Introduction
كما المعروض العالمي من الوقود غير المتجددة والتي تراجع المنتجات المرتبطة بها، وقد تحدى العلماء لخلق الوقود مماثلة والمواد الكيميائية من مصادر المشتقة من النباتات 1. أحد الجوانب الرئيسية لهذا العمل هي تحديد أي نوع من النباتات قد تكون مناسبة لإنتاج الوقود الحيوي والمواد الحيوية 2،3. عادة، يتم تقييم هذه المواد الأولية لاللجنين، السليلوز، والمحتوى هيميسيلولوز. فضلا عن قابليتها للالتفكيكية (عناد) من خلال المعالجة الحرارية والميكانيكية، و / أو كيميائية مع أو بدون لاحقة انزيم التسكير. تستخدم تحليلات أكثر تفصيلا لتحديد التشكيل المحدد لاللجنين وهيميسيلولوز الكسور وكذلك الأنشطة الإنزيمية المثلى اللازمة. وقد وفرت التعديلات المعدلة وراثيا من النباتات التي لا تملك في جوهرها الصفات المثالية لتحويل الكيمياء الحيوية أو حراري للسلع المطلوبة للباحثين مصدر توسعت بشكل كبير من وعاءالمواد الأولية ential 4. الطرق التحليلية القياسية لقياس الصفات الكيميائية للنبات، وإن كان مفيدا جدا لمجموعات عينة صغيرة، وغير مناسبة للفحص السريع لمئات أو آلاف من عينات 5-7. وقد تم تطوير أساليب بالمشاركه الموصوفة هنا بسرعة وكفاءة لتقييم أعداد كبيرة من المتغيرات الكتلة الحيوية للتغيرات في جدار الخلية عناد إلى تدهور حراري و / أو الأنزيمية.
فمن الأهمية بمكان أن نفهم أن فحوصات الكشف بالمشاركه ووصفت الوثيقة لم يتم تصميمها لتحقيق أقصى قدر من التحويل أو العائد. والهدف من ذلك هو تحديد الاختلافات النسبية في عناد لا يتجزأ من عينات الكتلة الحيوية ذات الصلة. ونتيجة لذلك، فإن العديد من الخطوات التحليل تختلف عن "نموذجية" المقايسات تحويل الكتلة الحيوية، حيث كان الهدف هو الحصول على الحد الأقصى لمعدل التحويل أو حد. على سبيل المثال، يتم استخدام أقل الشدة المعالجة وأقصر الأوقات إنزيم التحلل المائي لتعظيم تختلفبسبب الخلافات بين العينات. في معظم الحالات، يتم استخدام شحنات انزيم عالية نسبيا للحد من الخلافات نظرا لاختلاف التجريبي في نشاط انزيم، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج بشكل ملحوظ.
تقنيات سريعة لتحديد تكوين خلايا النبات الجدران والسكريات أحادى المحررة يلي التسكير الأنزيمية تشمل الروبوتات، حسب الطلب، متوافقة thermochemically لوحات 96-جيدا، وإدخال تعديلات على أساليب المختبر القياسية 8-11 والبروتوكولات مفيدة، مثل التحليل الطيفي الذبذبات (الأشعة تحت الحمراء (IR)، القريب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد)، أو رامان) والرنين المغناطيسي النووي (NMR) 12-17. هذه المنهجيات هي المفتاح لعزل المواد الأولية مع السليلوز عالية أو محتويات اللجنين منخفضة، أو تلك المتوقع أن يحقق أعلى الجلوكوز، الفركتوز، والإيثانول، الخ وقد مكنت هذه الأساليب التحليلات يضيق نطاق التي تستخدم كميات أقل من الكتلة الحيوية والمواد الاستهلاكية، مما يؤدي إلى تخفيضات في التجريبية حساب 18 9، الحور 8،10، تفل قصب السكر 8، والتبن 8 تم تقييم بنجاح باستخدام هذه الأساليب بالمشاركه.
مجموع اللجنين وتكوين أحادى اللجنين كما كميا عادة الصفات الكتلة الحيوية. وقد ثبت تخفيضات في محتوى اللجنين لزيادة هضم الأنزيمية من السكريات 19،20. الدور الذي لنسبة أحادى اللجنين (في كثير من الأحيان كما ذكرت syringyl / guaiacyl (S / G) المحتوى) يلعب في تفكيك جدار الخلية النباتية لا يزال قيد التحقيق. وقد أشارت بعض التقارير أن التخفيضات في S / Gأدت نسبة لزيادة الغلة الجلوكوز بعد التحلل 21، في حين أن دراسات أخرى كشف الاتجاه المعاكس 19،22. أساليب إنتاجية عالية لتقييم اللجنين وأحادية لها تشمل التحليل الطيفي الذبذبات (IR نير، ورامان 23-26) إلى جانب التحليل متعدد المتغيرات، والانحلال الحراري شعاع الجزيئي الطيفي (pyMBMS) 27،28.
عند وضع أساليب بالمشاركه لفحص الكتلة الحيوية، وتحتاج عدة اعتبارات أساسية ينبغي أن يوضع في الاعتبار. واحد الجوانب الرئيسية هو تعقيد الأسلوب. ما هو مستوى المهارة المطلوب للتقنية؟ تحليلات Chemometric، على سبيل المثال، تتطلب مهارات محددة للبناء، وتقييم، والحفاظ على النماذج التنبؤية. الطرق المعيارية يحمل غير مرغوب فيها خطوات تحليل تحضيرية أو البيانات أو توظف الكواشف السامة. تطوير نماذج عملية مستمرة حيث يتم إدخال بيانات جديدة في النموذج مع مرور الوقت لزيادة متانة النموذج. consid أخرىeration هو وفورات في التكاليف وانخفاض الأوقات تحليل التجريبية من الأساليب الإنتاجية العالية المقترحة. إذا كان الأسلوب هو سريع جدا، ولكن مكلفة جدا، قد لا تكون تقنية مجدية للعديد من المختبرات لاعتماده. الأساليب هو موضح في هذه المخطوطة هي أنواع من تقنيات موحدة أو تعديل لتضخيم القدرات الإنتاجية. هذه البروتوكولات قياس كميا الصفات الكتلة الحيوية التي تهم دون يستلزم تطوير نماذج تنبؤية. هذا هو السمة الرئيسية لهذه التقنيات، منذ أساليب التنبؤ، في حين أنه يظهر الارتباطات القوية مع معيار التحليلات المستخدمة في تطوير النماذج، ليست دقيقة مثل قياس فعلا كمية من الفائدة للعينات. في حين أن الطرق المستخدمة يتم تحجيم أساسا بانخفاض إصدارات الأساليب التحليلية مقاعد البدلاء النطاق القياسية، يتم تداول الدقة والإحكام للسرعة والإنتاجية. في الغالب، هي نتيجة لأخطاء العليا في pipetting لحجم صغير ووزن هذه النتيجة؛ فضلا عن زيادة الصورةوانخفض التجانس وافرة مثل حجم العينة. بينما مجموعات عينة كبيرة يمكن فحص ومقارنة، يجب توخي الحذر الشديد عند إجراء مقارنات بين حملات منفصلة ونتائج مقاعد البدلاء النطاق.
