूना <नमूना धारक में 4 मिमी फिट करने के लिए अनुमति देने के लिए बाहर किया जाना चाहिए। - लगभग 4 मिलीग्राम एक छोटा सा रंग बांटना का प्रयोग ऑटो पारखी के लिए बनाया गया एक 80 μl स्टेनलेस स्टील के कप में तैयार बायोमास (3 से 5 मिलीग्राम वरीय)।
- विश्लेषण किया जा रहा नमूनों की कम से कम 10% इस तरह के मानकों और राष्ट्रीय प्रौद्योगिकी संस्थान से उपलब्ध उन लोगों के रूप में नियंत्रण के मानकों हैं कि यह सुनिश्चित (गन्ना खोई-8491; चिनार-8492; चीड़-8493; या गेहूं के भूसे-8494)। मानक भी पहले से ही मानक तरीकों का उपयोग किया गया विशेषता है कि विश्लेषण किया जा के लिए नमूने के अनुरूप किसी भी प्रजाति हो सकता है।
- बेतरतीब ढंग से होने के कारण समय के साथ संभव स्पेक्ट्रोमीटर बहाव को पूर्वाग्रह से बचने के लिए चिमटी का उपयोग ऑटो पारखी कप में नमूने लोड। नोट: नमूने का एक विशिष्ट यादृच्छिकीकरण एक फिर से यादृच्छिकीकरण द्वारा पीछा एक बार सभी नमूनों की माप, शामिल होंगेएक नकली माप के लिए नमूने के आदेश की। Randomization कार्यक्रमों ऑनलाइन उपलब्ध हैं।
- एक मानक छेद पंच का उपयोग, मैन्युअल कोई बांधने की मशीन के साथ ग्रुप ए / डी ग्लास फाइबर शीट से गिलास फिल्टर डिस्क का उत्पादन। चिमटी के साथ गोल ग्लास फाइबर फिल्टर पकड़ नमूना कप पर यह केंद्र, और प्रयोग के दौरान प्रत्येक कप में सामग्री सीमित करने के लिए एक 3.5 मिमी एलन रिंच का उपयोग नमूना में धक्का।
- पीस लें और कदम 1.1.1, और 1.1.6-1.1.8 में वर्णित विधियों का उपयोग कर बायोमास निकाल सकते हैं। इस पीस और प्रयोगात्मक रूप में नियंत्रण का उपयोग करने के लिए मानकों का एक सेट के निकालने में शामिल हैं।
- वाद्य प्रोटोकॉल
- प्रयोगात्मक नमूने के लिए मौजूद हो सकता है कि यौगिकों की पूरी रेंज पर शिखर तीव्रता है कि एक ज्ञात मानक का उपयोग मास स्पेक्ट्रोमीटर जांचना। ठेठ बायोमास नमूने लिए, perfluorotributylamine (PFTBA) का उपयोग करें।
- एक गैस का प्रवाह मीटर का उपयोग कर 0.9 एल / मिनट के लिए हीलियम वाहक गैस प्रवाह की दर निर्धारित किया है।
- 500 डिग्री सेल्सियस के एक pyrolysis तापमान और ऑटो पारखी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 350 डिग्री सेल्सियस के लिए इंटरफेस के तापमान को ऑटो पारखी भट्ठी सेट करें। नोट: एक 1/8 "स्टेनलेस स्टील से गरममास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए ऑटो पारखी जोड़ता है कि गर्मी टेप में लिपटे हस्तांतरण लाइन 250 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी नियंत्रक का उपयोग कर नियंत्रित किया जाता है।
- मास स्पेक्ट्रोमीटर पर डाटा अधिग्रहण शुरू और पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रा संग्रह के लिए पर्याप्त डेटा प्राप्त करने के लिए कम से कम 60 सेकंड प्रतीक्षा करें।
- 2.2.2 से विनिर्देशों के साथ स्वचालित ऑटो पारखी विधि शुरू करो। नोट: ऑटो पारखी ऑटो पारखी भट्ठी में व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक नमूना चला जाता है। कुल डाटा अधिग्रहण समय लगभग 1.5 मिनट है; हालांकि, एक ठेठ 4 मिलीग्राम नमूना के pyrolysis 30 सेकंड के बाद पूरा हो गया है।
- 0.5 सेकंड स्कैन दर पर मास स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के रिकार्ड की कुल आयन सामग्री (घरेलू)। मी / z 30-450 के बीच रिकार्ड तीव्रता।
