Introduction
Comme l'offre mondiale de combustibles non renouvelables et de leurs produits déclins associés, les scientifiques ont mis au défi de créer des carburants et des produits chimiques similaires à partir de sources d'origine végétale 1. Un aspect clé de ce travail est de déterminer quelles espèces de plantes peuvent être appropriés pour la production de biocarburants et des biomatériaux 2,3. En général, ces matières premières sont évaluées pour la lignine, la cellulose, l'hémicellulose et la teneur en; ainsi que leur sensibilité à la déconstruction (récalcitrant) par un prétraitement thermique, mécanique et / ou chimique, avec ou sans saccharification enzymatique ultérieure. Des analyses plus détaillées sont utilisés pour déterminer la composition spécifique de la lignine et l'hémicellulose fractions ainsi que des activités enzymatiques optimales nécessaires. Les modifications transgéniques de plantes qui ne possèdent pas intrinsèquement traits idéales pour la conversion biochimique ou thermochimique aux produits souhaités ont fourni aux chercheurs une source considérablement élargi du potmatières premières tiels 4. Les méthodes d'analyse standard pour quantifier les traits chimiques d'une plante, tout en étant très utile pour les petites séries d'échantillons, sont inadaptés pour le dépistage rapide de centaines ou de milliers d'échantillons 5-7. Les procédés décrits ici HTP ont été développés pour évaluer rapidement et efficacement un grand nombre de variantes de la biomasse à des changements dans la paroi cellulaire récalcitrant à la dégradation thermochimique et / ou enzymatique.
Il est essentiel de comprendre que les essais de criblage HTP décrites ici n'a pas été conçu pour maximiser la conversion ou le rendement. L'objectif est de déterminer les différences relatives dans la résistance intrinsèque des échantillons de biomasse connexes. En conséquence, un grand nombre des étapes d'analyse diffèrent des essais de conversion de la biomasse «typiques», où l'objectif est d'obtenir des taux de conversion maximal ou étendue. Par exemple, sévérités prétraitement plus faibles et la réduction des temps d'hydrolyse enzymatique sont utilisés pour optimiser différerrences entre les échantillons. Dans la plupart des cas, des charges relativement élevées d'enzymes sont utilisés pour réduire des écarts dus à la variation expérimentale de l'activité de l'enzyme, ce qui pourrait fausser considérablement les résultats.
Des techniques rapides pour déterminer la composition des parois cellulaires végétales et les sucres monomères libérés suivante saccharification enzymatique comprend la robotique, personnalisés, des plaques à 96 puits thermochimique compatibles, et des modifications des méthodes de laboratoire standard 8-11 et protocoles instrumentales, telles que la spectroscopie de vibration (infrarouge (IR), dans le proche infrarouge (NIR), ou Raman) et la résonance magnétique nucléaire (RMN) de 12 à 17. Ces méthodologies sont essentiels pour isoler les matières premières à forte cellulose ou le contenu de lignine faible, ou ceux qui devraient donner le plus élevé de glucose, le xylose, l'éthanol, etc. Ces méthodes ont permis analyses à échelle réduite qui emploient de plus petites quantités de biomasse et de consommables, menant à des réductions dans experimental dépenses 18 9, le peuplier 8,10, la bagasse de canne 8, et le panic raide 8 ont été évaluées avec succès en utilisant ces méthodes de HTP.
Lignine totale et de la composition monomère lignine sont aussi communément quantifiés traits de la biomasse. Il a été démontré des réductions de la teneur en lignine pour augmenter la digestibilité enzymatique de polysaccharides 19,20. Le rôle que le rapport monomère lignine (souvent signalé comme syringyl / guaiacyle (S / G) contenu) joue dans la déconstruction de la paroi cellulaire de la plante est toujours sous enquête. Certains rapports ont indiqué que les réductions dans le S / Grapport a conduit à une augmentation des rendements de glucose après hydrolyse 21, tandis que d'autres études dévoilent la tendance inverse 19,22. Procédés à haut débit pour l'évaluation de la lignine et de ses monomères comprennent la spectroscopie vibrationnelle (IR, NIR, Raman et 23 à 26) couplée à une analyse multivariée, et la pyrolyse faisceau moléculaire par spectrométrie de masse (pyMBMS) 27,28.