وتشمل معظم الخطوات تستغرق وقتا طويلا التلاعب المادي من الكتلة الحيوية. عينات طحن قد يستغرق عدة دقائق لكل عينة، بما في ذلك تنظيف مطحنة بين العينات. تحميل يدويا والتفريغ، والنطاط تنظيف وتعبئة وتفريغ أكياس الشاي وأكياس عينة هي أيضا عمل مكثفة جدا. في حين أن كل خطوة قد يستغرق دقيقة واحدة أو أكثر، والآلاف فعل عينات قد يستغرق عدة ساعات أو حتى أيام. يمكن الروبوتات تحميل لوحة مفاعل نموذجية مع الكتلة الحيوية في حوالي 3-4 ساعة أو 6-8 لوحات اليوم -1 الروبوت -1. هذا الوضع يعتمد على معايير الدقة المستخدمة وكذلك نوع وكمية الكتلة الحيوية لفحصها. ملء وحات مفاعل بالماء، وتمييع حامض، أو يتم الإنزيم بسرعة باستخدام الروبوت معالجة السائل. Pإعادة معالجة من كومة وحة (1-20 وحات مفاعل) ما يستغرق ما بين 1 و 3 ساعة عندما التجمع، ويبرد، وتضمنت التفكيك. التحلل انزيم تستغرق 3 أيام ويتطلب تحليل السكر حوالي 1 ساعة من الوقت الإعدادية بالإضافة إلى 10 دقيقة لكل لوحة مفاعل لاستكمال فحص وقراءة النتائج. جدول الأسبوعي لمجموعة المعالجة والتحليل أيام يستوعب جدول أعمال معقول، والتقليل من الفردية ساعة وعطلة نهاية الأسبوع الجهود لعنصر البشري في الفحص ويسمح للتجهيز ~ 800 إلى 1000 عينة في الأسبوع على أساس مستمر. الحد الأقصى للسرعة تعتمد على عدة عوامل، أهمها كيف هم الكثير من الأجهزة (الروبوتات، المفاعلات لوحات، الخ)، وكيف الكثير من "البرمجيات" (أي الموظفين) المتاحة للقيام بهذا العمل اليدوي. الحد الأعلى العملي هو 2500 إلى 3000 عينات / أسبوع؛ مع ذلك، أن الناتج يتطلب عملية 7 أيام في الأسبوع والطلاب المتدربين متعددة والفنيين. وبالمقارنة، فإن 3000 العينات بواسطة HPLC تتطلب ما يقرب من 125 يوما من سامتحليل التنوير القائل بالإضافة إلى العمل الإضافي وزنها يدويا العينات في المفاعلات وعينات الترشيح قبل التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عالية الإنتاجية تحديد الجلوكوز وإكسيلوسي العائد فيما يلي الأنزيمية التسكير 9،29
- إعداد نموذج (طحن، دي اتنشى، استخراج، المعالجة)
- طحن لا يقل عن 300 ملغ من كل عينة الكتلة الحيوية باستخدام طاحونة وايلي، بحيث جزيئات تمر عبر شبكة 20 (850 ميكرون) الشاشة. نقل لمكافحة ساكنة الرمز البريدي أعلى أكياس (عادة شريط ترميز) والمعلومات عينة التسجيلة الى قاعدة بيانات الباركود.
- إضافة حوالي 250 ملغ أو أكثر من الكتلة الحيوية الأرض من مكافحة ساكنة كيس لمرقمة (مع قلم رصاص، لا تستخدم الحبر أو علامة) كيس شاي، بعناية نشمر عن أكياس الشاي، ويجري التأكد من اضعاف ينتهي على الكتلة الحيوية لمنع خسارة خلال دي اتنشى والاستخراج.
- التفاف تيباج مغلقة باستخدام المغلفة القصدير الأسلاك النحاسية. تسجيل عدد تيباج لكل عينة barcoded.
- إعداد التنشية اجتثاث حل الانزيم من الإنزيمات التجارية (عادة، 0.25٪ (ت / ت) غلوكوأميلاز (~ 1600 جامعة الخليج العربي / L) و1.5٪ (ت / ت) ألفا الأميليز (~ 2900 KNU-S / L) في 0.1 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.0)). إعداد 16 مل غرام من الكتلة الحيوية الأكبر في أو 500 مل لكل 120 عينة تيباج. ملاحظة: عمليات تحميل قادرة على إزالة النشا من الكتلة الحيوية الأرض ينبغي أن تحدد تجريبيا عن طريق اختبار النشا بعد الهضم مع مجموعة من شحنات انزيم والنسب.
- في وعاء من البلاستيك، إضافة 16 مل من حل التنشية دي الانزيم لكل 1 غرام من الكتلة الحيوية الأرض السائبة. لدفعة بروتوكول دي اتنشى، إضافة 120 أكياس إلى 500 مل من محلول العازلة الانزيم.
- احتضان في شاكر في 55 درجة مئوية لمدة 24 (± 4) ساعة، في 120 دورة في الدقيقة لإزالة من الممكن النشا.
- بعد حضانة لمدة التنشية دي، وشطف وينقع الكتلة الحيوية في عدة لترات من الماء منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة. كرر هذه العملية مرتين إضافية لإزالة الأملاح العازلة التي يمكن أن تسبب الاهتزاز (تشكيل فقاعات الغاز في الحل الذي يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع مفاجئ وعنيف في مستوى من الحل، مما تسبب في الإيثانول السائل الساخن إلى شلالمن رد فعل السفينة) خلال الاستخراج.
- بعد الشطف شاملة من الكتلة الحيوية منشى دي، ووضع أكياس الشاي في العمود سوكسليت لاستخراج. لا يلزم كشتبان لهذه الخطوة.
- إعداد الجزر سوكسليت، وذلك باستخدام 95٪ من الإيثانول واستخراج العينات لمدة 24 ساعة.
- إزالة أكياس من المفاعل سوكسليت وانتشرت في طبقة واحدة في صينية مسطحة.
- السماح للعينات لتجف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان.
- انبسط أكياس والعودة الكتلة الحيوية المجففة لالأصلية barcoded أكياس مكافحة ساكنة.