नोट: विशिष्ट बायोमास यौगिकों 17 eV पर नरम आयनीकरण का उपयोग करें। साधन से 1000 मी / z 1 से बड़ा अंतराल रिकॉर्ड कर सकते हैं; हालांकि, दर स्कैन कंप्यूटर सीपीयू सत्ता से सीमित हो जाएगा। - मा का उपयोग कर स्पेक्ट्रा से पृष्ठभूमि निकालेंवार्षिक सॉफ्टवेयर में सुविधा बढ़ाने के लिए। नोट: डेटा संग्रह की शुरुआत में आधारभूत का एक 60 स्कैन भाग औसत पृष्ठभूमि मूल्य की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह औसत पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रा मास स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर में स्वचालित रूप से प्रयोगात्मक नमूना स्पेक्ट्रा से निकाल दिया जाता है।
- एक डेटाबेस कार्यक्रम में प्रत्येक नमूना के लिए वर्णक्रमीय डेटा युक्त मास स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर के द्वारा बनाई गई एक स्तंभ पाठ फ़ाइल, आयात और एक डेटाबेस में सभी नमूने गठबंधन। स्प्रेडशीट के लिए किसी भी लागू मेटाडाटा जोड़ें। एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर पैकेज में स्वरूपित डेटा (स्प्रेडशीट / सीएसवी फ़ाइल) आयात और pyrolyzed नमूना जनता में बदलाव के लिए खाते में स्पेक्ट्रा को सामान्य से मतलब है।
- माप में इस्तेमाल दोहराया मानक नमूनों के समूह का विश्लेषण करने के वर्णक्रम डेटा का उपयोग कर एक प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) के प्रदर्शन करने के लिए एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग, साथ ही रासायनिक के वर्गीकरण का अभिन्न अंग हैं, जो चोटियों का मूल्यांकन करने के लिएलोडिंग में यौगिकों 28 साजिश है।
पीसीए समूहों को उनके स्पेक्ट्रा की समानता के आधार पर नमूने, और मानकों के लिए एक जांच की वजह से चलाने के दौरान साधन बहाव को प्रयोगात्मक त्रुटि गेज करने की अनुमति देता है: ध्यान दें। - लिग्निन syringyl (एस) / guaiacyl (जी) अनुपात की गणना करने के लिए, एस चोटियों के क्षेत्रों राशि (मी / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, और 210) जी चोटियों के योग से और विभाजन 124, 137, 138, 150, 164, और 178 पर।
- , कुल lignin सामग्री की गणना मी / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, और 210 के साथ लिग्निन चोटियों योग करने के लिए।
- ऐसे Klason लिग्निन के रूप में, कुल लिग्निन आकलन के लिए एक मानक पद्धति को pyMBMS माप स्केलिंग के लिए एक सुधार कारक की गणना। PyMBMS का उपयोग करते हुए कि मानक नमूना के लिए मापा कुल लिग्निन सामग्री के द्वारा अलग-अलग मानक के Klason लिग्निन मूल्य फूट डालो।
- डेटा सेट में सभी तरह-प्रजातियों के लिए इस सुधार कारक लागू करें। विश्लेषण किया बायोमास के प्रत्येक प्रकार के लिए दोहराएँ। एनOTE: सुधार कारक काफी विश्लेषण किया बायोमास के एस / जी के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
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Representative Results
thermochemical pretreatment और बाद के एंजाइम शर्करीकरण के संयुक्त प्रभाव परख के अंत में जारी ग्लूकोज और सिलोज़ के द्रव्यमान का एक समारोह के रूप में मापा जाता है। परिणाम बायोमास के ग्राम प्रति जारी की ग्लूकोज और सिलोज़ के मिलीग्राम के मामले में रिपोर्ट कर रहे हैं। यह आमतौर पर प्रारंभिक सामग्री के compositional विश्लेषण के आधार पर प्रतिशत सैद्धांतिक उपज के रूप में सूचना दी है, जो बेंच पैमाने assays से सूचना के आंकड़ों के विपरीत में है। यह अभी तक प्रति सप्ताह नमूने के हजारों पर compositional विश्लेषण बाहर ले जाने के लिए व्यावहारिक नहीं है के रूप में, डेटा के लिए सबसे अच्छा एक जन आधार पर रूपांतरण स्तर के रूप में सूचना दी है। तुलना की बहुत ज्यादा भिन्न नहीं है निकट से संबंधित बायोमास के नमूने और नमूने की संरचना के बीच बना रहे हैं, क्योंकि यह लंबे समय के रूप उचित नमूना मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।
