Introduction
作为非可再生燃料及其相关产品的下降的全球供应，科学家一直面临的挑战是从来自植物的来源1创建类似燃料和化学品。这项工作的一个关键方面是确定哪些植物物种可以适合于生产生物燃料和生物材料2,3。通常情况下，这些原料被评估为木质素，纤维素和半纤维素含量;以及通过具有或不具有随后的酶糖化热，机械和/或化学预处理其易感性解构（顺应）。更详细的分析来确定木质素和半纤维素级分的所需的特定组合物以及最佳酶活性。植物转基因的修改不具有内在的理想性状的生化或热化学转化为所需的商品为研究者提供火锅大大扩展源无穷区间原料4。用于量化的植物的化学特征，而对于小样品组相当有用的标准分析方法，是不适合于数百个样品5-7或数千的快速筛选。本文所描述的HTP方法已经发展到快速和有效地评估大量的生物量的变体，以用于热化学和/或酶降解的改变细胞壁不顺应。
重要的是要理解，本文所述的HTP筛选测定没有被设计来最大化转换或收率是非常关键的。的目标是确定在相关的生物量样品的固有不顺应相对差异。其结果是，许多分析步骤不同于“典型”的生物质转化测定中，当目的是获得最大的转化率或程度。例如，低级预处理严重性和较短酶水解时间用于最大化不同样本之间的分配办法。在大多数情况下，相对高的酶负荷，来降低由于实验误差在酶的活性，这可能显著扭曲结果的差异。
用于确定植物细胞壁和单体糖的组合物快速技术解放区以下酶糖化包括机器人，定制的，热化学兼容的96孔板，以及标准实验室方法8-11的修改和器乐的协议，如振动光谱（红外（IR），近红外（NIR），拉曼或）和核磁共振（NMR）12月17日 。这些方法的关键是分离的原料具有高纤维素或低木质素含量，或那些预计产量最高的葡萄糖，木糖，乙醇等 ，这些方法都使能缩小的分析雇用小批量生物质和消耗品，导致减少的实验费用18 9，杨树8,10，甘蔗渣8，和柳枝8已用这些HTP方法被成功地进行评价。
总木质素和木质素单体组合物通常还定量生物量的性状。在木质素含量的减少已被证明能增加多糖19,20的酶解。该木质素单体的比例（通常报告为紫丁香/愈创木（S / G）的含量）的角色扮演，在植物细胞壁的解构仍在进一步调查中。一些报道已表明，降低的S / G比导致了下面的21水解糖产量增加，而其他的研究揭示出相反的趋势19,22。高通量方法，用于评估木质素及其单体包括振动光谱（IR，NIR，拉曼和23-26）加上多变量分析，和热解分子束质谱（pyMBMS）27,28。
当开发HTP方法筛选生物量，有几个组成因素需要牢记。一个关键方面是该方法的复杂性。什么是该技术所需的技能级别？化学计量学分析中，例如，需要用于构造，评估和维持预测模型的特殊技能。标准的方法表现出不良的准备和数据分析的步骤或使用有毒试剂。模型的发展是一个持续的过程，其中新的数据被合并到模型中随着时间的推移，增加了模型的鲁棒性。另外consid关合作是节省成本和降低的提议的高通量方法实验分析时间。如果该方法是相当快速的，但很昂贵，这可能不是一个可行的技术许多实验室采纳。在这个手稿中所示的方法是标准化的技术，修改，以放大的吞吐能力的变体。这些协议定量测量感兴趣的生物量的性状而不需预测模型的开发。这是这些技术中，由于预测方法的关键属性，同时表现出很强的相关性的标准分析用于开发模型，是不一样精确实际测量为样品利益的量。而使用的基本上是按比例缩小的标准实验室规模的分析方法的版本的方法中，准确度和精度进行交易的速度和吞吐量。大多数情况下，这种结果是由于体积小，移液，重较高的错误;以及增加小号充足异质性样品尺寸减小。虽然大样本组进行筛选和比较，精雕细琢必须作出之间的单独活动和实验室规模的结果进行比较时，应小心。