ملاحظة: أكياس مكافحة ساكنة هي فعالة في الحد من الكهرباء الساكنة في الكتلة الحيوية، وتحسين التعامل مع خصائص. في حالة استخدام خيارات التخزين الأخرى، قد تكون هناك حاجة إلى الكتلة الحيوية إضافية بسبب التشبث الكتلة الحيوية إلى جانب حاوية التخزين. - نقل ما لا يقل عن 50 ملغ من الكتلة الحيوية الجافة إلى قادوس barcoded (استخدام المزيد من المواد هو أفضل للصرف دقيقة). Sيمكن الباركود من أكياس مكافحة ساكنة واثب تلقي لضمان دقة تتبع عينة.
- النطاط تحميل على المواد الصلبة وزنها الروبوت، مع إيلاء اهتمام وثيق للترتيب العينات في الرفوف. تحميل لوحات مفاعل كافية لاحتواء جميع العينات وتحديد بروتوكول صرفها بناء على عدد من لوحات المستخدمة.
- تزن آليا 5 ملغ من العينات المجففة (± 0.3 ملغ) في الفولاذ المقاوم للصدأ لوحات 96-جيدا أحمضة. تزن من 3 مكررات لكل عينة موزعة في جميع أنحاء لوحة للحد من أي اختلافات محلية.
- تشمل 8 عينات الكتلة الحيوية السيطرة على الكتلة الحيوية المادية مستوى جيدا اتسم ذلك من أجل متابعة أداء الاختبار. لوحات متعددة، فإن استخدام متعددة النطاط الكتلة الحيوية القياسية تقليل الانجراف حجم الجسيمات الناجمة عن النخل في النطاط عبر دورات الاستغناء المتكررة.
ملاحظة: في كل لوحة، وينبغي أن يكون هناك 24 عينة مع 3 مكررات، 4 الفراغات التي تتكون من الماء منزوع الأيونات وانزيم، و 8 كنترولليرة سورية، وذلك باستخدام الكتلة الحيوية القياسية تتميز سابقا. محجوزة 3 آبار الزاوية لكل من زوايا 4 من لوحة للمعايير السكر. - تحقق الآبار مستوى فارغة والسكر للجسيمات الكتلة الحيوية المخطئين وإزالة حالة وجودها.
- إضافة 250 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى كل بئر، وختم لوحات مع تترافلوروإيثيلين المدعومة من لاصق سيليكون (PTFE) الشريط.
- باستخدام 1/8 "طرف حام الحديد، اختراق الشريط PTFE في كل منفذ البخار (117 الكل) لكل لوحة. استخدام لوحة فارغة مكدسة على مختومة لوحة مفاعل كدليل وتقييد حركة PTFE الفيلم.
- المشبك لوحات بإحكام مع 0.031 "حشيات سميكة الزجاج المقوى PTFE (لكمات مسبقا مع فتحات للموانئ البخارية) بين لوحات ولوحات فارغة على أعلى وأسفل المكدس. يمهد للمعالجة العينات باستخدام مفاعل البخار لتعيين 180 درجة مئوية لمدة 17.5 دقيقة، أو تركيبات درجة الحرارة / الوقت الأخرى على أساس شدة المطلوب.
- لوحات مفاعل باردة إلى 50 درجة؛ C من الفيضانات مع الماء منزوع الأيونات.
- الأنزيمية التسكير
- يعد حل التسكير الأنزيمية التي تتكون من 8٪ (V / V) حل الانزيم في 1.0 M سيترات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.0. إعداد 5 مل لكل لوحة المفاعل. ملاحظة: التخفيف ينبغي أن تحدد على أساس النشاط والبروتين المحتوى من حل معين انزيم الأسهم المطلوبة.
- عندما لوحات هي باردة، الطرد المركزي لهم في الدلو المتأرجح الدوار في 1500 x ج لمدة 20 دقيقة. إزالة ختم الفيلم. ملاحظة: هذه اللوحات هي ثقيلة ويجب فحص مواصفات أجهزة الطرد المركزي من أجل التوافق.
- إضافة 40 ميكرولتر من 8٪ محلول المخزون انزيم إلى كل بئر (70 ملغ الإنزيم في غرام الكتلة الحيوية).
- ختم الشريط مع PTFE الجديد. وضع لوحة مختومة في المغناطيسي لوحة المشبك.
- المزيج بلطف على العينات عن طريق انقلاب (15 مرات على الأقل)، واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 70 ساعة.
- عندما قد اختتم التسكير، مزيج من قبل قلب وأجهزة الطرد المركزي لوحات في 1500 سز لمدة 20 دقيقة.
- الفحص السكر
- إعداد مجموعة من 6 الجلوكوز والفركتوز جنبا إلى جنب معايير المعايرة في 0.014 عازلة M سترات (درجة الحموضة 5.0) تتراوح 0-،750 ملغ / مل (0، 0.2، 0.3، 0.45، 0.65، و 0.75 ملغم / أوصى مل)، و0-،600 ملغ / مل (0، 0.1، 0.2، 0.35، 0.45، و 0.6 ملغ / مل الموصى بها) لالجلوكوز والفركتوز، على التوالي.
- إعداد أوكسيديز الجلوكوز / الغلوثانيون (GOPOD) والفركتوز نازعة (XDH) الكواشف وفقا لتعليمات في المجموعة.
- باستخدام ماصة، وإزالة 200 ميكرولتر من السائل من الآبار الزاوية 4 و حافة الآبار المجاورة لآبار ركنية (12 مجموع الآبار) من لوحة المفاعل.
- باستخدام ماصة، الاستغناء عن 180 ميكرولتر منزوع الأيونات الماء إلى كل بئر من شقة القاع لوحة تخفيف البوليسترين 96-جيدا. لا يضاف الماء إلى مستوى وزاوية الآبار 12 السكر (إزالة تلك النصائح في حالة استخدام رأس 96 قناة).
- باستخدام ماصة، الاستغناء عن 180 ميكرولتر GOPOD الكاشف إلى كل بئر من فحص السكر في ررأكل.
- باستخدام ماصة، الاستغناء عن 180 ميكرولتر XDH كاشف لكل بئر من لوحة زيلوز الفحص.
- باستخدام ماصة، ونقل 20 ميكرولتر قسامات حلامة من لوحة مفاعل 96-جيدا لوحة التخفيف. الماصة من الجزء العلوي من الآبار لتجنب المواد الصلبة الكتلة الحيوية والسائل المتبقي في آبار الزاوية. مزيج من قبل سحن لا يقل عن 10 دورات.
- باستخدام ماصة، ونقل 110 ميكرولتر من المعايير السكر، في نسختين، إلى الآبار ركن من لوحة التخفيف.