परख का प्राथमिक लक्ष्य संयुक्त thermochemical / Enzym के लिए संयंत्र सेल की दीवार के प्रतिरोध में रिश्तेदार मतभेद का मूल्यांकन करने के लिए हैअलग-अलग वेरिएंट की एक सीमा के पार atic शर्करीकरण। यह परख शर्करीकरण के लिए इस्तेमाल शर्तों के किसी भी अनुकूलन करने के लिए प्रयास नहीं करता है कि ध्यान देने योग्य है। वास्तव में, pretreatment गंभीरता की स्थिति सैद्धांतिक के 50% से 70% की एक अंतिम रूपांतरण उपज को निशाना, परख की संवेदनशीलता रेंज का विस्तार करने के लिए काफी उपअनुकूलित हैं। पर या इष्टतम पास pretreatment की स्थिति बहुत परख के गतिशील रेंज को सीमित करने, उच्च रूपांतरण करने के लिए सभी नमूनों धक्का होगा। इसके विपरीत, एंजाइम लोड हो रहा है आम तौर पर बेंच पैमाने पाचन के लिए सूचित किया है कि अधिक से अधिक है। फिर, विधि के लक्ष्य के लिए सबसे अच्छा एंजाइम पाते हैं या एंजाइम लागत को कम करने के लिए, लेकिन रूपांतरण करने के लिए सेल दीवारों के आंतरिक अवज्ञा मापने के लिए और बहुत ही उच्च एंजाइम लोडिंग का उपयोग परख से परिवर्तनशीलता को हटा करने के लिए नहीं है।
अंत में, यह समग्र परख में परिवर्तनशीलता benc के लिए सूचना दी कि तुलना में काफी अधिक है कि यह समझना महत्वपूर्ण हैज पैमाने पर काम करते हैं। रेंज बहुत व्यापक है, हालांकि ठेठ मानक त्रुटियों, 8% के आसपास हैं। यह बस छोटे पैमाने पर, HTP अनुसंधान की प्रकृति है। बाष्पीकरणीय और संक्षेपण नुकसान कर रहे हैं के रूप में pipetting और वजन त्रुटियों, μl और मिलीग्राम पैमाने पर आनुपातिक रूप में अधिक हैं। यानी, 5 मिलीग्राम बनाम एकाधिक जी, प्रत्येक नमूने में परिमाण कम कणों के कई आदेशों परख करने की क्रिया जब बायोमास विविधता एक बहुत बड़ी चर हो जाता है। वर्णमिति assays ग्लूकोज और सिलोज़ एचपीएलसी परिणामों के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधी निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया; चीनी के विश्लेषण के लिए एंजाइम से जुड़ी assays जल्दी कर रहे हैं और समानांतर में किया जा सकता है, जबकि हालांकि, वे इस तरह के एचपीएलसी के रूप में विश्लेषणात्मक तरीकों, अस्पष्टता की एक और परत शुरू (चित्रा 1) के रूप में सटीक नहीं हैं।
कारण उपरोक्त कारणों में से सभी के लिए, परिणाम केवल व्याख्या की जानी चाहिए और कुछ सीमाओं के भीतर सूचना दी। डेटा संपूर्ण सेट, के रूप में अलग-अलग नहीं नमूनों में जांच की जानी चाहिए। प्रतिकृति के विदेश मंत्रालय के लिए आवश्यक हैंningful का परिणाम है। रुझान और outliers सार्थक कर रहे हैं, लेकिन एकल परिणाम नहीं हैं। तुलना के लिए सबसे अच्छा एकल प्रायोगिक सेट के भीतर बना रहे हैं। अस्थायी या स्थानिक अलग अभियानों में तुलना सार्थक होने के लिए बेहद तंग नियंत्रण और सावधान जांच की आवश्यकता है। HTP डेटा bench- या अन्य पैमाने पर डाटा को सीधे तुलनीय नहीं है। रुझान HTP और अन्य तराजू के बीच ट्रैक, लेकिन प्रत्यक्ष नमूना तुलना के समान परिणाम उपज नहीं है।