Lors de l'élaboration des méthodes de HTP pour le criblage de la biomasse, plusieurs considérations intégrales doivent être gardés à l'esprit. Un aspect clé est la complexité de la méthode. Quel est le niveau de compétence requis pour la technique? Analyses chimiométriques, par exemple, exigent des compétences spécifiques pour la construction, l'évaluation et le maintien de modèles prédictifs. Les méthodes standard présentent étapes indésirables d'analyse préparatoire ou des données ou utilisent des réactifs toxiques. Développement des modèles est un processus continu où de nouvelles données sont incorporées dans le modèle au fil du temps pour augmenter la robustesse du modèle. Un autre considration est les économies et une diminution des temps d'analyse expérimentale des méthodes à haut débit proposées. Si la méthode est très rapide, mais très coûteux, il peut ne pas être réalisable pour une technique de nombreux laboratoires à adopter. Les méthodes illustrées dans ce manuscrit sont des variantes des techniques normalisées, modifiés pour amplifier les capacités de débit. Ces protocoles mesurer quantitativement les traits de la biomasse d'intérêt sans nécessiter le développement de modèles prédictifs. Ceci est un attribut essentiel de ces techniques, car les méthodes de prévision, tout en présentant de fortes corrélations avec la norme analyses utilisé pour développer les modèles, ne sont pas aussi précis que la mesure effectivement la quantité d'intérêt pour les échantillons. Considérant que les méthodes utilisées sont essentiellement versions réduites de méthodes analytiques banc échelle standard, exactitude et la précision sont négociés pour la vitesse et le débit. Surtout, ce résultat est dû à des erreurs élevé dans les petites pipetage de volume et de pesage; ainsi que l'augmentation deamplement hétérogénéité taille de l'échantillon est réduite. Alors que les grandes séries d'échantillons peuvent être examinés et comparés, un grand soin doit être exercé en faisant des comparaisons entre les campagnes distinctes et aux résultats l'échelle du laboratoire.
La plupart des étapes fastidieuses impliquent la manipulation physique de la biomasse. Échantillons de broyage peut prendre plusieurs minutes par échantillon, y compris le nettoyage de l'usine entre les échantillons. Le chargement manuel, le déchargement, et les trémies de nettoyage et de remplissage et de vidange des sachets de thé et les sacs d'échantillons est également très intensive en main. Bien que chaque étape peut prendre une minute ou plus, faisant des milliers d'échantillons peuvent prendre plusieurs heures, voire des jours. Les robots peuvent charger une plaque de réacteur typique avec la biomasse dans environ 3 à 4 heures ou 6 à 8 plaques jour -1 robot de -1. Cette situation est fonction des paramètres de précision utilisées ainsi que le type et la quantité de biomasse à tester. Plateaux de remplissage du réacteur avec de l'eau, de l'acide dilué, ou enzymatique est effectué rapidement à l'aide d'un robot de manipulation de liquides. Pretraitement d'un empilement de plaques (de 1 à 20 des plaques de réacteur) prend entre 1 et 3 heures lorsque l'assemblage, refroidir, et le démontage est inclus. L'hydrolyse enzymatique prend 3 jours et l'analyse du sucre nécessite environ 1 h de temps de préparation ainsi que 10 minutes par plaque de réacteur pour terminer le test et lire les résultats. Un horaire hebdomadaire de prétraitement et d'analyse fixées jours accueille un horaire de travail raisonnable, minimisant impair heures et le week-end des efforts pour la composante humaine de l'essai et permet un traitement ~ 800 à 1000 échantillons par semaine sur une base continue. Le débit maximum dépend de plusieurs facteurs, notamment la quantité de matériel (robots, réacteurs plaques, etc.) et combien de "logiciel" (ie, la dotation en personnel) sont disponibles pour faire le travail manuel. La limite supérieure pratique est 2500 à 3000 échantillons / semaine; cependant, que la production nécessite l'opération 7 jours par semaine et plusieurs stagiaires étudiants et techniciens. En comparaison, 3000 échantillons par HPLC exigeraient environ 125 jours de samanalyse ple plus la main-d'œuvre supplémentaire de peser manuellement des échantillons dans des réacteurs et des échantillons de filtrage avant l'analyse.