最耗时的步骤包括生物质的物理操纵。研磨样品可能需要每个样本数分，其中包括清理出样本之间的磨。手动加载，卸载，清理料斗和填充和清空茶叶袋和样品袋也很费力。虽然每个步骤可能需要一分钟或更长，这样做成千上万的样本可能需要几个小时甚至几天的时间。机器人可以加载一个典型的反应器板与生物量在约3至4小时，或6至8天板-1机器人-1。这种情况取决于所使用以及类型和生物质的量要测试的精度参数。填充反应器板，用水，稀酸或酶迅速完成使用液体处理机器人。 P一个板叠（1〜20反应器板）的再处理需要1至3小时时组件，冷却，并拆卸是包括在内。酶水解需要3天，糖分析需要约1小时的准备时间加上每个反应器板10分钟以完成测定和读取结果。的设置预处理和分析天甲每周计划容纳一个合理的工作日程，最小化奇数小时和周末的努力用于测定的人力组成，并允许进行处理，每周〜800〜1000的样品在持续的基础。最大吞吐量取决于几个因素，主要是关于硬件（机器人，反应器板等）和多少“软件”（即，工作人员）可用做手动工作。实际的上限为2500至3000样本/周;但是，输出需要7天一个星期的操作和多个学生实习和技术人员。相比较而言，3000的样品用HPLC将需要大约125天山姆PLE分析加分析手动称量样品进入反应堆和过滤样品前额外的劳动。
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Protocol
1.高通量测定葡萄糖和木糖产量继酶糖化9,29
- 样品制备（研磨，去上浆，提取，预处理）
- 磨至少300毫克用Wiley磨，使得颗粒通过20目（850微米）筛每个生物质的样品。转移到防静电顶部拉链袋（通常条形码）和记录样本的信息的条形码数据库。
- 加入约250毫克或更多的地面生物量从防静电袋一个编号（用铅笔，不使用墨水或标记）茶叶袋，仔细地卷起的茶包，是一定会随着生物质折端，以防止在去上浆和提取的损失。
- 包裹使用镀锡铜线关闭袋泡茶。记录每个条码样本袋泡茶数量。
- 准备从商业酶（典型地，0.25％（体积/体积）葡糖淀粉酶（〜1600 AGU / L）和脱上浆酶溶液1.5％（体积/体积）的α-淀粉酶（〜2900 KNU-S / L）在0.1M乙酸钠（pH 5.0））。准备每克散装生物质16毫升或每120袋泡茶样品500毫升。注：荷载能够从地面生物量去除淀粉应由消化后检测淀粉与一系列酶的负荷和比率的经验来确定。
- 在塑料容器中，每1克的批量地上生物量添加加入16毫升去上浆酶溶液。对于间歇脱上浆协议，添加120茶袋至500ml缓冲 - 酶溶液。
- 孵育摇床中以55℃，24（±4）小时，以120rpm以除去可能的淀粉。
- 解上浆孵育后，冲洗并浸泡生物质中几升的去离子水30分钟。重复此过程，附加2次，以除去缓冲盐可以导致碰撞（形成气泡的在溶液中，可能导致突然和剧烈上升，溶液的水平，从而引起热液体乙醇级联出提取期间反应容器）的。
- 在脱浆生物质的详尽漂洗，将茶袋放入索氏柱进行萃取。没有顶针需要此步骤。
- 设置索氏回流，用95％的乙醇和提取的样品24小时。
- 从索氏反应器取出茶袋和摊开在单个层上的平板状的托盘。
- 允许将样品干燥过夜，在室温下在通风橱中。
- 展开的茶包，并返回干燥的生物质原条形码防静电袋。
注意：防静电袋是有效减少在生物量静电，改善了操作特性。如果其他的存储选项时，附加的生物质可能需要由于生物质抱住存储容器的侧面。 - 传送至少50毫克的干燥的生物量的一个条码料斗（使用更多的材料是用于精确分配更好）。小号可以防静电袋和所述接纳料斗条形码以确保准确的抽样跟踪。