- باستخدام ماصة، ونقل 20 مكل من لوحة التخفيف إلى الجلوكوز والفركتوز لوحات الفحص. مزيج من قبل سحن.
- احتضان الجلوكوز والفركتوز فحص لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. كسر بعناية أي فقاعات السطح قبل القراءة. ألف بندقية الحرارة مرت فترة وجيزة على سطح اللوحة يعمل بشكل جيد.
- باستخدام 96-جيدا قارئ لوحة فوق البنفسجية / مرئية، تعيين الطول الموجي قياس إلى 510 نانومتر، وتسجيل الامتصاصية ضد كاشف فارغة.هذا القياس يراقب تشكيل quinonimine، الذي يتناسب مع تركيز الجلوكوز. يتم حساب تركيز الجلوكوز من منحنى المعايرة استنادا إلى معايير المعايرة التي أعدت في 1.3.1.
- باستخدام 96-جيدا قارئ لوحة فوق البنفسجية / مرئية، تعيين الطول الموجي قياس إلى 340 نانومتر، وتسجيل الامتصاصية. هذا القياس يراقب الحد من NAD + إلى NADH، الذي يتناسب مع تركيز الفركتوز. يتم حساب تركيز الفركتوز من منحنى المعايرة استنادا إلى معايير المعايرة التي أعدت في 1.3.1.
2. ارتفاع الإنتاجية تحديد إجمالي اللجنين واللجنين أحادى المحتوى عن طريق pyMBMS 28
- إعداد عينة
- طحن واستخراج الكتلة الحيوية باستخدام الأساليب المذكورة في الخطوات 1.1.1، و1.1.6-1.1.8. وهذا يشمل طحن واستخلاص مجموعة من المعايير لاستخدام عناصر التحكم التجريبية كما.
ملاحظة: قياس آثافة pyMBMSبيانات أدلى ليست جسيمات بحجم يتوقف، حتى ولو باستخدام بروتوكول pyMBMS، ينبغي أن يتم إعداد الكتلة الحيوية إلى السماح للعينة لتتناسب مع صاحب العينة، <4 مم. - باستخدام ملعقة صغيرة الاستغناء عن حوالي 4 ملغ (3-5 ملغ فضل) من الكتلة الحيوية مستعدة إلى الفولاذ المقاوم للصدأ كوب 80 ميكرولتر المصممة لصناعة السيارات في العينات.
- ضمان أن لا يقل عن 10٪ من العينات التي تم تحليلها هي معايير مراقبة مثل تلك المتوفرة من المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (تفل قصب السكر-8491؛ الحور-8492؛ الصنوبر 8493، أو القمح من القش 8494). المعيار يمكن أيضا أن تكون أي نوع مشابهة لعينات لتحليلها التي سبق أن تتميز باستخدام أساليب القياسية.
- عشوائيا تحميل العينات في أكواب السيارات العينات باستخدام الملقط لتجنب التحيز بسبب احتمال الانجراف مطياف مع مرور الوقت. ملاحظة: ومن شأن التوزيع العشوائي نموذجي من العينات تشمل قياس جميع العينات مرة واحدة، تليها إعادة التوزيع العشوائي-من أجل من العينات لقياس مكررة. برامج التوزيع العشوائي على شبكة الإنترنت.
- استخدام معيار حفرة لكمة، تنتج يدويا أقراص تصفية الزجاج من نوع أوراق A / D الألياف الزجاجية، مع عدم وجود الموثق. عقد الزجاج جولة تصفية الألياف مع ملاقط، مركز على مدى كأس العينة، ودفع في العينة باستخدام 3.5 ملم ألين وجع لحصر المواد في كل كوب أثناء التجربة.
- طحن واستخراج الكتلة الحيوية باستخدام الأساليب المذكورة في الخطوات 1.1.1، و1.1.6-1.1.8. وهذا يشمل طحن واستخلاص مجموعة من المعايير لاستخدام عناصر التحكم التجريبية كما.
- بروتوكول فعال
- معايرة مطياف الكتلة باستخدام معيار معروف أن لديها كثافة الذروة خلال مجموعة كاملة من المركبات التي قد تكون موجودة في العينات التجريبية. للحصول على عينات نموذجية الكتلة الحيوية، استخدم perfluorotributylamine (PFTBA).
- ضبط معدل تدفق الغاز الناقل الهيليوم إلى 0.9 لتر / دقيقة باستخدام متر تدفق الغاز.
- تعيين فرن لصناعة السيارات في العينات إلى درجة حرارة الانحلال الحراري من 500 درجة مئوية، ودرجة الحرارة واجهة إلى 350 ° C باستخدام برنامج لصناعة السيارات في العينات. ملاحظة: 1/8 "الفولاذ المقاوم للصدأ ساخنةيتم التحكم في خط نقل ملفوفة في الشريط الحرارة التي تربط لصناعة السيارات في العينات إلى مطياف الكتلة باستخدام وحدة تحكم في الحرارة 250 درجة مئوية.
- بدء الحصول على البيانات على مطياف الكتلة والانتظار على الأقل 60 ثانية للحصول على بيانات كافية لجمع أطياف الخلفية.
- بدء طريقة لصناعة السيارات في العينات الآلي للمواصفات من 2.2.2. ملاحظة: يسقط-العينات السيارات كل عينة على حدة في فرن لصناعة السيارات في العينات. إجمالي الوقت الحصول على البيانات ما يقرب من 1.5 دقيقة. ومع ذلك، من الانحلال الحراري نموذجية 4 عينة ملغ كاملة بعد 30 ثانية.
- سجل إجمالي محتوى أيون (TIC) من كل عينة باستخدام برنامج مطياف الكتلة في معدل المسح 0.5 ثانية. شدة سجل بين م / ض 30-450.
ملاحظة: المركبات الكتلة الحيوية النموذجية تستخدم التأين لينة في 17 فولت. ويمكن للأداة تسجيل فترات أكبر من م / ض 1 إلى 1000. ومع ذلك، معدل المسح سوف تكون محدودة بسبب قوة جهاز الكمبيوتر CPU. - إزالة خلفية من أطياف باستخدام أماهnual تعزيز ميزة في البرنامج. ويستخدم جزء 60 فحص خط الأساس في بداية جمع البيانات لحساب قيمة خلفية متوسط: مذكرة. تتم إزالة هذا متوسط أطياف الخلفية من العينة الأطياف التجريبية تلقائيا في البرنامج مطياف الكتلة.
- استيراد ملف نصي عمود واحد تم إنشاؤها بواسطة برنامج مطياف الكتلة التي تحتوي على البيانات الطيفية لكل عينة، في برنامج قاعدة البيانات والجمع بين جميع العينات في قاعدة بيانات واحدة. إضافة أية بيانات تعريف ينطبق على جدول البيانات. استيراد البيانات المنسقة (جدول / ملف CSV) إلى مجموعة من البرامج الإحصائية ويعني تطبيع الأطياف لحساب التباين في الجماهير عينة pyrolyzed.