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Protocol
1. à haut débit détermination du glucose et du xylose rendements suivants enzymatique saccharification 9,29
- Préparation de l'échantillon (Grincement, De-amidonnage, Extraction, prétraitement)
- Broyer au moins 300 mg de chaque échantillon de la biomasse en utilisant un broyeur Wiley, de telle sorte que les particules passent à travers un tamis 20 format (850 um). Transfert à l'anti-statiques zip-top sacs (généralement un code-barres) et de l'information de l'échantillon d'enregistrement pour la base de données de codes à barres.
- Ajouter environ 250 mg ou plus de la biomasse du sol du sac anti-statique à une numérotée (avec un crayon, ne pas utiliser de l'encre ou un marqueur) sachet de thé, soigneusement retrousser les sachets de thé, en étant sûr de plier les extrémités sur la biomasse pour empêcher perte au cours de-amidonnage et de l'extraction.
- Enveloppez le sachet fermé à l'aide de fil de cuivre étamé. Notez le numéro de sachet de thé pour chaque échantillon à code-barres.
- Préparer la solution de-amidonnage enzyme parmi les enzymes commerciales (typiquement, 0,25% (v / v) de la glucoamylase (~ 1 600 AGU / L) et1,5% (v / v) d'alpha-amylase (~ 2,900 KNU-S / L) dans 0,1 M d'acétate de sodium (pH 5,0)). Préparer 16 ml par g de biomasse en vrac ou 500 ml par 120 échantillons de sachets de thé. Note: Les chargements capables d'éliminer l'amidon à partir de biomasse au sol doivent être déterminées empiriquement en testant pour l'amidon après digestion avec une gamme de charges d'enzymes et des ratios.
- Dans un récipient en plastique, ajouter 16 ml de solution d'enzyme de-amidonnage pour 1 g de biomasse en vrac du sol. Pour un protocole de-amidonnage lot, ajouter 120 sachets à 500 ml de la solution tampon enzyme.
- Incuber dans un agitateur à 55 ° C pendant 24 (± 4) heures, à 120 rpm pour éliminer l'amidon possible.
- Après l'amidonnage de-incubation, rincer et laisser tremper la biomasse dans plusieurs litres d'eau déminéralisée pendant 30 min. Répétez ce processus deux fois de plus pour éliminer les sels de tampons qui peuvent causer de supplantation (formation de bulles de gaz dans la solution qui peut se traduire par une hausse soudaine et violente dans le niveau de la solution, ce qui provoque l'éthanol liquide chaud à cascadehors du récipient réactionnel) lors de l'extraction.
- Après le rinçage exhaustive de la biomasse de-amidonné, placer les sachets de thé dans la colonne Soxhlet pour l'extraction. Aucune cosse est nécessaire pour cette étape.
- Mettre en place le reflux Soxhlet, en utilisant 95% d'éthanol et d'extraire les échantillons pendant 24 heures.
- Retirez les sachets de thé du réacteur Soxhlet et d'étaler en une seule couche sur un plateau.
- Laisser les échantillons sécher toute la nuit à la température ambiante dans une hotte.
- Dérouler les sachets de thé et de retourner la biomasse sèche pour les sacs antistatiques code-barres originaux.