- 装载斗到固体称重机器人，密切关注在机架中的样品的顺序。加载足够反应器板以包含所有的样品，并选择基于所用板的数量分配的协议。
- 机器人称量5毫克的干燥样品（±0.3毫克）成耐酸不锈钢96孔板中。称出该板周围分布各样品的3个重复，以尽量减少任何局部的变化。
- 为了跟踪测定性能包括良好表征的生物材料标准的8控制生物质样品。对多块板，使用多个标准生物质料斗将最小化引起的过重复分配循环筛分在料斗粒径漂移。
注：在每个板，应该有24个样品用3个重复，4坯料包括去离子水和酶，和8 CONTROLS，利用先前表征的标准生物质。每4个角的板的3角井的糖标准品的保留。 - 检查空白和糖的标准井错误的生物质颗粒，如果存在删除。
- 加入250微升去离子水到各孔中，并密封用硅氧烷粘合剂背衬聚四氟乙烯（PTFE）胶带将板。
- 用1/8“烙铁头，刺破聚四氟乙烯带在每个蒸汽口（117个）的每块板。使用一个空盘子堆放在密封反应器板为指导，限制PTFE薄膜的运动。
- 夹紧板紧密0.031“厚玻璃纤维增强聚四氟乙烯板和空板之间的垫片（预穿孔与孔蒸汽端口）的顶部和堆叠的底部。预处理用蒸汽反应器设定为180℃17.5分钟，或基于期望严重性其他温度/时间组合的样本。
- 凉爽反应器板至50°下通过用水浸去离子水。
- 酶糖化
- 准备由8％（体积/体积）的酶溶液中的1.0M柠檬酸钠，pH值5.0的酶糖化溶液。准备每个反应器板5毫升注意：需要应根据特定股票酶溶液的活性和蛋白质含量来确定稀释。
- 当板是冷，离心它们在吊桶式转子中以1500×g离心20分钟。除去封口膜。注意：这些板块都很重，离心机规格应检查兼容性。
- 添加40微升8％酶母液的向每个孔（每克生物量70毫克酶）。
- 重新封装新的PTFE带。将密封板进入磁板钳。
- 轻轻地混合样品进行反演（至少15次），和孵化在50℃，70小时。
- 当糖化的结论，颠倒混合和离心板在1500 x克20分钟。
- 糖含量
- 准备一组6个葡萄糖和0.014柠檬酸缓冲木糖合成校准标准（pH5.0）中从0到0.750毫克/毫升（0，0.2％，0.3，0.45，0.65，和0.75毫克/毫升推荐）和0至0.600毫克/毫升（0，0.1，0.2，0.35，0.45，和0.6毫克/毫升推荐）为葡萄糖和木糖，分别。
- 根据试剂盒说明书制备葡萄糖氧化酶/过氧化物酶（GOPOD）和木糖脱氢酶（XDH）试剂。
- 使用移液管，在4角孔和边缘孔邻近于反应器板的角部的孔（12总孔）除去200微升的液体。
- 使用移液管，取180微升去离子水至96孔聚苯乙烯平底板稀释板的每孔中。不要加水至12糖标准和角井（如果使用的是96通道的头删除这些提示）。
- 使用移液管，取180微升GOPOD试剂的葡萄糖测定的每个孔复吃了。
- 使用移液管，取180微升的XDH试剂木糖测定板的各孔中。
- 使用移液管，转移20微升的水解产物的等分试样从96孔反应器板固定到稀释板。吸管从孔中的上段，以避免生物质固体和在角落孔残余液体。通过研磨混合至少10个周期。
- 使用移液管，转移110微升糖标准，一式两份，向稀释板的角落孔中。
- 使用移液管，从稀释板转移20微升等分试样的葡萄糖和木糖的测定板。通过研磨混合。
- 孵育葡萄糖和木糖的测定板在室温下30分钟。阅读前仔细破坏任何表面的气泡。简要地通过在板的表面上的热枪效果很好。
- 使用紫外/可见的96孔读板器，将测得的波长至510纳米，记录对试剂空白的吸光度。该测定监视的形成醌亚胺的，它正比于葡萄糖浓度。中的葡萄糖浓度从基于在1.3.1中制备的校准标准的校准曲线计算。
