Introduction
כאספקה הגלובלית של דלקים שאינם מתחדשים וירידות המוצרים הקשורים בם, מדענים כבר קראו תיגר ליצור דלקים וכימיקלים דומים ממקורות 1 מופק מצמח. היבט מרכזי של עבודה זו הוא קביעה שמינים של צמחים עשויים להיות מתאימים לייצור של דלק ביולוגי וביו-חומרים 2,3. בדרך כלל, בחומרי גלם אלה מוערכים ליגנין, תאית, ותוכן hemicellulose; כמו גם הרגישות שלהם לפירוק (סרבנות) באמצעות טיפול מקדים תרמי, מכאני, ו / או כימי עם או בלי saccharification אנזים שלאחר מכן. ניתוח מפורט יותר נמצא בשימוש כדי לקבוע את ההרכב הספציפי של השברים ליגנין והמיצלולוז, כמו גם פעילויות אנזים אופטימליות הדרושות. שינויים מהונדסים של צמחים שאינם מהותית יש תכונות אידיאלי להמרה ביוכימי או תרמה-לסחורות הרצויות סיפקו חוקרים עם מקור התרחב מאוד של סירחומר הזינה ential 4. שיטות האנליטיות סטנדרטי לכימות התכונות הכימיות של צמח, ואילו שימושי למדי עבור קבוצות מדגם קטנות, אינן מתאימות לסינון המהיר של מאות או אלפי דגימות 5-7. שיטות HTP המתוארות במסמך זה כבר התפתח במהירות וביעילות כדי להעריך מספרים גדולים של גרסאות יומסה לשינויים בתא קיר סרבנות השפלה תרמה-ו / או אנזימטי.
זה קריטי כדי להבין שמבחני מיון HTP מתוארים במסמך זה לא תוכנן על מנת למקסם את ההמרה או תשואה. המטרה היא לקבוע הבדלים יחסי בסרבנות הפנימית של דגימות ביומסה בנושא. כתוצאה מכך, רבים מהצעדים הניתוח שונים מהמבחנים "הטיפוסיים" הגיור ביומסה, שבו המטרה היא להשיג יחס המרה מרבי או מידה. לדוגמא, נמוכות חומרות טיפול מקדים ופעמים הידרוליזה אנזים קצרות משמשות למקסם שונהences בין דגימות. ברוב המקרים, עומסי אנזים גבוהים יחסית משמשים להפחתת הבדלים עקב וריאציה ניסיונית בפעילות אנזים, אשר יכולה להטות את התוצאות באופן משמעותי.
טכניקות מהירות לקביעת ההרכב של צמח תא-קירות וסוכרי monomeric המשוחררים הבאות saccharification האנזימטית כוללות רובוטיקה, צלחות מותאמות אישית, thermochemically תואמות 96-היטב, ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטית 8-11 ופרוטוקולי אינסטרומנטלי, כגון ספקטרוסקופיה רטט (אינפרא אדום (IR), קרוב אינפרא אדום (ניר), או ראמאן) ותהודה מגנטית גרעינית (NMR) 12-17. מתודולוגיות אלה הן מפתח לבידוד חומרי גלם גבוה של תאית או תוכן ליגנין נמוך, או לאלה צפויים להניב גלוקוז, קסילוז, אתנול הגבוה ביותר, וכו 'שיטות אלה אפשרו ניתוחי downscaled שמעסיקים כמויות קטנות יותר של ביומסה ומתכלים, שהובילו לירידה בניסוי חשבון 18 9, 8,10 צפצפה, פסולת קני סוכר 8, וקליפות 8 נבדקו בהצלחה תוך שימוש בשיטות אלה HTP.
ליגנין סה"כ והרכב monomeric ליגנין גם לכמת נפוץ תכונות יומסה. ירידות בתוכן ליגנין הוכחו להגדיל את העיכול אנזימטי של סוכרים 19,20. התפקיד שיחס monomeric ליגנין (לעתים קרובות כפי שדווח syringyl / guaiacyl (S / G) תוכן) משחק בפירוק של דופן תא הצמח הוא עדיין בחקירה. דיווחים חלקם הצביעו על כך שההפחתה בS / Gיחס הוביל לתשואות גלוקוז מוגברות הבאים הידרוליזה 21, ואילו מחקרים אחרים לחשוף את המגמה ההפוכה 19,22. שיטות תפוקה גבוהות להערכה ליגנין ומונומרים שלה כוללות ספקטרוסקופיה רטט (IR, NIR, וראמאן 23-26) בשילוב עם ניתוח רב משתני, וספקטרומטריית פירוליזה קרן מולקולרית מסה (pyMBMS) 27,28.
בעת פיתוח שיטות HTP להקרנה ביומסה, כמה שיקולים נפרד צריכים להיות כל הזמן בראש. אחד היבטים מרכזיים הוא את המורכבות של השיטה. מהי רמת המיומנות הנדרשת לטכניקה? ניתוחי chemometric, למשל, דורשים מיומנויות ספציפיות לבנייה, להערכה ולשמירה על מודלים חזוי. השיטות סטנדרטי להציג צעדי ניתוח הכנה או נתונים לא רצויים או להעסיק ריאגנטים רעילים. פיתוח המודלים הוא תהליך מתמשך שבו נתונים חדשים שולבו המודל לאורך זמן כדי להגדיל את חוסנו של המודל. מצידך עודeration הוא החיסכון בעלויות והירידה פעמים ניתוח ניסיוניות של שיטות תפוקה גבוהה המוצעות. אם השיטה היא די מהירה, אבל יקרה מאוד, זה לא יכול להיות טכניקה אפשרית למעבדות רבות לאמץ. השיטות מתוארות בכתב היד הזה הן גרסאות של טכניקות סטנדרטיות, שונה כדי להגביר את יכולות התפוקה. פרוטוקולים אלה כמותית למדוד את תכונות יומסה של עניין ללא צורך בפיתוח מודלים חזוי. זוהי תכונת מפתח של שיטות אלו, שכן שיטות חיזוי, ואילו בתערוכת מתאמים חזקים עם סטנדרטי ניתוחים המשמשים לפיתוח המודלים, אינם מדויקים כמו בעצם מדידת הכמות של ריבית לדגימות. ואילו שיטות המשמשות בעצם scaled למטה גרסאות של שיטות אנליטיות ספסל בקנה מידה סטנדרטית, דיוק ודיוק נסחרים במהירות ותפוקה. בעיקר, תוצאה זו היא בשל טעויות גבוהות יותר בפיפטה נפח הקטנה ובמשקל; כמו גם הגדיל את יםההטרוגניות בשפע כגודל מדגם היא ירד. בעוד יכולים להיות מוקרנים סטי מדגם גדולים והשוואה, בזהירות רבה צריכה להיות מופעלת בעת ביצוע השוואות בין מסעות פרסום נפרדים ולתוצאות ספסל בקנה מידה.