Remarque: Les sacs antistatiques sont efficaces pour réduire l'électricité statique dans la biomasse, améliorer les caractéristiques de manipulation. Si d'autres options de stockage sont utilisés, de la biomasse supplémentaire peut être nécessaire en raison de la biomasse attachement au côté du récipient de stockage. - Transférer au moins 50 mg de la biomasse sèche à une trémie à code-barres (en utilisant plus de matériel est mieux pour la distribution précise). Speuvent codes à barres de sacs anti-statique et la trémie de réception pour assurer le suivi des échantillons précis.
- Charger les trémies sur des solides pesant robot, en accordant une attention à l'ordre des échantillons dans les racks. Chargez suffisamment de plaques de réacteur pour contenir tous les échantillons et sélectionnez le protocole de distribution basé sur le nombre de plaques utilisées.
- Robotisé peser 5 mg des échantillons séchés (± 0,3 mg) en acier inoxydable de plaques à 96 puits résistant à l'acide. Peser 3 répétitions de chaque échantillon distribué autour de la plaque afin de minimiser les variations localisées.
- Inclure les 8 échantillons de contrôle de la biomasse d'un matériau standard biomasse bien caractérisé afin de suivre les performances du test. Pour plusieurs plaques, l'utilisation de plusieurs trémies de biomasse norme minimiser la dérive de taille de particules provoquée par tamisage dans les trémies sur des cycles répétés de distribution.
Remarque: Dans chaque assiette, il devrait y avoir 24 échantillons avec 3 répétitions, 4 blancs constituées d'eau déminéralisée et de l'enzyme, et 8 controls, en utilisant la biomasse norme précédemment caractérisé. Les 3 puits d'angle de chacun des 4 coins de la plaque sont réservés aux normes de sucre. - Vérifiez puits standard blanc et sucre pour les particules de biomasse errants et enlever le cas échéant.
- Ajouter 250 pi d'eau déminéralisée à chaque puits, et sceller les plaques avec polytétrafluoroéthylène adhésif silicone à des créances (PTFE).
- L'utilisation d'un "tip 1/8 de fer à souder, percer le ruban PTFE à chaque port de vapeur (117 au total) pour chaque plaque. Utilisez une assiette vide empilés sur scellée plaque de réacteur comme un guide et de restreindre PTFE mouvement de film.
- Fixer les plaques étroitement avec 0.031 joints "d'épaisseur de verre renforcé de PTFE (pré-perforées avec des trous pour les ports de vapeur) entre les plaques et les assiettes vides en haut et en bas de la pile. Prétraiter les échantillons en utilisant un réacteur à vapeur réglée à 180 ° C pendant 17,5 min, ou d'autres combinaisons de température / temps selon la gravité souhaitée.
- Plaques de réacteur Refroidir à 50 °; C par les inondations avec de l'eau déminéralisée.
- Saccharification enzymatique
- Préparer une solution de saccharification enzymatique constitué de 8% (v / v) de solution d'enzyme dans 1,0 M de citrate de sodium, pH 5,0. Préparer 5 ml par plaque de réacteur. Remarque: dilution nécessaire doit être déterminé sur la base de l'activité et de la teneur en protéines de la solution spécifique stock enzyme.
- Lorsque les plaques sont cool, centrifuger dans un seau rotor oscillant à 1500 g pendant 20 min. Retirez le film d'étanchéité. Note: Ces plaques sont lourds et les spécifications de centrifugeuses doivent être vérifiés pour la compatibilité.
- Ajouter 40 ul de la solution enzymatique du stock de 8% à chaque puits (70 mg d'enzyme par g de biomasse).
- Refermer avec le nouveau ruban PTFE. Placez la plaque scellée dans plaque magnétique pince.
- Mélanger délicatement les échantillons par inversion (au moins 15 fois), et incuber à 50 ° C pendant 70 heures.
- Lorsque la saccharification a conclu, mélanger par inversion et centrifuger les plaques à 1500 xg pendant 20 min.
- Composition de sucre
- Préparer un ensemble de six glucose et xylose combiné standards d'étalonnage dans un tampon 0,014 M de citrate (pH 5,0) allant de 0 à 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65, et 0,75 mg / ml recommandé) et de 0 à 0,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 et 0,6 mg / ml recommandé) pour le glucose et le xylose, respectivement.