- 使用紫外/可见的96孔读板器，将测得的波长至340纳米，记录吸光度。这种测量监测NAD +的还原成NADH，其正比于木糖浓 度。木糖浓度从基于1.3.1制备的校准标准校准曲线计算。
2.高通量测定的总木质素和木质素单体含量使用pyMBMS 28
- 样品制备
- 研磨并提取利用在步骤1.1.1，和1.1.6-1.1.8描述的方法的生物质。这包括研磨和提取一组标准的使用作为实验对照。
注：pyMBMS测量电对此语句不是颗粒尺寸依赖，因此，如果只使用pyMBMS协议，生物质制剂应进行，以使样品适合于样品架，<4毫米。 - 使用小刮勺分配大约4毫克（3至5mg优选）所制备的生物量成80μl的不锈钢杯设计的自动采样器。
- 确保被分析的样品至少10％的控制标准，如那些可从标准和技术研究所（甘蔗渣-8491;杨-8492;松-8493;或麦秸-8494）。该标准还可以是类似于待分析的样本已经使用标准的方法，其特征的任何物种。
- 随机装载样品到使用镊子，以避免偏见的自动进样杯，由于可能的光谱漂移随着时间的推移。注：样品的典型随机化将包括一旦所有检体的测定，随后重新随机化的样本进行重复测量的顺序。随机程序可在网上。
- 使用标准打孔，手动型A / D玻璃纤维片材生产玻璃过滤盘，无粘合剂。持圆形玻璃纤维过滤器，镊子，居中过样品杯，并推入样品用3.5毫米的内六角扳手在实验过程中，以限制在每个杯中的材料。
- 研磨并提取利用在步骤1.1.1，和1.1.6-1.1.8描述的方法的生物质。这包括研磨和提取一组标准的使用作为实验对照。
- 器乐协议
- 校准使用公知的标准，有峰强度超过可能存在的实验样品的化合物的整个范围质谱仪。对于典型的生物样品，使用全氟三丁胺（PFTBA）。
- 置使用气体流量计的氦载气流速以0.9升/分。
- 设定自动采样器炉以500℃的热解温度，并使用自动取样软件接口温度为350℃。注：1/8“不锈钢加热包裹在该自动取样连接到质谱仪热带传输线是用在250℃下的热控制器控制。
- 开始质谱仪的数据采集，并等待至少60秒，以获得足够的数据背景光谱采集。
- 开始自动自动取样方法与来自2.2.2的规格。注意：自动取样单独地滴每个样品放入自动取样炉。总的数据采集时间是约1.5分钟;然而，一种典型的4毫克样品的热解是30秒之后完成。
- 使用质谱仪软件在0.5秒的扫描速度每个样品的记录总离子含量（TIC）。 M / Z 30至450之间的记录强度。
注：典型的生物质化合物，使用软电离为17伏特。该仪器可以记录从M / Z 1大间隔1000;然而，扫描速度将通过电脑CPU功率的限制。 - 用马从光谱去除背景NUAL增强特征在软件中。注：在数据采集开始时的基准的60扫描一部分被用来计算平均背景值。这个平均的背景光谱被从质谱仪中软件的实验样品自动光谱。
- 导入由含各样品的光谱数据质谱仪软件创建的单个列的文本文件，数据库程序，所有的样品合并为一个数据库。添加任何适用的元数据到电子表格。导入格式的数据（电子表格/ CSV文件）到一个统计软件包，平均规范化的频谱来解释变化的热解样品群众。
- 使用统计软件包使用所述光谱数据来分析在测量中使用的复制的标准样品的分组来执行主成分分析（PCA），以及评估其峰是不可或缺的化学品的分类在负载化合物积28。
注意：PCA组根据它们的光谱的相似性的样品中，并且允许标准的检查，以了解实验误差由于在运行期间仪器漂移。 - 为了计算木质素紫丁香（S）/愈创木（G）的比例，总结在S峰的面积（M / Z = 154，167，168，182，194，208和210）和除以G的峰的总和在124，137，138，150，164，和178。