צעדי הזמן רב ביותר כרוכים המניפולציה הפיסית של ביומסה. דגימות שחיקה עשויות להימשך מספר דקות לדגימה, כולל ניקוי הטחנה בין דגימות. באופן ידני בטעינה, פריקה, ומין ניקוי ומילוי וריקון שקיות תה ושקיות דגימה היא גם מאוד עבודה אינטנסיבית. בעוד כל צעד יכול לקחת דקות או יותר, אלפים עושים דגימות עשויים לקחת שעות רבות ואפילו ימים. הרובוטים יכולים לטעון צלחת כור טיפוסית עם ביומסה בכ 3 עד 4 שעות או 6 עד 8 יום צלחות -1 רובוט -1. מצב זה תלוי בפרמטרים המדויקים המשמשים גם כסוג והכמות של ביומסה להיבדק. מילוי צלחות כור במים, לדלל חומצה, או אנזים נעשה במהירות באמצעות רובוט טיפול נוזלי. Pטיפול חוזר של מחסנית צלחת (1 עד 20 צלחות כור) לוקח בין 1 ל 3 שעות כאשר הרכבה, להתקרר, והפירוק כלול. הידרוליזה אנזים לוקחת 3 ימים וניתוח הסוכר דורש כ 1 שעה של זמן הכנה בתוספת 10 דקות לכל צלחת כור כדי להשלים את assay ולקרוא את התוצאות. לוח זמנים שבועיים של ימים לפני הטיפול וניתוח נקבעו להכיל את לוח הזמנים של עבודה סבירה, מזעור מאמצים מוזר שעות ביממה וסוף השבוע למרכיב האנושי של assay ומאפשר עיבוד ~ 800 ל -1,000 דגימות בשבוע באופן שוטף. התפוקה המקסימלית תלויה במספר גורמים, בעיקר כמה חומרה (רובוטים, צלחות כורים, וכו ') וכמה "תוכנה" (כלומר, כוח אדם) זמינים לעשות את העבודה הידנית. הגבול העליון המעשי הוא 2,500 עד 3,000 דגימות / שבוע; עם זאת, פלט שדורש פעולה 7 ימים בשבוע ומתמחים סטודנט מרובה וטכנאים. לשם השוואה, 3,000 דגימות על ידי HPLC ידרשו כ 125 ימים של סםניתוח ple תוספת עבודה נוספת של משקל ידני דגימות לכורים ודגימות סינון לפני הניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
קביעת 1. תפוקה גבוהה של גלוקוז ותשואות קסילוז בעקבות אנזימתי Saccharification 9,29
- לדוגמא הכנה (שחיקה, דה-עמילן, הפקה, לפני טיפול)
- לטחון לפחות 300 מ"ג של כל דגימה ביומסה באמצעות טחנת Wiley, מסך שהחלקיקים עוברים דרך 20 רשת כגון (850 מיקרומטר). העברה לשקיות רוכסן אנטי סטטי (בדרך כלל בר-קוד) ומידע מדגם שיא למסד הנתונים ברקוד.
- להוסיף כ 250 מ"ג או יותר של ביומסה הקרקע משקית אנטי סטטית לממוספר (עם עיפרון, לא משתמש בדיו או סמן) תה שקית, בזהירות להפשיל שקיות התה, להיות בטוח לקפל את הקצוות על ביומסה כדי למנוע הפסד בדה-עמילן וחילוץ.
- לעטוף את שקית התה נסגר באמצעות חוטי נחושת מצופה פח. רשום את מספר שקית תה לכל דגימת המינימרקטים.
- הכן פתרון אנזים העמילן-דה מאנזימים מסחריים (בדרך כלל, 0.25% (V / V) glucoamylase (~ 1,600 AGU / L) ו1.5% (V / V) אלפא-עמילאז (~ 2,900 KNU-S / L) 0.1 נתרן אצטט M (pH 5.0)). הכן 16 מיליליטר לגרם של ביומסה בתפזורת או 500 מיליליטר לשקית תה 120 דגימות. הערה: עומסים מסוגלים להסיר עמילן מביומסה הקרקע צריכים להיקבע באופן אמפירי על ידי בדיקת עמילן לאחר עיכול עם מגוון רחב של עומסי אנזים ויחסים.
- במכל פלסטיק, להוסיף 16 מיליליטר של תמיסת אנזים העמילן-דה לז 1 של ביומסה קרקע בתפזורת. לפרוטוקול דה-עמילן אצווה, להוסיף 120 שקיקי תה 500 מיליליטר של תמיסת חיץ-האנזים.
- דגירה שבייקר ב 55 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות (± 4), 120 סל"ד להסיר עמילן אפשרי.
- לאחר הדגירה העמילן-דה, לשטוף ולהשרות ביומסה בכמה ליטרים של מים ללא יונים למשך 30 דקות. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות כדי להסיר מלחי חיץ שיכול לגרום להקפצה (היווצרותן של בועות גז בפתרון שיכולים לגרום לעלייה פתאומית ואלימה ברמה של הפתרון, וגרם אתנול נוזל חם למפלמתוך תגובת כלי) במהלך החילוץ.
- בעקבות השטיפה הממצה של ביומסה-מעומלנים דה, הנח את שקיות התה לתוך טור Soxhlet להפקה. אין אצבעון נדרש לצעד זה.
- הגדרת ריפלוקס Soxhlet, באמצעות 95% אתנול ולחלץ את הדגימות למשך 24 שעות.
- הסר את שקיות התה מהכור Soxhlet ופרוש בשכבה אחת על מגש שטוח.
- אפשר הדגימות לייבוש למשך הלילה בטמפרטורת החדר במנדף.
- לפרוש שקיות התה ולהחזיר את ביומסה היבש לשקיות אנטי סטטי המינימרקטים מקוריים.