डेटा प्रतिनिधित्व आम तौर पर रुझान, outliers, या उप जनसंख्या / संस्करण तुलनाओं में गिर जाता है। प्रवृत्तियों का एक उदाहरण संयुक्त राज्य अमेरिका के 19 के उत्तर पश्चिमी प्रशांत में एक विस्तृत श्रृंखला पर जांचा चिनार के 755 प्राकृतिक वेरिएंट की अवज्ञा के एक सर्वेक्षण है। pyMBMS द्वारा निर्धारित रूप में इन नमूनों की अवज्ञा उनकी लिग्निन सामग्री और syringyl / guaiacyl अनुपात के खिलाफ साजिश रची गई थी। परिणाम एस / जी के रूप में उगता, अवज्ञा लगभग 2 में से एक एस / जी अनुपात, जहां अवज्ञा इंप्रेशन तक कम हो जाती है कि संकेत मिलता हैovement बंद का स्तर (चित्रा 2)। Outliers स्पष्ट रूप से Pt4CL1 जीन चिनार में नीचे विनियमित किया गया था जहां चित्रा 3 में देखा जा सकता है। कई सौ कल्टीवर्स जांच की गई और कम चीनी रिहाई के सबूत के रूप में कई स्पष्ट रूप से अवज्ञा में बढ़ रहे हैं। 4 चित्रा कई अलग अलग गेहूं के भूसे किस्मों के विकास की स्थिति में कई बदलाव के बाद दो साल और फसल पर कई स्थलों पर बड़े हो रहे थे, जिसमें एक अध्ययन में दर्शाया गया है इसके बाद के संस्करण चर के संयोजन पर आधारित 20 अलग आबादी में जिसके परिणामस्वरूप। ये नमूना सेट आसानी से प्रतिष्ठित हैं और अवज्ञा के लिए सकारात्मक और नकारात्मक चर संकेत मिलता है। PyMBMS सेल दीवार संरचना में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 5 से पता चलता है। मास वर्णक्रमीय टुकड़े अलग लिग्निन मोनोमर्स (1 टेबल) को सौंपा है। उच्च कार्बोहाइड्रेट सामग्री बनाम उच्च लिग्निन के साथ एक नमूना की तुलना, वर्णक्रमीय डेटा में असमानताओं को स्पष्ट कर रहे हैं। टीवह 6 चित्र में सचित्र है एक प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) के साथ मिलकर pyMBMS डेटा का इस्तेमाल करते हैं। इस उदाहरण में, नमूने कम या उच्च नाइट्रोजन निषेचन के अनुसार वर्गीकृत कर रहे हैं। लिग्निन और कार्बोहाइड्रेट सामग्री PC1 साथ व्युत्क्रमानुपाती पंक्ति में। प्रमुख घटक लोडिंग साजिश का उपयोग रासायनिक लक्षण लक्षण नमूना समूहों के बीच बदल रहे हैं स्कोर जो वर्गीकरण साजिश, साथ ही elucidating में विस्तार से बताया जा रहा है जो की पहचान करने में सहायता कर सकते हैं।
चित्रा 1: एचपीएलसी 9 बनाम उच्च throughput वर्णमिति assays का उपयोग ग्लूकोज और सिलोज़ quantitation की तुलना। ग्लूकोज और सिलोज़ का पता लगाने की तुलना सिलोज़ डिहाइड्रोजनेज (XDH, शीर्ष पैनल) और ग्लूकोज oxidase / peroxidase (GOPOD, कम पैनल) उच्च throughput वर्णमिति एंजाइम से जुड़ी assays और उच्च प्रदर्शन एल का उपयोग किया गयाiquid क्रोमैटोग्राफी।
चित्रा 2:। लिग्निन अंश में (एस / जी) सामग्री guaiacyl को syringyl के एक समारोह के रूप में चिनार सेल दीवारों की अवज्ञा बढ़ाने में लिग्निन 9 (एस / जी) सामग्री guaiacyl को syringyl के एक समारोह के रूप में चिनार सेल दीवारों की जिद है मनाया और सूचना दी गई। एक ही चिनार फसल की 755 चिनार कोर के नमूने उत्तर अमेरिकी प्रशांत नॉर्थवेस्ट में जंगल के कई सौ मील की दूरी पर ले लिया है और thermochemical pretreatment के बाद ग्लूकोज और सिलोज़ रिहाई के लिए जांच की और शर्करीकरण एंजाइम थे। PyMBMS द्वारा निर्धारित रूप में परिणाम कोशिका दीवार लिग्निन में S / जी अनुपात के खिलाफ साजिश रची थे। अवज्ञा के बारे में 2, यह उच्च एस / जी पर लगातार बना रहता है, जहां तक एस / जी को बढ़ाने के साथ कम हो जाती है। सैद्धांतिक उपज मूल्यों BESc 'मानक' चिनार के आधार पर कर रहे हैं और एक जनमत संग्रह के रूप में प्रदान की जाती हैंतुलना के लिए सीई।
चित्रा 3:। अवज्ञा चिनार में नीचे विनियमित Pt4CL1 अभिव्यक्ति में चिनार में Pt4CL1 जीन के नीचे विनियमन हालांकि कई काफी बढ़ अवज्ञा वेरिएंट को आसानी से पहचान कर रहे हैं, क्लोन के बीच सेल दीवार अवज्ञा में थोड़ा बदलाव में हुई। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े के संस्करण।