- 计算总木质素含量，总结木质素峰M / Z = 120，124，137，138，150，152，154，164，167，178，180，182，194，和210。
- 计算用于缩放pyMBMS测量到的标准方法来估计总木质素，如Klason木质素校正系数。通过测量使用pyMBMS该标准样品的总木质素含量除以个人本位的Klason木质素值。
- 将此校正因子的所有像物种中的数据集。重复每种类型的生物质进行分析。 ñOTE：校正因子的变化在显著基于所分析的生物的S / G。
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Representative Results
热化学预处理和随后的酶糖化的组合效果测量为葡萄糖和木糖的在测定结束释放的质量的函数。结果列在葡萄糖和木糖的每克生物量释放毫克方面。与此形成鲜明对比的从工作台规模的测定法，基于所述原料的组成分析其通常报告为％的理论产率报告的数据。因为它是尚未实用进行组成分析数千个每周样品，数据最好是报告为以质量计转化水平。只要这允许合理样品评价为比较是生物量密切相关的样品和样品的组合物之间进行不变化太多。
该试验的主要目的是评估在植物细胞壁的耐热化学结合/ enzym的相对差异在一系列单独的变种ATIC糖化。值得一提的是，该试验不试图优化任何用于糖化的条件。事实上，预处理严重性条件显著次优的，以扩大该测定的灵敏度范围，靶向的最终转化率的50％〜70％的理论产率。在或接近最佳预处理条件将推动所有样品，以高转化率，大大缩小了测定的动态范围。相反，酶用量是比通常报道的工作台规模的消化大得多。再次，该方法的目的不是找到最好的酶或减少酶的成本，但测量单元壁的固有顽抗到转化率和使用非常高的酶负载移除变性从测定。
最后，要明白，在整体化验的变异比报道的台钳显著更高是重要H-规模的工作。典型的标准误差是在8％左右，虽然范围更广。这简直是小规模的，HTP研究的性质。移液和称重误差在微升和毫克规模比例较高，因为是蒸发和冷凝的损失。每个样品中测定震级颗粒少几个数量级时， 即 5毫克vs.多克生物异质性成为一个非常大的变化。所述比色测定用于测定葡萄糖和木糖很好地相关与HPLC结果;然而，虽然酶联测定法糖分析是快速和可平行进行的，它们并不一样精确的分析方法如HPLC，引入的不精确的另一个层（ 图1）。
由于所有上述考虑，结果只应解释和内某些限制的报道。数据应审查整个集合，而不是单个样品。复制所需的MEAningful结果。趋势和异常值是有意义的，但单一的效果都没有。比较最好在单一实验组进行。跨越时间上或空间上分离运动比较需要极其严格的控制，并认真审查才有意义。 HTP数据不可直接比较基准测试或其他大规模数据。在HTP等尺度之间的趋势跟踪，而是直接样品比较不会产生相同的结果。
数据表示通常分为趋势，离群，或亚群/变体的比较。趋势的一个例子是杨树的采样在一个范围广泛的美国19太平洋西北755自然变异顽固的调查。这些样品的不顺应作图对他们的木质素含量和紫丁香/愈创木基比率如通过pyMBMS确定。结果表明，作为S / G上升时，不顺应减小，直到约2的S / G比值，其中不顺应展示次数ovement水平关闭（ 图2）。离群值可以清楚地看出在图3中，其中Pt4CL1基因下调白杨。几百个品种进行了筛选和几个显然增加顽抗，就证明了这减少糖的释放。 图4描述了其中几个不同的麦秸品种几种变化的生长条件后，生长在许多名胜超过两年收获的研究，导致基于上述变量的组合20个不同的种群。