הערה: השקיות אנטי סטטי הן יעילים בהפחתת חשמל סטטי ביומסה, שיפור מאפייני הטיפול. אם אפשרויות אחסון אחרות משמשות, ביומסה נוספת עשויה להידרש בהתאם להיצמדות יומסה לצד השני של מיכל האחסון. - העבר לפחות 50 מ"ג של ביומסה היבש להופר המינימרקטים (באמצעות יותר חומר הוא טוב יותר מחלק מדויק). Sיכולים ברקודים של שקיות אנטי סטטי והופר מקבל על מנת להבטיח מעקב אחר מדגם מדויק.
- מין עומס על מוצקים במשקל רובוט, הקדשת תשומת לב לצו של הדגימות במדפים. לטעון מספיק צלחות כור להכיל את כל הדגימות ובחרו את הפרוטוקול מחלק המבוסס על מספר הצלחות בשימוש.
- רובוט שוקל 5 מ"ג של הדגימות מיובשות (± 0.3 מ"ג) ל96-גם צלחות נירוסטה עמידה חומצה. לשקול את 3 משכפל של כל דגימה חולקה סביב הצלחת כדי למזער כל וריאציות מקומיות.
- כולל 8 דגימות ביומסה השליטה של חומר רגיל ביומסה מאופיינת היטב כדי לעקוב אחר ביצועי assay. לצלחות מרובות, השימוש במין ביומסה סטנדרטי מרובה יהיה למזער להיסחף גודל חלקיקים נגרמו על ידי הסינון במינן על חזרו מחזורים מחלק.
הערה: בכל צלחת, לא אמורה להיות 24 דגימות עם 3 חזרות, 4 כדורי סרק בהיקף של מים והאנזים דה-יוניזציה, ו8 controLS, באמצעות ביומסה סטנדרטית מתאפיינת בעבר. 3 בארות הפינה של כל אחד מ4 פינות של הצלחת שמורות לסטנדרטים הסוכר. - בדוק בארות סטנדרטיים ריקות וסוכר לחלקיקי ביומסה תועים ולהסיר אם קיימים.
- הוסף 250 μl של מים ללא יונים היטב כל אחד, ולאטום את הצלחות עם polytetrafluoroethylene מגובה דבק סיליקון קלטת (PTFE).
- באמצעות קצה 1/8 "מלחם, לנקב את קלטת PTFE בכל יציאת אדים (117 סך הכל) לכל צלחת. השתמש בצלחת ריקה שנערמו על צלחת כור אטומה כמדריך ולהגביל PTFE תנועת סרט.
- הצמד את הצלחות באופן הדוק עם 0.031 אטמי "עבים מחוזק זכוכית PTFE (טרום-אגרוף עם חורים ליציאות קיטור) בין צלחות וצלחות ריקות בחלק העליון ותחתון של ערימה. Pretreat הדגימות באמצעות כור קיטור מוגדר 180 מעלות צלזיוס במשך 17.5 דקות, או שילובי טמפרטורה / זמן אחרים המבוססים על חומרה רצויה.
- צלחות כור מגניבים עד 50 °; C על ידי הצפה במים ללא יונים.
- אנזימתי Saccharification
- הכן פתרון saccharification האנזימטית בהיקף של 8% (V / V) פתרון אנזים ב1.0 M נתרן ציטרט, pH 5.0. הכן 5 מ"ל לכל צלחת כור. הערה: דילול הנדרש צריכים להיקבע על בסיס תוכן פעילות וחלבון של פתרון אנזים מניות הספציפי.
- כאשר הצלחות הם מגניבים, צנטריפוגות בהרוטור דלי מתנדנד ב1,500 XG במשך 20 דקות. הסר איטום סרט. הערה: צלחות אלו הן כבדות ומפרטי צנטריפוגות צריכים להיבדק לתאימות.
- הוסף 40 μl של פתרון מניות אנזים 8% לכל אחד גם (אנזים 70 מ"ג לביומסה ז).
- לאטום עם קלטת PTFE חדשה. מניחים צלחת אטומה למהדק צלחת מגנטי.
- לערבב בעדינות את הדגימות על ידי היפוך (לפחות 15 פעמים), ולדגור על 50 מעלות צלזיוס במשך 70 שעות.
- כאשר saccharification הגיע למסקנה, לערבב על ידי היפוך צנטריפוגות הצלחות ב1,500 xגרם במשך 20 דקות.
- Assay סוכר
- להכין סט של גלוקוז 6 וסטנדרטים כיול קסילוז משולב ב0.014 חיץ M ציטרט (pH 5.0) החל 0-0.750 מ"ג / מיליליטר (0, 0.2, 0.3, 0.45, 0.65, 0.75 ומ"ג / מיליליטר מומלץ) ו0-0.600 מ"ג / מיליליטר (0, 0.1, 0.2, 0.35, 0.45, ו -0.6 מ"ג / מיליליטר מומלץ) לגלוקוז וקסילוז, בהתאמה.
- הכן את גלוקוז אוקסידאז / peroxidase (GOPOD) וריאגנטים דהידרוגנז קסילוז (XDH) על פי הוראות שבערכה.
- בעזרת פיפטה, להסיר 200 μl של נוזל מהבארות 4 הפינה ובארות קצה סמוכות לבארות הפינה (12 בארות כוללת) של צלחת הכור.
- בעזרת פיפטה, לוותר 180 μl deionized מים היטב בכל צלחת דילול שטוח תחתונה קלקר 96-היטב. אל תוסיפו מים לבארות סטנדרטי פינה וסוכר 12 (להסיר טיפים אלה אם באמצעות ראש 96 ערוצים).
- בעזרת פיפטה, לוותר מגיב GOPOD 180 μl היטב בכל assay גלוקוז plאכלתי.
- בעזרת פיפטה, לוותר מגיב XDH 180 μl היטב בכל צלחת assay קסילוז.
- בעזרת פיפטה, להעביר 20 μl aliquots hydrolyzate מצלחת הכור 96-גם לצלחת הדילול. Pipet מהחלק העליון של הבארות כדי למנוע מוצק ביומסה ונוזל שיורית בבארות פינה. מערבבים על ידי טחינה דקה לפחות 10 מחזורים.
- בעזרת פיפטה, להעביר 110 μl תקני סוכר, בשני עותקים, לבארות הפינה של צלחת הדילול.