चित्रा 4: विभिन्न wheatstraw आबादी में अवज्ञा स्पष्ट रूप से पहचाने अवज्ञा के स्तर में फसल प्रकार, खेती की साइट है, उर्वरक आवेदन, और पानी दर परिणाम का प्रभाव।। विभिन्न प्रतीकों विभिन्न प्रतिनिधित्वप्रयोगात्मक विकास की स्थिति NT। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5:। संयंत्र सेल दीवारों 28 में रासायनिक परिवर्तन के विश्लेषण के लिए pyMBMS के आवेदन तीर के साथ चिह्नित चोटियों लिग्निन टुकड़े कर रहे हैं, और (क) उच्च लिग्निन (ख) मध्यम लिग्निन या (ग) कम लिग्निन सामग्री का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया।
चित्रा 6:। उच्च और निम्न निषेचन दरों 28 के साथ हो गई आबादी वाले पेड़ों की कोशिका दीवार रसायन शास्त्र में मतभेद के प्रमुख घटक विश्लेषण के स्कोर साजिश (शीर्ष) प्रमुख घटक विश्लेषणस्कोर एक अलग वर्गीकरण illustrating साजिश है, और इसलिए, अधिक जनसंख्या वाले पेड़ों की कोशिका दीवार रसायन शास्त्र में मतभेद उच्च और निम्न निषेचन दरों के साथ हो गई। प्रमुख घटक 1 (नकारात्मक) उच्च लिग्निन या उच्च कार्बोहाइड्रेट (सकारात्मक) सामग्री पर आधारित नमूने विभाजित। (नीचे) प्रमुख घटक लोडिंग रासायनिक घटकों के स्कोर साजिश में नमूने के दो समूहों के बीच परिवर्तन जो स्पष्ट। सकारात्मक लोडिंग नकारात्मक सहसंबद्ध लोडिंग इसलिए नकारात्मक स्कोर और, उच्च lignin सामग्री के साथ पंक्ति में है, जबकि उच्च कार्बोहाइड्रेट सामग्री के प्रतिनिधि हैं जो सकारात्मक स्कोर, के साथ संबंध स्थापित।
| मी / z | आण्विक कार्यभार 30 | एस / जी / एच कार्यभार |
| 94 | फिनोल | एस / जी / एच |
| 120 | Vinylphenol | एच |
| 124 | Guaiacol | जी |
| 137 | Ethylguaiacol, homovanillin, coniferyl शराब | जी |
| 138 | Methylguaiacol | जी |
| 150 | Vinylguaiacol | जी |
| 154 | Syringol | एस |
| 164 | Allyl- + propenyl guaiacol | जी |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | एस |
| 168 | 4-मिथाइल-2,6-dimethoxyphenol | एस |
| 178 | Coniferyl एल्डिहाइड | जी |
| 180 | Coniferyl शराब, syringylethene | एस, जी |
| 182 | Syringaldehyde | एस |
| 194 | एस | |
| 208 | Sinapylaldehyde | एस |
| 210 | Sinapylalcohol | एस |
तालिका 1:। PyMBMS द्वारा पता लगाया ठेठ यौगिकों के मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाया रूप लिग्निन व्युत्पन्न पायरोलिसिस टुकड़े के लिए पीक मी / z और कार्य सूची। इवांस, आरजे और टीए मिल्ने (1987) पर आधारित आणविक कार्य। । 123-137: बायोमास ऊर्जा और ईंधन 1 (2) के pyrolysis की आण्विक विशेषता।
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Discussion
इस प्रकार के रूप में उच्च throughput प्रदर्शन प्रयोगों का आयोजन जब सही और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण नमूना तैयार कदम उठाए हैं:
चीनी जारी परख:
सामान्य तौर पर, नमूने में कुछ दर्जन से एक समय में कई हजार से लेकर बहुत सारी में तैयार कर रहे हैं। प्रत्येक प्रमुख कदम आम तौर पर नमूने के बीच तैयारी में बदलाव को कम करने के क्रम में आगे बढ़ने के लिए पहले सभी नमूनों के लिए किया जाता है। डी-starching मूल रूप प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं था और कुछ मामलों में छोड़ा जा सकता है। लकड़ी कोर के नमूने और senesced घास सामग्री इसलिए परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए डी-starching की आवश्यकता नहीं है, स्टार्च में लगातार कम होते हैं और। स्टार्च एक प्रमुख चिंता का विषय है; हालांकि, विशेष रूप से फसल कई घंटे से अधिक होता है, जहां बड़े नमूना सेट के लिए हरी