这些样本集是容易区分和指示不顺应正和负变量。 图5示出了如何pyMBMS可以用来评估改变细胞壁的组合物。质谱片段被分配给不同木质素单体（ 表1）。当比较具有高木质素与高碳水化合物含量的样品，在光谱数据的差别是显而易见的。 Ť他使用的加上主成分分析（PCA）被示于图6 pyMBMS数据。在本例中，样本被按低或高的氮施肥分类。木质素及碳水化合物含量成反比对齐沿PC1。使用的主成分载荷情节可以在确定哪个化学性状在分数分类情节，以及阐发其性状样品群集之间变化被解释帮助。
图1：使用高通量比色法对比性HPLC 9葡萄糖和木糖定量比较。葡萄糖和木糖的检测的比较进行了使用木糖脱氢酶（XDH，上图）和葡萄糖氧化酶/过氧化酶（GOPOD，下图）的高通量比色酶联测定法和高性能升iquid色谱法。
图2：杨树细胞壁作为紫丁香的函数来愈创木木质素9（S / G）的含量增加的杨树细胞壁不顺应作为紫丁香的函数来愈创木在木质素级分（S / G）含量顽拗具有被观察到并报道。同样的杨树品种755杨木芯取样了几百英里的森林在北美西北太平洋和热化学预处理后筛选葡萄糖和木糖释放和酶糖化。结果作图在细胞壁木质素在S / G比值由pyMBMS确定。随着S / G，直到约2，在那里它保持在较高的S / G恒定顺应减小。理论产率的值是基于BESC“标准”杨树和提供为参照的文CE进行比较。
图3：顽拗在杨树下调Pt4CL1表达下调Pt4CL1基因杨树导致了无性系之间的细胞壁顽抗变化不大，但是几个大幅增加顽固的变种很容易识别。 请点击此处查看大图版本这个数字。
图4：顽拗各种麦秆人群品种类型，部位种植，施肥，浇水率结果的明显区别顽抗水平的影响。不同的符号代表各色新台币实验的生长条件。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：pyMBMS的应用为在植物细胞壁 28的化学变化的分析表示带箭头的峰是木质素片段，以及被用来评估（ 一 ）高木质素（二）中的木质素或 （c）木素含量低。
图6：在生长具有较高和较低的受精率28人口稠密树木的细胞壁化学差异的主成分分析的分数曲线图 （顶）主成分分析分数绘制示出一个不同的分类，因此，在人口稠密的树木的细胞壁化学差异生长具有较高和较低的受精率。主成分1隔开的样品基于更高木质素（负）或更高的碳水化合物（正）的内容。 （底部）的主成分载荷阐明其化学成分的两个集群中的得分情节样品之间进行切换。正载荷关联与正的分数，具有代表性的较高碳水化合物含量，而负相关载荷对准负分，因此，较高的木质素含量。
| M / Z | 分子转让30 | S / G / H分配 |
| 94 | 苯酚 | S / G / H |
| 120 | 乙烯基苯酚 | H |
| 124 | 愈创木酚 | G |
| 137 | Ethylguaiacol，homovanillin，松柏醇 | G |
| 138 | Methylguaiacol | G |
| 150 | Vinylguaiacol | G |
| 154 | Syringol | 小号 |
| 164 | 烯丙基+丙烯基愈创木酚 | G |
| 167 | Ethylsyringol，syringylacetone，propiosyringone | 小号 |
| 168 | 4-甲基-2,6-二甲氧基 | 小号 |
| 178 | 松柏醛 | G |
| 180 | 松柏醇，syringylethene | S，G |
| 182 | 丁香 | 小号 |
| 194 | 小号 | |