- בעזרת פיפטה, להעביר 20 aliquots μl מצלחת הדילול לצלחות assay גלוקוז וקסילוז. מערבבים על ידי טחינה דקה.
- דגירה צלחות גלוקוז וassay קסילוז בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. לשבור את כל בועות לפני שטח בזהירות לפני הקריאה. אקדח חום עבר בקצרה על פני השטח של הצלחת עובד היטב.
- באמצעות קורא צלחת 96-גם אולטרה סגול / גלוי, להגדיר את אורך הגל שנמדד 510 ננומטר ולהקליט את הספיגה נגד ריק מגיב.מדידה זו מנטרת את היווצרות quinonimine, שהוא פרופורציונאלי לריכוז סוכר. ריכוז הסוכר מחושב מעקום הכיול המבוסס על תקני הכיול שהוכנו ב1.3.1.
- באמצעות קורא צלחת 96-גם אולטרה סגול / גלוי, להגדיר את אורך הגל שנמדד עד 340 ננומטר ולהקליט את הספיגה. מדידה זו מנטרת את ההפחתה של NAD + לNADH, שהוא פרופורציונאלי לריכוז קסילוז. ריכוז קסילוז מחושב מעקום הכיול המבוסס על תקני הכיול שהוכנו ב1.3.1.
קביעת 2. תפוקה גבוהה של סה"כ ליגנין ותוכן monomeric ליגנין שימוש pyMBMS 28
- לדוגמא הכנה
- לטחון ולחלץ את ביומסה באמצעות השיטות שתוארו בצעדים 1.1.1, ו1.1.6-1.1.8. זה כולל טחינה והחילוץ של מערכת של סטנדרטים לשימוש שולט ניסיונית כ.
הערה: measur pyMBMSements אינם חלקיקים בגודל תלוי, כך שאם באמצעות פרוטוקול pyMBMS רק, הכנת ביומסה צריכה להתבצע כדי לאפשר המדגם להשתלב בעל המדגם, <4 מ"מ. - השימוש לוותר מרית קטנה כ 4 מ"ג (3 עד 5 מ"ג העדיף) של ביומסה מוכנה לכוס נירוסטה 80 μl המיועדת ל- סמפלר האוטומטי.
- ודא כי לפחות 10% מהדגימות להיות מנותחות תקני בקרה כגון אלה זמינים מהמכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (פסולת-8491 קנה סוכר; צפצפה-8492; אורן-8,493; או חיטת קש-8494). הסטנדרטי יכולים להיות גם כל מינים מקבילים לדגימות להיות מנותחים שכבר מאופיינים בשיטות סטנדרטית.
- באופן אקראי לטעון דגימות לתוך הכוסות האוטומטית סמפלר באמצעות פינצטה כדי למנוע הטיה בשל סחף ספקטרומטר אפשרי לאורך זמן. הערה: אקראי טיפוסית של הדגימות יכלול המדידה של כל הדגימות פעם אחת, ואחריו מחדש אקראימסדר גודל של הדגימות למדידה כפולה. תוכניות אקראיות זמין באופן מקוון.
- באמצעות חור-אגרוף סטנדרטי, לייצר באופן ידני דיסקי מסנן זכוכית מגיליונות סיבי זכוכית / D סוג, ללא קלסר. החזק את מסנן סיבי זכוכית העגול עם פינצטה, מרכז זה על כוס המדגם, ולדחוף לתוך המדגם באמצעות מפתח ברגים אלן 3.5 מ"מ להגביל את החומר בכל כוס במהלך הניסוי.
- לטחון ולחלץ את ביומסה באמצעות השיטות שתוארו בצעדים 1.1.1, ו1.1.6-1.1.8. זה כולל טחינה והחילוץ של מערכת של סטנדרטים לשימוש שולט ניסיונית כ.
- פרוטוקול אינסטרומנטלי
- כייל את ספקטרומטר המסה באמצעות סטנדרטי שיש עוצמות שיא על מגוון השלם של תרכובות שיכולים להתקיים לדגימות ניסוי ידוע. עבור דגימות ביומסה טיפוסיות, להשתמש perfluorotributylamine (PFTBA).
- הגדר את זרימת גז שיעור ספק הליום 0.9 ליטר / דקה באמצעות זרימת גז מטר.
- הגדר את התנור האוטומטי סמפלר לטמפרטורת פירוליזה של 500 מעלות צלזיוס וטמפרטורת ממשק 350 מעלות צלזיוס באמצעות התוכנה האוטומטית סמפלר. הערה: "נירוסטה 1/8 מחוממתקו ההעברה העטוף בקלטת חום שמחברת את-סמפלר האוטומטי לספקטרומטר המסה נשלט באמצעות בקר חום ב 250 מעלות צלזיוס.
- בגין רכישת נתונים על ספקטרומטר המסה ולחכות לפחות 60 שניות כדי לקבל נתונים מספיקים לאוסף ספקטרום רקע.
- התחל בשיטה האוטומטית סמפלר האוטומטי עם המפרטים מ2.2.2. הערה: סמפלר-אוטומטי טיפות כל דגימה בנפרד לתוך הכבשן האוטומטי סמפלר. סך הכל זמן רכישת נתונים הוא כ 1.5 דקות; עם זאת, פירוליזה של מדגם מ"ג טיפוסי 4 תושלם לאחר 30 שניות.
- תוכן רשומה כולל יון (TIC) של כל דגימה באמצעות תוכנת ספקטרומטר מסה בקצב סריקה של 0.5 שניות. שיא עוצמות בין מ '/ z 30-450.
הערה: תרכובות ביומסה אופייניות להשתמש יינון רך בגיל 17 eV. המכשיר יכול להקליט מרווחים גדולים יותר ממ '/ z 1 1,000; עם זאת, קצב סריקה יהיה מוגבל על ידי כוח מעבד מחשב. - הסר רקע מהספקטרום באמצעות manual לשפר תכונה בתוכנה. הערה: חלק 60 סריקה של קו הבסיס בתחילת איסוף הנתונים משמשת לחישוב ערך ממוצע רקע. ספקטרום רקע ממוצע זה הוא להסיר את ספקטרום המדגם הניסיוני באופן אוטומטי בתוכנת ספקטרומטר המסה.