टिशू पौधों का नमूना सेट में। स्टार्च का स्तर दिन के उजाले घंटे के दौरान वृद्धि और अंधेरे के दौरान समाप्त हो रहे हैं के रूप में, स्टार्च स्तरों खत्म हो चुका है काफी भिन्न हो सकते हैंस्टार्च से everal ज और ग्लूकोज सेल्यूलोज से ग्लूकोज से पृथक है, इसलिए, उच्च स्टार्च स्तरों distortedly कम अवज्ञा माप करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। destarching कदम में वास्तविक एंजाइम लोड हो रहा है के रूप में लंबे समय स्टार्च हाइड्रोलिसिस कदम की समय सीमा के भीतर सभी सुलभ स्टार्च को दूर करने के लिए पर्याप्त अतिरिक्त गतिविधि नहीं है, के रूप में कम चिंता का विषय है। इस्तेमाल हुए विशिष्ट एंजाइमों में बदलाव, समय, तापमान, स्टार्च हटाने कदम की मात्रा और आंदोलन दर निश्चित रूप से स्टार्च हटाने का स्तर और दरों में अंतर पैदा कर सकते हैं और संभव है जब अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। निकासी के लिए teabags लपेटकर अंत में, जब, टिन-लेपित तांबे के तार का उपयोग करें। नंगे तांबे के तार झूठी चीनी मूल्यों दे रही है, एंजाइम समाधान के साथ अवांछित रासायनिक प्रतिक्रियाओं पैदा कर सकता है। स्टेनलेस स्टील के तार कसकर बंद teabags रखने के लिए पर्याप्त निंदनीय नहीं था, जबकि टिन-लेपित तांबे इस समस्या का समाधान हो।
बायोमास के अनुरूप आकार में कमी ACCU के लिए महत्वपूर्ण है1) पतले और अधिक आसानी से और लगातार तिरस्कृत करते हुए, बायोमास milled भी मोटे सामग्री से पचाने के लिए आसान है: दो कारणों के लिए दर डेटा। 2) भी है मोटे अपर्याप्त सामग्री है, जिसके परिणामस्वरूप हॉपर रोकना कर सकते हैं या, रोकना केवल आंशिक रूप से उद्घाटन बाधा डाल रही है, तो यह नमूना मनाया अवज्ञा कम है, के माध्यम से ठीक कणों एक चलनी के रूप में कार्य और केवल अनुमति दे सकते हैं कि बायोमास। बहुत कम बायोमास हॉपर में निहित है, तो यह कोट मई हॉपर ग्रहण करने के लिए रोबोट के कारण हॉपर के पक्ष खाली है, और नमूना वितरण प्रक्रिया में छोड़ दिया जाएगा। इसके अतिरिक्त, बायोमास के निम्न स्तर (जैसे छिलका) के रूप में सघन कणों शंकु की तह तक चलनी के लिए और पहले तिरस्कृत हो जाते हैं, खासकर के रूप अतिरंजित नमूना विविधता के लिए योगदान कर सकते हैं। सामग्री के कम से कम 50 मिलीग्राम उपलब्ध होता है, परख अभी भी बाहर किया जा सकता है; हालांकि, नमूने हाथ से तौला जाना चाहिए। हालांकि, हाथ-तौल के परिणामों को लूटने से उन लोगों की तुलना में अधिक चर रहे हैंकान का वजन।
तैयारी के चरण के लिए आवश्यक बायोमास की वास्तविक राशि अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है। हम एक उचित प्रारंभिक बिंदु के रूप में 250 मिलीग्राम का सुझाव दिया है, हालांकि, प्रत्येक बायोमास नमूना होने के कारण, हैंडलिंग, पीस और निकालने के साथ ही हॉपर में आयोजित किया जा रहा है या reproducibly तिरस्कृत किया जा रहा करने के लिए घाटे के बारे में अलग अलग विशेषताओं को दर्शाती है। प्रकार भर में और यहां तक कि एक ही प्रकार के भीतर बायोमास की विविधता के लिए एक अधिक परिभाषित प्रोटोकॉल अलग करता है। अनुभव यह आसान बनाने करता है, हालांकि इन परख तरीकों को लागू करने के इच्छुक लोगों को बस, खुद के लिए इन चर के कई निर्धारित करने की आवश्यकता होगी।