| 208 | Sinapylaldehyde | 小号 |
| 210 | Sinapylalcohol | 小号 |
表1：由pyMBMS检测的典型的化合物的质谱分析所检测的峰值米/ z和分配木质素衍生的裂解片段列表。根据埃文斯，RJ和TA米尔恩（1987）分子的任务。 。123-137： 生物质能源和燃料 1（2）热解的分子特征。
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Discussion
是关键的样品制备步骤用于进行高通量筛选实验时获得精确的和可重复的数据如下：
糖释放试验：
在一般情况下，样品在许多范围从几十到几千一次制备。每个主要步骤通常之前向前移动，以最小化的变化样品之间准备进行所有样品。脱上浆最初并不是该协议的一部分，并且可以在某些情况下可以省略。木芯样品，衰老草本材料是一致的低的淀粉和，因此不需要脱上浆，以减少可变性。淀粉是一个大问题;然而，在绿色组织中的植物样本集，特别是对其中的收获出现在几个小时的大样本集。由于淀粉含量在白天上升，黑暗中被耗尽，淀粉含量可以通过小号显著改变从淀粉everal H和葡萄糖是从纤维素葡萄糖别无二致，因此，高淀粉含量可能会导致失真低顽固测量。实际的酶加载在destarching步骤较小关注的，只要有足够的多余的活性淀粉水解步骤的时间框架内除去所有可访问的淀粉。在所用的具体的酶变体，时间，温度，淀粉除去步骤的体积和搅拌速率当然可以导致淀粉清除水平和率的差异，并应根据经验来确定在可能的情况。最后，包装茶袋进行提取时，使用镀锡铜线。裸铜线可能会产生意想不到的化学反应与酶的解决方案，提供虚假糖值。涂锡铜解决了这个问题，而不锈钢丝是不够的延展性，以保持茶袋紧闭。
一致的大小减小生物质是ACCU临界率数据的原因有两个：1）细研磨的生物质，而更容易地和一致地分配，也更容易消化比较粗的物料。 2）生物质是太粗糙会堵塞料斗，导致材料不足，或者，如果堵塞仅部分地阻塞开口，它可以通过充当筛并只允许细小颗粒，从而降低样品的观察到的不顺应。如果过少的生物量包含在料斗，它可涂覆料斗的两侧，使机器人呈现料斗为空，并且将样品在分配过程被跳过。此外，生物质的低水平可以向夸张样品的异质性，尤其是作为致密颗粒（如猪皮）往往筛到锥体的底部，并获得第一分配。当小于50毫克的材料是可用的，所述测定法可以仍然进行;然而，样品应该是手工称重。然而，手工称重结果比从抢多个可变耳称量。
生物质所需的准备步骤的实际量没有明确定义。我们建议250毫克作为合理的起点，然而，每个生物质样品显示对于因处理，研磨，并提取以及被保持在所述料斗或被分配再现地损失不同的特性。跨类型和即使在同一类型的生物质的异质性排除一个更定义的协议。那些希望实现这些检测方法将只需要确定很多这些变量为自己，虽然经历确实更容易。
能引进误差另一个步骤是混合在微滴定板上，这是非常困难的，并且在这些测定几个原因是至关重要的。所使用的酶溶液浓缩并在加入到孔中，可以分层，限制性酶无障碍的生物质。作为糖化的进行，SUGARS释放也可能分层和集中靠近生物质和根据采样深度，糖测定法可以是人为地偏高或偏低。这就是为什么它至关重要加入酶和酶糖化后混合样品，允许与所述生物质的酶的对偶糖化，将所得的糖的均匀分布充分混合，以允许一致的糖分析。在板不包含生物质，例如稀释或测定板，通过反复移液（研磨）混合已被证明是远远优于晃动。然而，如在该协议解决方案具有可变密度和颗粒物水平，移液速度和垂直末端定位在液柱是至关重要的。如果速度太快，精度差由于气穴（抽吸）和液体保持在尖端（分配）就可能发生。