- לייבא את קובץ טקסט בעמודה אחת שנוצר על ידי תוכנת ספקטרומטר מסה המכילה את נתוני רפאים עבור כל דגימה, לתכנית מסד נתונים ולשלב את כל הדגימות לתוך מסד נתונים אחד. להוסיף metadata החלים על הגיליון האלקטרוני. לייבא את הנתונים בפורמט (גיליון אלקטרוני / קובץ CSV) לחבילת תוכנה סטטיסטית ואומרים לנרמל את הספקטרום לחשבון לוריאציה בהמונים מדגם pyrolyzed.
- השתמש בחבילת תוכנה סטטיסטית כדי לבצע ניתוח מרכיב עיקרי (PCA) תוך שימוש בנתונים ספקטרליים לנתח קיבוץ של הדגימות סטנדרטי המשוכפלות בשימוש במדידות, כמו גם להעריך שפסגות הם חלק בלתי נפרד מהסיווג כימיתרכובות בעומסי עלילה 28.
הערה: קבוצות PCA הדגימות המבוססות על הדמיון של הספקטרום שלהם, ומאפשר בדיקה של הסטנדרטים כדי לאמוד את השגיאה ניסיונית בשל סחף מכשיר בזמן הריצה. - כדי לחשב את syringyl ליגנין (S) / guaiacyl יחס (G), לסכם האזורים של פסגות S (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, ו -210) ולחלק בסכום של פסגות G ב124, 137, 138, 150, 164, 178 ו.
- כדי לחשב כולל תוכן ליגנין, לסכם פסגות ליגנין עם m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, 210 ו.
- לחשב גורם תיקון לקנה המידה של מדידת pyMBMS לשיטה סטנדרטית להערכה הכולל ליגנין, כגון ליגנין Klason. מחלקים את ערך ליגנין Klason של התקן הבודד על ידי תוכן ליגנין הכולל שנמדד שלמדגם סטנדרטי באמצעות pyMBMS.
- החל גורם תיקון זה לכל המינים דמויי בערכת הנתונים. חזור על פעולה עבור כל סוג של ביומסה ניתח. NOTE: גורם התיקון יכול להשתנות בהתאם לאופן משמעותי על S / G של ביומסה ניתחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההשפעה המשולבת של הטיפול המקדים תרם-וsaccharification אנזים שלאחר מכן נמדדת כפונקציה של המסה של גלוקוז וקסילוז שוחררה בסוף assay. התוצאות מדווחות במונחים של מיליגרם של גלוקוז וקסילוז שוחרר לגרם של ביומסה. זאת בניגוד מוחלט לנתונים שדווחו ממבחני ספסל בקנה מידה, אשר בדרך כלל הוא כפי שדווחו תשואה תיאורטית אחוזים המבוססים על ניתוח הלחנה של החומר מוצא. כפי שהוא עדיין לא מעשי לבצע ניתוח הלחנה באלפי דגימות בשבוע, הנתונים שדווחו כטוב ביותר רמות המרה על בסיס המוני. זה מאפשר להערכת מדגם סבירה כל עוד נעשות ההשוואות בין דגימות קשורות קשר הדוק של ביומסה וההרכב של הדגימות אינו משתנות יותר מדי.
המטרה העיקרית של assay היא להעריך את ההבדלים יחסי בהתנגדות של דופן תא צמח לשילוב תרם-/ enzymsaccharification atic על פני מגוון של גרסאות בודדות. ראוי לציין כי assay אינו מנסה לייעל את כל התנאים המשמשים לsaccharification. למעשה, תנאים מקדים הם הכי מוצלח חומרה באופן משמעותי על מנת להרחיב את מגוון הרגישות של assay, מיקוד תשואת המרה סופית של 50% עד 70% מתיאורטי. תנאים מקדים או בסמוך אופטימלי יהיו לדחוף את כל הדגימות להמרה גבוהה, מאוד לצמצם את הטווח הדינמי של assay. לעומת זאת, טוען האנזים הוא הרבה יותר גדול מזה בדרך כלל דיווח על digestions ספסל בקנה המידה. שוב, המטרה של השיטה היא לא למצוא את האנזים הטוב ביותר או למזער את עלות האנזים, אך כדי למדוד את הסרבנות הפנימית של קירות התא להמרה ובאמצעות מקדמי אנזים גבוהים מאוד מסיר שונות מassay.
לבסוף, חשוב להבין שהשונות בassay הכולל היא גבוהות באופן משמעותי ממה שדווח לBenCעבודת שעות בקנה מידה. סטיות התקן אופייניים הם סביב 8%, אם כי הטווח הוא רחב הרבה יותר. זה פשוט הטבע של בקנה מידה קטן, מחקר HTP. Pipetting ושגיאות במשקל הם באופן יחסי גבוהים יותר בסולם μl ומ"ג, כמו גם הפסדים באידוי ועיבוי. ההטרוגניות ביומסה הופכת משתנה גדול מאוד כאשר מנסים לאמוד כמה סדרי גודל חלקיקים פחות בכל דגימה, כלומר, 5 מ"ג לעומת ז מרובה. מבחני colorimetric המשמשים לקביעה גלוקוז וקסילוז לתאם גם עם תוצאות HPLC; עם זאת, בעוד שמבחנים צמודי אנזים לניתוח סוכר הם מהירים ויכולים להתבצע במקביל, הם לא מדויקים כמו שיטות אנליטיות כגון HPLC, החדרת שכבה נוספת של חוסר דיוק (איור 1).
בשל כל השיקולים שפורט לעיל, צריכים רק לפרש את תוצאות ומדווחות במסגרת מגבלות מסוימות. הנתונים יש לבחון בכל קבוצות, דגימות לא פרט. משכפל נדרש למאה שתוצאות ningful. מגמות וחריגות הן משמעותיות, אך תוצאות אינן חד. השוואות נעשות הטוב ביותר בסטים ניסיוניים אחת. השוואות מסעות פרסום באופן זמני או במרחב מופרד דורשות בקרה הדוקה ביותר ובחינה מדוקדקת כדי שתהיה משמעות. נתונים HTP הוא לא ישירות להשוות bench- או נתונים בקנה מידה אחרת. עקוב אחר מגמות בין HTP וסולמות אחרים, אבל השוואות מדגם ישירות לא יניבו תוצאות זהות.