- استخدام حزمة البرامج الإحصائية لإجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA) باستخدام البيانات الطيفية لتحليل تجميع العينات القياسية تكرارها المستخدمة في القياسات، وكذلك لتقييم القمم التي هي جزء لا يتجزأ من تصنيف المواد الكيميائيةالمركبات في شحنات مؤامرة 28.
ملاحظة: مجموعة PCA العينات على أساس تشابه أطيافها، ويسمح الاختيار من المعايير لقياس الخطأ التجريبي بسبب الانجراف الصك خلال الفترة السابقة. - لحساب syringyl اللجنين (S) / guaiacyl (G) النسبة، خلاصة القول مجالات القمم S (م / ض = 154، 167، 168، 182، 194، 208، و 210) والقسمة مجموع القمم G في 124، 137، 138، 150، 164، و 178.
- لحساب مجموع محتوى اللجنين، خلاصة القول القمم اللجنين مع م / ض = 120، 124، 137، 138، 150، 152، 154، 164، 167، 178، 180، 182، 194، و 210.
- حساب معامل تصحيح لتوسيع نطاق قياس pyMBMS إلى الطريقة القياسية لتقدير مجموع اللجنين، مثل Klason اللجنين. تقسيم قيمة اللجنين Klason من مستوى فردي من قبل محتوى اللجنين مجموع قياس لتلك العينة القياسية باستخدام pyMBMS.
- تطبيق هذا معامل التصحيح لجميع الأنواع الشبيهة في مجموعة البيانات. كرر لكل نوع من أنواع الكتلة الحيوية تحليلها. Nالمؤسسة التجارية العمانية: إن معامل التصحيح يمكن أن تختلف استنادا إلى حد كبير على S / G من الكتلة الحيوية تحليلها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم قياس التأثير المشترك للالمعالجة الحرارية واللاحق انزيم التسكير بوصفها وظيفة من كتلة الجلوكوز والفركتوز صدر في نهاية الفحص. يتم الإبلاغ عن النتائج من حيث ملليغرام من الجلوكوز والفركتوز صدر في كل غرام من الكتلة الحيوية. هذا هو في تناقض صارخ مع البيانات الواردة من المقايسات مقاعد البدلاء النطاق، التي عادة ما تكون كما ذكرت العائد النظري في المئة على أساس التحليل التركيبي للمواد البداية. كما أنه ليس من العملي لتنفيذ التحليل التركيبي على آلاف العينات في الأسبوع حتى الآن، هو أفضل أبلغت بيانات عن مستويات التحويل على أساس الكتلة. وهذا يسمح للتقييم عينة معقول طالما يتم إجراء مقارنات بين عينات ترتبط ارتباطا وثيقا من الكتلة الحيوية وتكوين العينات لا تختلف كثيرا.
الهدف الأساسي من الاختبار هو لتقييم الاختلافات النسبية في مقاومة جدار الخلية النباتية إلى الجمع بين حراري / انزيماتالتسكير آتيك عبر مجموعة من المتغيرات الفردية. ومن الجدير بالذكر أن الفحص لا يحاول تحسين أي من الشروط المستخدمة لالتسكير. في الواقع، وظروف شدة المعالجة هي دون المستوى الأمثل بشكل ملحوظ من أجل توسيع نطاق حساسية الفحص، التي تستهدف تحقيق عائد التحويل النهائي من 50٪ إلى 70٪ من النظرية. أن الظروف المعالجة في أو بالقرب الأمثل دفع جميع العينات لتحويل عالية، وتضييق كثيرا من النطاق الديناميكي للفحص. وفي المقابل، تحميل الانزيم هو أكبر بكثير من تلك التي ذكرت عادة لالهضم مقاعد البدلاء النطاق. مرة أخرى، والهدف من هذه الطريقة ليس للعثور على أفضل الانزيم أو تقليل تكلفة الإنزيم، ولكن لقياس عناد لا يتجزأ من جدران الخلايا إلى تحويل واستخدام شحنات انزيم عالية جدا يزيل التباين من الفحص.
وأخيرا، من المهم أن نفهم أن التباين في الفحص العام هو أعلى بكثير من تلك التي ذكرت عن رفوفعمل ح النطاق. أخطاء معيار النموذجية هي حوالي 8٪، على الرغم من أن نطاق أوسع من ذلك بكثير. هذا هو ببساطة طبيعة على نطاق صغير، والبحوث بالمشاركه. pipetting لوالأخطاء وزنها هي أعلى نسبيا في نطاق ميكرولتر والمغنيسيوم، كما هي خسائر التبخر والتكاثف. يصبح الكتلة الحيوية التجانس متغير كبير جدا عندما يعاير عدة أوامر من حجم أقل الجسيمات في كل عينة، أي 5 ملغ مقابل ز متعددة. المقايسات اللونية المستخدمة لتحديد الجلوكوز والفركتوز ترتبط بشكل جيد مع النتائج HPLC. ومع ذلك، في حين المقايسات انزيم مرتبط لتحليل السكر سريعة ويمكن تنفيذها في موازاة ذلك، فهي ليست دقيقة مثل الأساليب التحليلية مثل HPLC، وإدخال طبقة أخرى من عدم الدقة (الشكل 1).
بسبب كل الاعتبارات المذكورة أعلاه، والنتائج يجب فقط أن يفسر وذكرت ضمن حدود معينة. ينبغي فحص البيانات في مجموعات بأكملها، وعينات لا الفردية. مطلوبة مكررات لشركة طيران الشرق الأوسطالنتائج ningful. الاتجاهات والقيم المتطرفة ذات معنى، ولكن النتائج ليست واحدة. من الأفضل إجراء مقارنات ضمن مجموعات تجريبية واحدة. مقارنات عبر حملات فصل زمانيا أو مكانيا تتطلب ضوابط مشددة للغاية وفحص دقيق لتكون ذات مغزى. البيانات بالمشاركه غير قابل للمقارنة مباشرة إلى bench- أو البيانات على نطاق وغيرهم. تتبع الاتجاهات بين بالمشاركه والمقاييس الأخرى، ولكن المقارنات عينة المباشرة لا تسفر عن نتائج مماثلة.