如果前端是在井太深，生物质可能阻塞尖端或尖端可以压到下方，防止精确抽吸，并有更外表面面积为液体抱住并携带到下一步骤。后一个问题可以通过控制尖端撤出速度一定程度上减轻，较慢尖端去除允许液体被移除以本体溶液通过表面张力。如果尖端戒断太慢，吸液的蠕变现象，回本体溶液为好。生物质颗粒也有一种倾向，附着在提示和成为转移至稀释板，在那里他们可以混合或转移到测定板中堵塞的前端，产生在样品体积的不准确的分析处理。这些颗粒也可与测定板的光谱分析干扰，如果他们在读阻塞光束。
一致的显色时间是GOPOD和XDH试验的关键。该显色必须被允许去完成;然而，GOPOD检测颜色也较偏向继续完成并通过XDH试验产生的NADH后缓缓升起降低由于NADH的自发氧化。其结果是，定时变异可导致分离板之间的数据的不一致的比较。该测定的步骤应仔细监测，因为停工由于硬件或软件问题可以导致在测定倍大的差异。在每块板中使用的糖的标准和标准的生物质对照孔可以帮助减轻这种在一定程度上。
PyMBMS：
标准必须仔细考虑pyMBMS实验进行比较，以标准的湿化学方法。由于生物质种类的不同木质素组合物（S / G比值）时，校正系数必须使用具有代表性的标准即同种作为实验样品来确定。如果没有可用的适当的标准，在木质素浓度差可以通过直接的木质素前体的强度进行比较。高S / G比值（超过〜3.5），可能导致升高估IGNIN含量pyMBMS。这是由倾向造成了小号木质素在本方法中使用的标准条件下被优先释放。另外，样品的所需pyMBMS测量的量取决于所使用的生物质的类型。孤立木质素和木质素模型化合物需要更少的材料（0.1毫克），作为使用较大的样本的等分试样可以饱和检测器。
在PyMBMS过程的另一个关键步骤是每次实验前仔细调谐仪的一个已知的标准，例如全氟（PFTBA）。 PFTBA包含分子峰横跨典型的生物量的整个范围，并因此使得实验运行之间的均匀乐器调音。所述PFTBA光谱的中间区域被调谐，使得M / Z 131和m / z 219大约M / Z 69的强度的50％。这调谐用于强调下软电离看出典型峰（17 eV）的使用以离子碎裂尽量减少人民群众的低级C ANNOT很容易识别。
应当指出的是，这些方法并不对感兴趣分析物的准确定量的分析方法。相反，这些高通量技术对于大型生物量的筛选集，以确定那些具有所需的化学性状。这些方法只能用于筛选，排名和样品相关的数据集内。数据组不能直接由于湿度的变化，在温度波动，并在尖端的差异和吸光度板手时相比于由于变异来源如器乐漂移，改变酶的活性，在所述生物质的环境的水分含量不同天收集。另外，在样品制备协议中使用的预处理是不优化的预处理策略，而是已被专门设计为次优的。这使得能够更有效地阐明植物之间的细微差别。
jove_content“>采用高通量方法的主要好处是，有更多的样品可以在相同的时间段18来测量，例如，用于分析过程中的酸或酶促糖化产生的碳水化合物的常用方法是使用高性能液相色谱（HPLC）。塞利格。等，状态无处不两步酸水解，尽管非常有用和最重要的，以结构性碳水化合物的量化，限制了研究人员能够评估每9周大约25个样本。当分析仪器在高通量方法使用的可能无法提供的标准技术像性HPLC的灵敏度，快速分析，得到的研究人员能够评估大量样品的奢侈品。此外，高通量方法往往都缩小的实验方案，减少使用的消耗品，因此，降低实验成本和浪费。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
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