त्रुटि को लागू कर सकते हैं कि एक और कदम बेहद मुश्किल है और कई कारणों से इन assays में महत्वपूर्ण है जो microtiter प्लेट में मिश्रण है। इस्तेमाल किया एंजाइम समाधान केंद्रित है और बायोमास के लिए एंजाइम पहुंच को सीमित करने, कुओं के अलावा पर स्तरीकृत जा सकता है। शर्करीकरण रूप में आय, SUGएआरएस भी विभक्त हो जाना और बायोमास के पास ध्यान केंद्रित करने और नमूना गहराई पर निर्भर करता है, चीनी assays के कृत्रिम रूप से उच्च या कम किया जा सकता है हो सकता है का विमोचन किया। इस तरह से यह महत्वपूर्ण लगातार चीनी के विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए भी शर्करीकरण और उसके एवज में शर्करा के समान वितरण के लिए बायोमास के साथ एंजाइमों की पूरी तरह से मिश्रण की इजाजत दी, एंजाइम अलावा और एंजाइम शर्करीकरण के बाद नमूने मिश्रण करने के लिए क्यों है। इस तरह के कमजोर पड़ने या परख प्लेटों के रूप में बायोमास शामिल नहीं है कि प्लेटों में, pipetting दोहराया (विचूर्णन) द्वारा मिश्रण झटकों की तुलना में कहीं बेहतर साबित हो गया है। इस प्रोटोकॉल में समाधान तरल स्तंभ में चर घनत्व और कण स्तर, pipetting गति और ऊर्ध्वाधर टिप स्थान है लेकिन, जैसा कि महत्वपूर्ण है। गति टिप में होने के कारण गुहिकायन (आकांक्षा) के लिए भी तेजी से, गरीब सटीकता और तरल प्रतिधारण है, तो हो सकता है (वितरण)। टिप अच्छी तरह से भी गहरी है, बायोमास टिप रोकना सकता है या टिप सटीक आकांक्षा को रोकने, नीचे करने के लिए दबाया, और भी हो सकते हैंतरल अगले कदम के लिए और Carryover चिपटना करने के लिए और अधिक बाहरी सतह क्षेत्र है। धीमी टिप हटाने तरल सतह तनाव से थोक समाधान करने के लिए हटाया जा करने की अनुमति देता है के रूप में बाद इस मुद्दे को कुछ हद तक नियंत्रण टिप वापसी की गति को कम किया जा सकता है। टिप वापसी भी धीमी है, pipetted तरल के रूप में अच्छी तरह से वापस थोक समाधान में उभरा सकता है। बायोमास कण भी एक प्रवृत्ति युक्तियों से जुड़े हुए हैं और विश्लेषण किया जा रहा नमूना संस्करणों में अशुद्धियों बनाने, वे परख प्लेटों के लिए मिश्रण या स्थानांतरण के दौरान टिप रोकना कर सकते हैं जहां कमजोर पड़ने की थाली, को हस्तांतरित हो गए हैं। वे पढ़ने के दौरान प्रकाश किरण रोक देना है, तो इन कणों को भी परख प्लेटों के स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।
लगातार रंग विकास समय GOPOD और XDH assays के लिए महत्वपूर्ण है। रंग-विकास पूरा करने के लिए जाने की अनुमति दी जानी चाहिए; हालांकि, GOPOD परख रंग पूरा होने और XDH परख द्वारा उत्पन्न एनएडीएच के बाद बढ़ती जारी करने की आदत है धीरे-धीरेकारण NADH की सहज ऑक्सीकरण के लिए कम हो जाती है। नतीजतन, परिवर्तनशीलता समय अलग प्लेटों के बीच डेटा की असंगत तुलना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। कारण हार्डवेयर या सॉफ्टवेयर के मुद्दों के लिए ठहराव परख के दिनों में बड़े मतभेद पैदा कर सकते हैं के रूप में परख कदम है, ध्यान से निगरानी की जानी चाहिए। प्रत्येक थाली में चीनी मानकों और मानक बायोमास नियंत्रण कुओं का उपयोग कुछ हद तक इस कम करने में मदद कर सकते हैं।
PyMBMS:
मानकों को ध्यान से मानक गीला रासायनिक तरीकों की तुलना के लिए pyMBMS प्रयोगों के लिए विचार किया जाना चाहिए। कारण बायोमास प्रजातियों के भिन्न लिग्निन रचना (एस / जी अनुपात) को, सुधार कारक प्रयोगात्मक नमूने के रूप में एक ही प्रजाति है कि एक प्रतिनिधि मानक का उपयोग निर्धारित किया जाना चाहिए। उपलब्ध कोई उचित मानक नहीं कर रहे हैं, लिग्निन एकाग्रता में मतभेद सीधे लिग्निन व्यापारियों की तीव्रता का उपयोग की तुलना की जा सकती है। (अधिक ~ 3.5) उच्च एस / जी अनुपात एल की overestimation करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैंpyMBMS द्वारा ignin सामग्री। एस लिग्निन अधिमान्यतया इस विधि में इस्तेमाल मानक शर्तों के तहत जारी किए जाने के लिए इस प्रवृत्ति के कारण होता है। इसके अलावा, pyMBMS मापन के लिए आवश्यक नमूने की राशि का इस्तेमाल बायोमास के प्रकार पर निर्भर करता है। पृथक लिग्निन और लिग्निन मॉडल यौगिकों डिटेक्टर तर कर सकते हैं नमूना के बड़े aliquots का उपयोग के रूप में, कम सामग्री (0.1 मिलीग्राम) की आवश्यकता होती है।