تمثيل البيانات وعادة ما تقع في مقارنات الاتجاهات والقيم المتطرفة، أو السكان الفرعي / البديل. مثال على الاتجاهات هو مسح للتمرد من 755 المتغيرات الطبيعية من الحور عينات على نطاق واسع في شمال غرب المحيط الهادئ من الولايات المتحدة 19. وقد تآمر تمرد ضد هذه العينات محتوى اللجنين وsyringyl / guaiacyl نسبتهم على النحو الذي يحدده pyMBMS. وتشير النتائج إلى أن ما يرتفع S / G، يقلل عناد حتى نسبة S / G حوالي 2، حيث الظهور عنادمستويات ovement قبالة (الشكل 2). القيم المتطرفة يمكن رؤيتها بوضوح في الشكل 3، حيث تم تنظيم أسفل الجين Pt4CL1 في الحور. كما تم عرض عدة مئات من أصناف وعدة منها زيادة بوضوح في عناد، كما يتضح من إطلاق السكر انخفضت الشكل 4 يصور الدراسة التي كانت تزرع عدة مختلفة أصناف القمح والقش على عدة مشاهد على مدى عامين والحصاد بعد عدة تغيرات في ظروف النمو ، مما أدى في 20 السكان متميزة على أساس مجموعات من المتغيرات المذكورة أعلاه. هذه مجموعات عينة تتميز بسهولة وتشير المتغيرات الإيجابية والسلبية للتمرد الشكل 5 يبين كيف يمكن استخدام pyMBMS لتقييم التغيرات في تكوين الجدار الخلوي. كتلة يتم تعيين شظايا الطيفية لمونومرات اللجنين مختلفة (الجدول 1). عند مقارنة عينة مع اللجنين عالية مقابل نسبة عالية من الكربوهيدرات، والتفاوت في البيانات الطيفية واضحة. تيانه استخدام البيانات pyMBMS إلى جانب تحليل المكون الرئيسي (PCA) هو موضح في الشكل (6). في هذا المثال، يتم تصنيف العينات وفقا لالتسميد النيتروجيني منخفضة أو عالية. اللجنين ومحتويات الكربوهيدرات محاذاة عكسيا على طول PC1. استخدام أحمال المكون الرئيسي مؤامرة يمكن أن تساعد في تحديد والتي يتم شرح الصفات الكيميائية في المؤامرة تصنيف العشرات، فضلا عن توضيح الصفات التي تتغير بين مجموعات عينة.
الشكل 1: مقارنة بين الجلوكوز والفركتوز الكميات باستخدام عالية الإنتاجية المقايسات اللونية مقابل HPLC 9. وقد أجريت مقارنة بين الجلوكوز والفركتوز الكشف خارج باستخدام إكسيلوسي نازعة (XDH، اللوحة العلوية) والجلوكوز أوكسيديز / البيروكسيد (GOPOD، اللوحة السفلى) عالية الإنتاجية اللونية المقايسات انزيم مرتبط وعالية الأداء ولاللوني iquid.
الشكل 2: عناد جدران الخلايا الحور بوصفها وظيفة من syringyl إلى guaiacyl (S / G) المحتوى في اللجنين 9 زيادة عناد جدران الخلايا الحور بوصفها وظيفة من syringyl إلى guaiacyl (S / G) المحتوى في جزء اللجنين لديها. لوحظ والإبلاغ عنها. أخذت عينات من 755 الحور الأساسية من نفس الصنف الحور على مدى عدة مئات من الأميال من الغابات في أمريكا الشمالية شمال غرب المحيط الهادئ وفحص للجلوكوز والفركتوز الإفراج بعد المعالجة الحرارية وانزيم التسكير. وقد تآمر النتائج مقابل نسبة S / G في اللجنين جدار الخلية على النحو الذي يحدده pyMBMS. يقلل عناد مع تزايد S / G حتى حوالي 2، حيث لا يزال ثابتا عند أعلى S / G. تستند القيم النظرية العائد على BESC "المعيار" الحور وعلى النحو المنصوص عليه في referenCE للمقارنة.
أدى الإستعصاء في التنظيم أسفل Pt4CL1 التعبير في الحور أسفل التنظيم من الجين Pt4CL1 في الحور في اختلاف بسيط في جدار الخلية عناد بين الحيوانات المستنسخة، ولكن يتم تحديدها عدة زادت زيادة كبيرة المتغيرات عناد بسهولة: الرقم 3. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.
الرقم 4: الإستعصاء في مختلف السكان wheatstraw آثار نوع الصنف ومكان زراعة، وتطبيق الأسمدة، وسقي نتيجة معدل في مستويات عناد تمييزها بوضوح. رموز مختلفة تمثل احالإقليم الشمالي ظروف النمو التجريبية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: تطبيق pyMBMS لتحليل التغيرات الكيميائية في جدران الخلايا النباتية 28 قمم الرمز مع السهام هي شظايا اللجنين، واستخدمت لتقييم (أ) اللجنين عالية (ب) اللجنين متوسطة أو (ج) محتوى اللجنين منخفضة.
الرقم 6: المكون الرئيسي عشرات تحليل قطعة من الاختلافات في الكيمياء جدار الخلية من حيث عدد السكان أشجار نمت مع ارتفاع وانخفاض معدلات التسميد 28 (أعلى) تحليل المكونات الأساسيةعشرات مؤامرة توضح تصنيف متميز، وبالتالي، فإن الاختلافات في الكيمياء جدار الخلية من حيث عدد السكان أشجار نمت مع ارتفاع وانخفاض معدلات الإخصاب. العنصر الرئيسي 1 تقسيم العينات على أساس أعلى اللجنين (سلبي) أو أعلى من الكربوهيدرات (إيجابية) المحتويات. (القاع) أحمال المكون الرئيسي توضيح التي تتغير المكونات الكيميائية بين المجموعتين من العينات في مؤامرة العشرات. أحمال إيجابية ترتبط مع عشرات الإيجابية، والتي هي ممثل محتويات الكربوهيدرات أعلى، في حين محاذاة التحميل تتناسب عكسيا مع عشرات السلبية، وبالتالي، وارتفاع محتوى اللجنين.