ייצוג נתונים בדרך כלל נופל לתוך השוואות מגמות, חריגים, או תת-אוכלוסייה / גרסה. דוגמא למגמות היא סקר של סרבנות של 755 גרסאות טבעיות של צפצפה שנדגמו על פני טווח רחב במערב האוקיינוס השקט של ארצות הברית 19. הסרבנות של דגימות אלה היה זממה נגד יחס התוכן ליגנין וsyringyl / guaiacyl כפי שנקבעה על ידי pyMBMS. תוצאות המחקר מראים כי כS / G עולה, סרבנות יורדת עד שיחס S / G של כ 2, שבו הופעות הסרבנותרמות ovement את (איור 2). חריגים שניתן לראות בבירור באיור 3, שבו גן Pt4CL1 היה למטה מוסדר בצפצפה. כמה מאה זנים הוקרנו וכמה הם בבירור גדלו בסרבנות, כפי שמעיד על שחרור סוכר ירד. איור 4 מתאר מחקר שבו כמה זני חיטה-קש שונים גדלו בכמה אתרים על פני שנתיים וקציר לאחר מספר שינויים בתנאי גידול , וכתוצאה מכך 20 אוכלוסיות שונות המבוססות על שילובים של המשתנים. סטי מדגם אלה הם מכובדים בקלות ומצביעים על משתנים חיוביים ושליליים לסרבנות. איור 5 מראה כיצד ניתן להשתמש pyMBMS כדי להעריך את השינויים בתא-קיר הרכב. מסת רפאים שברים מוקצים למונומרים שונים ליגנין (טבלה 1). כאשר משווים מדגם עם ליגנין הגבוה לעומת תכולת פחמימות גבוהה, הפערים בנתונים ספקטרליים הם לכאורה. Tהוא משתמש בנתונים של pyMBMS בשילוב עם ניתוח עיקרי רכיב (PCA) מתוארת באיור 6. בדוגמא זו, הדגימות מסווגות לפי הפריה חנקן נמוכה או גבוהה. ליגנין ותכני פחמימות ליישר הפוך לאורך PC1. השימוש בעלילת עומסי מרכיב העיקרי יכול לסייע בזיהוי שתכונות כימיות שמתבצע הסבירו בעלילת סיווג ציונים, כמו גם המאיירת שתכונות משתנות בין אשכולות המדגם.
איור 1: השוואה בין quantitation גלוקוז וקסילוז באמצעות מבחני colorimetric תפוקה גבוהה לעומת 9 HPLC. השוואה של זיהוי גלוקוז וקסילוז בוצעה באמצעות קסילוז dehydrogenase (XDH, פנל עליון) וגלוקוז אוקסידאז / Peroxidase (GOPOD, פנל תחתון) מבחני תפוקה גבוהה colorimetric צמוד אנזים וl ביצועים גבוהיםכרומטוגרפיה מוניטורים LCD.
איור 2: סרבנות של קירות תא צפצפה כפונקציה של syringyl לguaiacyl תוכן (S / G) בליגנין 9 הגדלת הסרבנות של קירות תא צפצפה כפונקציה של syringyl לguaiacyl תוכן (S / G) בחלק ליגנין יש. נצפה ודווח. 755 דגימות ליבת צפצפה של אותו זן הצפצפה נלקחו על פני כמה מאה קילומטרים של יער בצפון אמריקה מערב האוקיינוס השקט והוקרנו לשחרור גלוקוז וקסילוז לאחר טיפול מקדים תרם-ואנזים saccharification. תוצאות היו זממו נגד יחס S / G בקיר תא ליגנין, כפי שנקבעו על ידי pyMBMS. סרבנות יורדת עם עליית S / G עד כ 2, שבו הוא נשאר קבוע בגבוה S / G. ערכי תשואה תיאורטי מבוססים על BESC הצפצפה "סטנדרטית" ומסופקים כreferenCE להשוואה.
איור 3:. סרבנות בביטוי Pt4CL1 למטה מוסדר בצפצפת דאון-רגולציה של גן Pt4CL1 בצפצפה הביאה וריאציה קטנה בקיר סרבנות תא בין שיבוטים, עם זאת כמה גרסאות סרבנות עלו באופן דרסטי מזוהות בקלות. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר גרסה של נתון זה.
איור 4: סרבנות באוכלוסיות שונות wheatstraw תופעות מסוג הזן, אתר של טיפוח, יישום דשן, ותוצאת שיעור השקיה ברמות סרבנות בבירור להבחין.. סימנים שונים מייצגים different תנאי גידול ניסיוניים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:. יישום של pyMBMS לניתוח שינויים כימיים בתאי צמח קירות 28 הפסגות מצוינים עם חצים שברי ליגנין, ושימש להערכה (א) הגבוה ליגנין (ב) תוכן ליגנין נמוך או בינוניים ליגנין (ג).
איור 6:. עלילת ציוני ניתוח מרכיבים העיקריים של הבדלים בקיר תא הכימיה של עצים המאוכלסים גדלו עם שיעורי הפריה גבוהים יותר ונמוכים יותר 28 ניתוח מרכיבים (למעלה) עיקריעשרות עלילה הממחישות סיווג שונה, ולכן, הבדלים בקיר תא הכימיה של עצים המאוכלסים גדלו עם שיעורי הפריה גבוהים יותר ונמוכים יותר. מרכיב עיקרי 1 מחיצות הדגימות המבוסס על ליגנין גבוה יותר (השלילי) או תוכן גבוה יותר של פחמימות (חיובי). עומסי המרכיב העיקריים (התחתון) להבהיר שרכיבים כימיים לשנות בין שני האשכולות של דגימות בעלילת הציונים. המקדמים החיוביים לתאם עם הציונים החיוביים, שהם נציג של תוכן פחמימות גבוה יותר, ואילו עומסים מתואמים שלילי ליישר עם ציונים שליליים, ולכן, תוכן ליגנין גבוה יותר.