PyMBMS प्रक्रिया में एक और महत्वपूर्ण कदम एक प्रयोग के पहले इस तरह के perfluorotributylamine (PFTBA) के रूप में एक ज्ञात मानक के साधन से सावधान ट्यूनिंग है। PFTBA ठेठ बायोमास के पूरे स्पेक्ट्रम भर में आणविक चोटियों में शामिल है और इसलिए, प्रयोगात्मक रन के बीच एक समान साधन ट्यूनिंग की अनुमति देता है। कि मी / z 131 और मी / z 219 लगभग मी / z 69. की तीव्रता का 50% इस ट्यूनिंग मुलायम आयनीकरण के तहत देखा ठेठ चोटियों पर बल प्रयोग कर रहे हैं (17 eV) का इस्तेमाल किया है ताकि PFTBA स्पेक्ट्रा के मध्य क्षेत्र देखते है कम आम जनता है कि करने के आयनों के विखंडन को कम से कम करने के लिए ग Annot को आसानी से पहचाना जा सकता है।
यह इन तरीकों ब्याज की analytes की सटीक मात्रा का ठहराव के लिए विश्लेषणात्मक तरीकों नहीं कर रहे हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए। दरअसल, इन उच्च throughput तकनीक बड़े बायोमास की स्क्रीनिंग वांछित रासायनिक लक्षण रखने उन लोगों की पहचान करने के लिए सेट के लिए कर रहे हैं। इन तरीकों में केवल एक डेटा सेट के भीतर स्क्रीनिंग, रैंकिंग, और नमूने के सहसंबंध के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इस तरह के वाद्य बहाव, एंजाइम गतिविधि में परिवर्तन, बायोमास में परिवेश नमी की मात्रा के रूप में अंतर के स्रोतों के कारण अलग अलग दिनों पर एकत्र जब डेटा सेट सीधे कारण आर्द्रता में परिवर्तन, तापमान में उतार-चढ़ाव, और सुझावों में मतभेद और absorbance के प्लेट बहुत से तुलना नहीं की जा सकती । इसके अतिरिक्त, नमूना तैयार प्रोटोकॉल में इस्तेमाल pretreatment के एक अनुकूलित pretreatment रणनीति नहीं है, बल्कि विशेष रूप से उप इष्टतम होने के लिए डिजाइन किया गया है। यह पौधों के बीच सूक्ष्म अंतर और अधिक कुशलता से elucidated किया जाना सक्षम बनाता है।
jove_content "> उच्च तरीकों को गोद लेने का मुख्य लाभ कई और अधिक नमूने एक ही समय अवधि 18 में मापा जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक एसिड या एंजाइमी शर्करीकरण के दौरान उत्पादन कार्बोहाइड्रेट का विश्लेषण करने के लिए एक आम तरीका उच्च प्रदर्शन का इस्तेमाल होता है तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC)। सेलिग एट अल।, संरचनात्मक कार्बोहाइड्रेट की मात्रा का ठहराव के लिए काफी उपयोगी और सर्वोपरि हालांकि देशव्यापी दो कदम एसिड हाइड्रोलिसिस,। सप्ताह 9 के अनुसार लगभग 25 नमूनों का मूल्यांकन करने में सक्षम होने के लिए शोधकर्ताओं को सीमित करता है कि राज्य विश्लेषणात्मक जबकि उच्च throughput के तरीके में कार्यरत इंस्ट्रूमेंटेशन एचपीएलसी तरह एक मानक तकनीक की संवेदनशीलता, तेजी से विश्लेषण शोधकर्ताओं के नमूनों की बड़ी मात्रा का आकलन करने में सक्षम होने की विलासिता की अनुमति प्रदान नहीं कर सकते। इसके अलावा, उच्च-तरीकों अक्सर प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल downscaled है, उपभोग्य के उपयोग को कम करने, और इसलिए, प्रयोगात्मक लागत और कचरे को कम।Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
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