| م / ض | احالة الجزيئي 30 | S / G / H الاحالة |
| 94 | الفينول | S / G / H |
| 120 | Vinylphenol | H |
| 124 | غاياكول | G |
| 137 | Ethylguaiacol، homovanillin، coniferyl الكحول | G |
| 138 | Methylguaiacol | G |
| 150 | Vinylguaiacol | G |
| 154 | Syringol | S |
| 164 | Allyl- + غاياكول بروبينيل | G |
| 167 | Ethylsyringol، syringylacetone، propiosyringone | S |
| 168 | 4-ميثيل-2،6-dimethoxyphenol | S |
| 178 | Coniferyl ألدهيد | G |
| 180 | الكحول Coniferyl، syringylethene | S، G |
| 182 | Syringaldehyde | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
الجدول 1: ذروة م / ض والواجبات لشظايا الانحلال الحراري المستمدة من اللجنين كما الكشف عنها بواسطة الطيف الكتلي قائمة المركبات النموذجية الكشف عنها بواسطة pyMBMS. تعيينات الجزيئية على أساس إيفانز، RJ وTA ميلن (1987). التوصيف الجزيئي للالانحلال الحراري من الكتلة الحيوية للطاقة والوقود 1 (2): 123-137.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات تحضير العينة الرئيسية للحصول على بيانات دقيقة وقابلة للتكرار عند إجراء الإنتاجية العالية التجارب العرض كالتالي:
السكر الإصدار الفحص:
بشكل عام، يتم إعداد العينات في الكثير تتراوح بين بضع عشرات إلى عدة آلاف في وقت واحد. وعادة ما تتم كل خطوة كبرى بالنسبة لجميع العينات قبل المضي قدما من أجل تقليل الاختلافات في إعداد بين العينات. وكان دي اتنشى ليس في الأصل جزءا من البروتوكول ويمكن حذفها في بعض الحالات. عينات الخشب والمواد العشبية senesced منخفضة باستمرار في النشا، وبالتالي لا تتطلب إزالة التنشية للحد من التقلبات. النشا هو مصدر قلق كبير. ومع ذلك، في مجموعات عينة من النباتات الخضراء الأنسجة، وخاصة بالنسبة للعينة مجموعات كبيرة حيث يحدث الحصاد على مدى عدة ساعات. مع ارتفاع مستويات النشا أثناء ساعات النهار وتنضب خلال الظلام، يمكن لمستويات النشا تختلف بشكل كبير خلال الصورةح everal والجلوكوز من النشا لا يمكن تمييزه من الجلوكوز من السليلوز، وبالتالي، يمكن لمستويات النشا عالية تؤدي إلى قياسات عناد منخفضة distortedly. تحميل انزيم الفعلي في خطوة destarching يشكل مصدر قلق أقل، طالما هناك ما يكفي من النشاط الزائد لإزالة كافة النشا يمكن الوصول إليها في غضون الإطار الزمني للخطوة النشا التحلل. تغيرات في إنزيمات معينة المستخدمة والوقت ودرجة الحرارة، ومعدل حجم، والتحريض الخطوة النشا التنظيف يمكن أن يؤدي بالتأكيد إلى الاختلافات في مستويات إزالة النشا ومعدلات وينبغي أن تحدد تجريبيا كلما أمكن ذلك. وأخيرا، عندما التفاف أكياس لاستخلاص واستخدام المغلفة القصدير الأسلاك النحاسية. الأسلاك النحاسية العارية يمكن أن يسبب تفاعلات كيميائية غير المرغوب فيها مع الحل الانزيم، وإعطاء قيم السكر كاذبة. النحاس والقصدير المغلفة حل هذه المشكلة في حين كان أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ لا مرن بما فيه الكفاية للحفاظ على أكياس مغلقة بإحكام.
ثابت حجم الحد من الكتلة الحيوية أمر بالغ الأهمية لهددتبيانات معدل لسببين: 1) المطحون ناعما الكتلة الحيوية، في حين الاستغناء بسهولة وباستمرار، هو أيضا أسهل للهضم من المواد الخشنة. 2) الكتلة الحيوية التي هي أيضا الخشنة قد يعوق النطاط، مما أدى إلى المواد غير كافية، أو إذا كانت تسد يست سوى حظر جزئي للافتتاح، فإنه يمكن أن تكون بمثابة غربال والسماح فقط الجسيمات الدقيقة من خلال خفض التعنت الملحوظ من العينة. إذا كان واردا الكتلة الحيوية قليلة جدا في النطاط، فإنه قد معطف جانبي قادوس، مما تسبب في الروبوت لتولي قادوس فارغة وسيتم تخطي العينة في عملية صرف. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لمستويات منخفضة من الكتلة الحيوية تسهم في مبالغ فيه عينة التجانس، خصوصا أن جزيئات أكثر كثافة (مثل قشرة) تميل إلى غربال إلى أسفل مخروط والحصول على الاستغناء أولا. عندما يكون أقل من 50 ملغ من مادة متاح، لا يزال الفحص يتم القيام بها؛ ومع ذلك، يجب أن تكون العينات وزنه اليد. ومع ذلك، فإن نتائج ناحية وزنها أكثر تباينا من تلك التي تسلبوزنها أمام الأذن.
لم يتم تعريف جيدا المبلغ الفعلي من الكتلة الحيوية اللازمة لخطوات تحضيرية. اقترحنا 250 ملغ كنقطة انطلاق معقولة، إلا أن كل عينة الكتلة الحيوية يسلك خصائص مختلفة بشأن الخسائر الناجمة عن التعامل مع والطحن، واستخراج وكذلك محتجزين حتى في النطاط أو يتم الاستغناء بتكاثر. عدم تجانس الكتلة الحيوية عبر أنواع وحتى داخل نفس النوع يحول دون بروتوكول أكثر تحديدا. وأولئك الذين يرغبون في تنفيذ هذه الأساليب فحص ببساطة الحاجة لتحديد العديد من هذه المتغيرات لأنفسهم، على الرغم من تجربة لا تجعل من السهل.
خطوة أخرى التي يمكن أن يعرض الخطأ هو خلط في لوحات عيار مكروي، الذي أمر بالغ الصعوبة وغير حاسمة في هذه المقايسات لعدة أسباب. الحل الإنزيم المستخدم هو المركز، ويمكن طبقية عليه بالإضافة إلى الآبار، مما يحد من انزيم الوصول إلى الكتلة الحيوية. كعائدات التسكير، وسوغARS صدر يمكن أيضا تطبق والتركيز بالقرب من الكتلة الحيوية واعتمادا على عمق أخذ العينات، ويمكن فحوصات السكر تكون مرتفعة بشكل مصطنع أو منخفضة. هذا هو السبب في أنه حيوي لخلط العينات بعد إضافة انزيم انزيم والتسكير، مما يسمح للخلط دقيق من الانزيمات مع الكتلة الحيوية حتى تسكر وتوزيع موحد من السكريات الناتجة للسماح للتحليل السكر ثابت. في لوحات التي لا تحتوي على الكتلة الحيوية، مثل تخفيف أو فحص لوحات، والخلط من قبل pipetting المتكررة (سحن) وقد ثبت أن تكون أعلى بكثير من اهتزاز. ومع ذلك، كحلول في هذا البروتوكول كثافات متغيرة ومستويات الجسيمات، وسرعة pipetting لوالمكان طرف العمودي في العمود السائل أمر بالغ الأهمية. إذا كانت سرعة سريع جدا، وضعف دقة بسبب التجويف (الطموح) والاحتفاظ السائل في الطرف (الاستغناء) يمكن أن يحدث. إذا غيض عميق جدا في البئر، والكتلة الحيوية قد يعوق طرف أو يمكن الضغط على تلميح إلى أسفل، ومنع طموح دقيقة، وهناكهي أكثر منطقة السطح الخارجي للسائل أن التمسك والمرحل إلى الخطوة التالية. المسألة الأخيرة يمكن التخفيف إلى حد ما عن طريق التحكم عن طرف سرعة الانسحاب، كما تسمح أبطأ إزالة طرف السائل المراد إزالتها في حل الجزء الأكبر من التوتر السطحي. إذا غيض انسحاب بطيء جدا، السائل pipetted قد تسلل مرة أخرى إلى حل الجزء الأكبر أيضا. يكون جسيمات الكتلة الحيوية أيضا الميل إلى التمسك النصائح وأصبح ينقل لوحة التخفيف، حيث يمكن أن تسد غيض أثناء الخلط أو نقل لوحات الفحص، وخلق عدم الدقة في حجم العينة التي تم تحليلها. قد تتداخل هذه الجسيمات أيضا مع التحليل الطيفي لوحات فحص إذا كانت تسد شعاع ضوء خلال القراءة.