| מ '/ z | משימה מולקולרית 30 | S / G / משימת H |
| 94 | פנול | S / G / H |
| 120 | Vinylphenol | H |
| 124 | Guaiacol | G |
| 137 | Ethylguaiacol, homovanillin, אלכוהול coniferyl | G |
| 138 | Methylguaiacol | G |
| 150 | Vinylguaiacol | G |
| 154 | Syringol | S |
| 164 | Allyl- + guaiacol propenyl | G |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | S |
| 168 | 4-מתיל-2,6-dimethoxyphenol | S |
| 178 | אלדהיד Coniferyl | G |
| 180 | אלכוהול Coniferyl, syringylethene | S, G |
| 182 | Syringaldehyde | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
טבלת 1:. השיא מ '/ z והקצאות לברי פירוליזה נגזר ליגנין כפי שזוהו על ידי ספקטרומטריית מסת רשימה של תרכובות אופייניות זוהו על ידי pyMBMS. משימות מולקולריות המבוססות על אוונס, RJ ות"א מילן (1987). אפיון מולקולרי של פירוליזה של ביומסה אנרגיה ודלקים 1 (2):. 123-137.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדי הכנת מדגם המפתח לקבלת נתונים מדויקים ושחזור בעת ביצוע ניסויי הקרנת תפוקה גבוהה הם כדלקמן:
סוכר השחרור Assay:
באופן כללי, דגימות ערוכים הרבה הנע בין כמה עשרות לכמה אלף בכל פעם. כל צעד גדול מתבצע בדרך כלל על כל הדגימות לפני לנוע קדימה על מנת למזער וריאציות בהכנה בין דגימות. דה-עמילן לא היה במקור חלק מהפרוטוקול וניתן להשמיט במקרים מסוימים. דגימות ליבת עץ וחומרים עשבוניים senesced הם נמוכים באופן עקבי בעמילן, ולכן אינו דורשים דה-עמילן להפחית השתנות. עמילן הוא דאגה עיקרית; עם זאת, במדגם סטים של צמחי רקמה ירוקים, במיוחד לקבוצות מדגם גדולות שבו קציר מתרחש על פני כמה שעות. כמו רמות העמילן לעלות בשעות יום ומתרוקנות בחושך, רמות העמילן יכולות להשתנות באופן משמעותי מעל יםh everal וגלוקוז מעמילן הוא שאין להבחין בין גלוקוז מתאית, ולכן, רמות גבוהה עמילן יכולות להוביל למדידות סרבנות בצורה מעוותת נמוכות. טעינת האנזים בפועל בשלב destarching היא דאגה פחותה, כל עוד יש פעילות עודפת מספיק כדי להסיר את כל העמילן הנגיש בתוך המסגרת של צעד הידרוליזה עמילן הזמן. שינויים באנזימים הספציפיים בשימוש, זמן, טמפרטורה, קצב נפח, ותסיסה של עמילן הצעד-ההסרה בהחלט יכול להוביל להבדלים ברמות הסרת עמילן ושיעורים וצריכים להיקבע באופן אמפירי במידת האפשר. לבסוף, כאשר עטיפת שקיות התה להפקה, להשתמש בחוט נחושת מצופה פח. חוטי נחושת חשופים יכולים לגרום לתגובות כימיות לא רצויות עם פתרון האנזים, נותנים ערכי סוכר שווא. נחושת מצופה בדיל פתרה את הבעיה הזאת בזמן שחוט הנירוסטה לא היה נזיל מספיק כדי לשמור על שקיות התה סגורים היטב.
גודל הפחתה עקבית של ביומסה היא קריטית לACCUנתוני שיעור משתי סיבות: 1) דק הסתובב ביומסה, ואילו לוותר בקלות רבה יותר ובאופן עקבי, גם קל יותר לעיכול מאשר חומר גס. ביומסה שהיא גסים מדי עלול להדביק את מינן, וכתוצאה מכך חומר מספיק או, אם לסתום רק באופן חלקי חוסם את פתח, זה יכול לפעול כמסננת ורק לאפשר חלקיקים דרך, ומקטין את הסרבנות הנצפית של המדגם 2). אם ביומסה מעט מדי כלולה במינן, שהוא עשוי מעיל צידי הופר, גורם לרובוט להניח הופר הוא ריק והמדגם יהיה דילג בתהליך מחלק. בנוסף, רמות נמוכות של ביומסה יכולות לתרום להטרוגניות מדגם מוגזמת, במיוחד כחלקיקים צפופים יותר (כגון קליפה) נוטים מסננת לתחתית החרוט ולקבל לוותר ראשון. כאשר פחות מ -50 מ"ג של חומר זמין, assay עדיין יכול להתבצע; עם זאת, הדגימות צריכה להיות יד-שקל. עם זאת, התוצאות של יד במשקל של יותר מאלה משתנים מלשדודotic במשקל.
הסכום בפועל של ביומסה הנדרש לצעדי ההכנה אינו מוגדר היטב. יש לנו הצענו 250 מ"ג כנקודת התחלה סבירה, עם זאת, כל דגימה ביומסה מציגה מאפיינים שונים לגבי הפסדים עקב טיפול, שחיקה, וחילוץ וכן מתעכב במינן או שחלק reproducibly. ההטרוגניות של ביומסה על פני סוגים ואפילו בתוך אותו הסוג מונעת פרוטוקול מוגדר יותר. כל מי שרוצה ליישם שיטות assay אלה פשוט יצטרכו לקבוע רבים של המשתנים הללו בעצמם, אם כי ניסיון עושה להקל.
צעד נוסף שיכול להציג את השגיאה הוא ערבוב בצלחות microtiter, שהוא קשה ביותר ובהיא קריטי במבחנים אלה מכמה סיבות. פתרון האנזים המשמש הוא מרוכז וניתן ריבוד על בנוסף לבארות, הגבלת נגישות לאנזים ביומסה. כתמורת saccharification, שוגערס שוחרר גם ריבוד ולהתרכז ליד ביומסה ותלוי בעומק הדגימה, מבחני סוכר יכולים להיות גבוהים באופן מלאכותי או נמוכים. זו הסיבה מדוע זה חיוני כדי לערבב דגימות לאחר תוספת האנזים וsaccharification אנזים, המאפשר ערבוב יסודי של אנזימים עם ביומסה אפילו saccharification והתפלגות אחידה של הסוכרים התוצאה כדי לאפשר ניתוח סוכר עולה בקנה אחד. בלוחות שאינו מכילים ביומסה, כגון צלחות דילול או assay, ערבוב על ידי pipetting חזר (טחינה דקה) הוכיח להיות עדיף בהרבה מאשר רועד. עם זאת, כפי שיש לי פתרונות בפרוטוקול זה צפיפות משתנה ורמות חלקיקים, מהירות pipetting ומיקום קצה אנכי בעמודת הנוזל הוא קריטי. אם המהירות היא דיוק מהר מדי, עני בשל cavitation (שאיפה) ושמירת נוזלים בקצה (מחלק) יכול להתרחש. אם הקצה הוא עמוק מדי בבאר, ביומסה עלולה לסתום את קצה הקצה או עשוי להיות צמודה לתחתית, מניעת שאיפה מדויקת, וישהוא שטח חיצוני יותר לנוזל להיצמד ולשריד לשלב הבא. הנושא האחרון יכול להיות מיתן במידה מה על ידי שליטה במהירות נסיגת הקצה, כמו הסרת קצה איטית מאפשרת נוזל להסרה לפתרון בתפזורת על ידי מתח פנים. אם נסיגת קצה היא איטית מדי, נוזל pipetted יכול לזחול בחזרה לפתרון בתפזורת, כמו גם. חלקיקים ביומסה גם יש נטייה להיצמד לטיפים והופכת הועברה לצלחת הדילול, שבו הם יכולים לסתום את הקצה במהלך ערבוב או העברה לצלחות assay, יצירת אי דיוקים בכרכי מדגם להיות מנותחים. חלקיקים אלה עלולים גם להפריע לניתוח ספקטרוסקופיות של צלחות assay אם הם חוסמים את קרן האור בקריאה.