يتفق توقيت اللون التنمية هو أمر حاسم لGOPOD والمقايسات XDH. يجب السماح للتنمية لون للذهاب إلى الانتهاء. ومع ذلك، فإن اللون GOPOD فحص يميل إلى مواصلة الارتفاع بعد الانتهاء وNADH الناتجة عن الفحص XDH ببطءالنقصان بسبب الأكسدة عفوية من NADH. ونتيجة لذلك، توقيت التغير يمكن أن يؤدي إلى مقارنات تتعارض البيانات بين لوحات منفصلة. وينبغي رصد الخطوات فحص بعناية، حيث توقف بسبب الأجهزة أو البرامج قضايا يمكن أن تؤدي إلى اختلافات كبيرة في أوقات الفحص. استخدام المعايير السكر وآبار المراقبة الكتلة الحيوية القياسية في كل لوحة يمكن أن تساعد في تخفيف هذا إلى حد ما.
PyMBMS:
معايير يجب النظر بعناية لpyMBMS تجارب لمقارنة الطرق الكيميائية الرطبة القياسية. نظرا لاختلاف تكوين اللجنين (S / G النسب) من الأنواع الكتلة الحيوية، لا بد من تحديد معامل التصحيح باستخدام معيار التمثيل هو نفس الأنواع كما العينة التجريبية. إذا كان هناك أي معيار مناسب المتاحة، ويمكن مقارنة الاختلافات في تركيز اللجنين باستخدام شدة السلائف اللجنين مباشرة. ارتفاع S / نسب G (أكثر من ~ 3.5) يمكن أن يؤدي إلى المبالغة في تقدير لمحتوى ignin التي كتبها pyMBMS. يحدث هذا بسبب ميل S اللجنين التي ستصدر بشكل تفضيلي في ظل الظروف القياسية المستخدمة في هذا الأسلوب. وبالإضافة إلى ذلك، فإن كمية العينة المطلوبة لقياس pyMBMS يعتمد على نوع الكتلة الحيوية المستخدمة. اللجنين ونموذج اللجنين المركبات المعزولة تتطلب مواد أقل (0.1 ملغ)، مثل استخدام قسامات أكبر من عينة يمكن أن تشبع كاشف.
آخر خطوة حاسمة في عملية PyMBMS هي ضبط دقيق للأداة لمعيار معروف مثل perfluorotributylamine (PFTBA) قبل كل تجربة. PFTBA يحتوي على قمم الجزيئية عبر كامل الكتلة الحيوية التقليدية، وبالتالي يسمح ضبط أداة موحدة بين أشواط التجريبية. يتم ضبطها في المنطقة الوسطى من أطياف PFTBA بحيث م / ض 131 و م / ض 219 ما يقرب من 50٪ من كثافة م / ض 69. يستخدم هذا ضبط التأكيد على قمم نموذجية ينظر تحت التأين الناعمة (17 فولت) المستخدمة للحد من تشتت الأيونات إلى الجماهير أقل أن ج يتم تحديد ANNOT بسهولة.
وتجدر الإشارة إلى أن هذه الأساليب ليست أساليب تحليلية لتقدير الدقيق لتحليلها من الفائدة. بدلا من ذلك، هذه التقنيات الإنتاجية العالية هي لفحص الكتلة الحيوية الكبيرة مجموعات لتحديد تلك التي تمتلك الصفات الكيميائية المطلوبة. يجب أن تستخدم إلا هذه الأساليب للفحص، والترتيب، وارتباط العينات ضمن مجموعة البيانات. مجموعات البيانات لا يمكن مقارنتها مباشرة عندما جمعت في أيام مختلفة بسبب مصادر التباين مثل الانجراف فعال، والتغيرات في نشاط انزيم، المحيطة محتوى الرطوبة في الكتلة الحيوية نتيجة للتغيرات في الرطوبة، والتقلبات في درجة الحرارة، والاختلاف في نصائح والكثير لوحة الامتصاصية . بالإضافة إلى ذلك، المعالجة المستخدمة في بروتوكول إعداد العينات ليست استراتيجية المعالجة الأمثل، ولكن تم بدلا مصممة خصيصا لتكون دون المستوى الأمثل. وهذا يتيح الفروق الدقيقة بين النباتات إلى توضيح أكثر كفاءة.
jove_content "> إن الفائدة الرئيسية من اعتماد أساليب إنتاجية عالية هي أن العديد من عينات يمكن قياسها في نفس الفترة الزمنية 18. على سبيل المثال، طريقة شائعة لتحليل الكربوهيدرات المنتجة خلال التسكير الحمضية أو الأنزيمية هو استخدام عالية الأداء اللوني السائل (HPLC). سيليج وآخرون، تنص على أن كل مكان من خطوتين حمض المائي، على الرغم من المفيد جدا وبالغ الأهمية لتحديد مقدار الكربوهيدرات الهيكلية، ويحد من الباحثين إلى أن تكون قادرة على تقييم ما يقرب من 25 عينة في الأسبوع 9. في حين أن تحليلية الأجهزة المستخدمة في منهجيات عالية الإنتاجية قد لا توفر حساسية تقنية القياسية مثل HPLC، وتحليل سريع يتيح الباحثين متسع من أن تكون قادرة على تقييم كميات كبيرة من العينات. وبالإضافة إلى ذلك، الأساليب الإنتاجية العالية غالبا ما يضيق نطاق البروتوكولات التجريبية، الحد من استخدام المواد الاستهلاكية، وبالتالي خفض تكاليف التجريبية والنفايات.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
- Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , Earthscan. 53-80 (2009).
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
- Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).