עיתוי פיתוח צבע עקבי הוא קריטי עבור GOPOD ומבחני XDH. הצבע-הפיתוח יש לאפשר ללכת להשלמה; עם זאת, צבע assay GOPOD נוטה להמשיך ולעלות לאחר ההשלמה וNADH שנוצר על ידי assay XDH לאטיורד עקב חמצון ספונטני של NADH. כתוצאה מכך, עיתוי שונות יכול להוביל להשוואות עקביות של נתונים בין צלחות נפרדות. צריכים להיות במעקב צעדי assay בזהירות, כמו הפסקות עקב בעיות חומרה או תוכנה יכולות לגרום להבדלים גדולים בזמני assay. השימוש בסטנדרטים סוכר ובארות שליטה ביומסה סטנדרטית בכל צלחת יכול לעזור להקל על זה במידה מסוימת.
PyMBMS:
תקנים יש לשקול בזהירות לניסויי pyMBMS להשוואה לשיטות כימיות רטובות סטנדרטיים. בשל ההרכב השונה ליגנין (יחס S / G) של מינים ביומסה, גורם התיקון צריך להיקבע באמצעות תקן נציג שהוא אותו המין כמדגם הניסיוני. אם אין תקן מתאים זמין, הבדלים בריכוז ליגנין ניתן להשוות באמצעות העוצמות של מבשרי ליגנין ישירות. S הגבוה / יחסי G (מעל ~ 3.5) יכולים להוביל להערכת יתר של Lignin תוכן על ידי pyMBMS. זו נגרמת על ידי הנטייה ליגנין S להשתחרר מועדף בתנאים סטנדרטיים המשמשים בשיטה זו. בנוסף, הסכום של מדגם הדרוש למדידות pyMBMS תלוי בסוג של ביומסה בשימוש. תרכובות ליגנין והמודל ליגנין מבודדות דורשות פחות חומר (0.1 מ"ג), כמו שימוש aliquots גדול יותר של מדגם יכול להרוות את הגלאי.
עוד צעד קריטי בתהליך PyMBMS הוא כוונון זהיר של מכשיר לסטנדרטי כגון perfluorotributylamine (PFTBA) ידוע לפני כל ניסוי. PFTBA מכיל פסגות מולקולריות על פני כל הספקטרום של ביומסה הטיפוסית, ולכן מאפשר כוונון כלי אחיד בין ריצות ניסיוניות. אזור אמצע ספקטרום PFTBA מכוון כך שמ '/ z 131 ו'/ z 219 הם כ 50% מהעוצמת מ' / z 69. כוונון זה משמש כדי להדגיש פסגות טיפוסיות ראו תחת יינון רך (17 eV) משמש כדי למזער את הפיצול של יונים להמונים נמוכים שג להיות מזוהה בקלות ANNOT.
יש לציין כי שיטות אלה אינן שיטות אנליטיות לכימות של analytes עניין המדויק. במקום זאת, טכניקות תפוקה גבוהה אלה להקרנה של ביומסה הגדולה קובעת לזהות את אותם בעל תכונות הכימיות הרצויות. יש להשתמש בשיטות אלה רק להקרנה, דירוג, ומתאם של דגימות בתוך ערכת נתונים. ערכות נתונים לא ניתן להשוות ישירות כאשר נאספו בימים שונים בשל מקורות הווריאציה כגון להיסחף אינסטרומנטלי, שינויים בפעילות אנזים, תכולת לחות הסביבה ביומסה עקב שינויים בלחות, תנודות בטמפרטורה, והבדלים בטיפים והרבה צלחת ספיגה . בנוסף, לפני הטיפול בשימוש בפרוטוקול הכנת המדגם הוא לא אסטרטגיה מקדים מותאמת, אלא תוכנן במיוחד כדי להיות תת-אופטימלי. זה מאפשר הבדלים דקים בין הצמחים שהובהרו בצורה יעילה יותר.
jove_content "> היתרון העיקרי של אימוץ שיטות תפוקה גבוהה הוא שהרבה יותר דוגמאות ניתן למדוד באותה תקופה 18. לדוגמא, שיטה נפוצה לניתוח פחמימות הנוצרות במהלך saccharification חומצה או האנזימטית הוא השימוש בביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC). זליג et al., מדינה שהידרוליזה חומצת שני שלבים בכל מקום, אם כי די שימושי ובעל חשיבות עליונה לכימות של פחמימות מבניות, מגביל חוקרים כדי להיות מסוגל להעריך כ 25 דגימות בשבוע 9. בעוד אנליטיים המכשור המועסק במתודולוגיות תפוקה גבוהה לא יכול לספק את הרגישות של טכניקה סטנדרטית כמו HPLC, הניתוח המהיר מאפשרת לחוקרים את המותרות של להיות מסוגל להעריך כמויות גדולות של דגימות. בנוסף, שיטות התפוקה גבוהה לעתים קרובות downscaled פרוטוקולי ניסוי, הפחתת השימוש בחומרים מתכלה, ולכן, הפחתת עלויות ובזבוז ניסיוניים.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
- Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , Earthscan. 53-80 (2009).
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
- Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).