- Préparer la glucose oxydase / peroxydase (goPod) et le xylose déshydrogénase (XDH) réactifs selon les instructions dans le kit.
- En utilisant une pipette, retirer 200 ul de liquide à partir des 4 puits et les puits de coin de bord adjacentes aux puits de coin (12 puits au total) de la plaque de réacteur.
- En utilisant une pipette, distribuer 180 pi d'eau déminéralisée à chaque puits d'un fond plat plaque de dilution de polystyrène de 96 puits. Ne pas ajouter de l'eau à la norme et coin puits 12 de sucre (supprimer ces conseils si vous utilisez une tête à 96 canaux).
- En utilisant une pipette, distribuer 180 ul réactif goPod à chaque puits du dosage du glucose plmangé.
- En utilisant une pipette, distribuer 180 ul réactif XDH à chaque puits de la plaque d'essai de xylose.
- En utilisant une pipette, transférer 20 ul aliquotes hydrolysat de la plaque de réacteur de 96 puits à la plaque de dilution. Pipeter de la partie supérieure du puits à éviter matières solides de biomasse résiduelle et le liquide dans les puits d'angle. Mélanger par trituration pendant au moins 10 cycles.
- En utilisant une pipette, transférer 110 pi de normes de sucre, en double exemplaire, dans les puits d'angle de la plaque de dilution.
- En utilisant une pipette, transférer 20 ul de parties aliquotes de la plaque de dilution de glucose et xylose les plaques d'essai. Mélanger par trituration.
- Incuber les dosages de glucose et de xylose plaques à température ambiante pendant 30 min. Cassez délicatement les bulles de surface avant de lire. Un pistolet thermique brièvement passé au-dessus de la surface de la plaque fonctionne bien.
- L'utilisation d'un 96 puits lecteur de plaque ultraviolet / visible, régler la longueur d'onde mesurée à 510 nm et enregistrer l'absorbance contre un blanc de réactif.Cette mesure surveille la formation de la quinone-imine, qui est proportionnelle à la concentration en glucose. La concentration en glucose est calculée à partir de la courbe d'étalonnage sur la base des standards d'étalonnage préparées dans 1.3.1.
- L'utilisation d'un 96 puits lecteur de plaque ultraviolet / visible, régler la longueur d'onde mesurée à 340 nm et enregistrer l'absorbance. Cette mesure surveille la réduction de NAD + en NADH, qui est proportionnelle à la concentration en xylose. La concentration en xylose est calculée à partir de la courbe d'étalonnage sur la base des standards d'étalonnage préparées dans 1.3.1.
2. à haut débit Détermination du total de lignine et de la lignine contenu monomère Utilisation pyMBMS 28
- La préparation des échantillons
- Broyer et extraire la biomasse en utilisant les méthodes décrites dans les étapes 1.1.1 et 1.1.6-1.1.8. Cela comprend le broyage et l'extraction d'un ensemble de normes à utiliser des contrôles expérimentaux.
Remarque: Le mesur pyMBMSements ne dépendent pas de la taille des particules, de sorte que si à l'aide du protocole de pyMBMS, la préparation de la biomasse doit être effectuée pour permettre à l'échantillon pour tenir dans le porte-échantillon, <4 mm. - En utilisant une petite spatule de distribution d'environ 4 mg (5 mg à trois de préférence) de la biomasse disposé dans une coupelle en acier inoxydable de 80 ul conçu pour l'auto-échantillonneur.
- Veiller à ce que au moins 10% des échantillons analysés sont en cours de normes de contrôle tels que ceux disponibles auprès de l'Institut National des Standards et de la Technologie (bagasse-8491; peuplier-8492; pin-8493, ou la paille de blé-8494). La norme peut également être toute espèce analogues aux échantillons à analyser qui ont déjà été caractérisés en utilisant des procédés standard.
- Charger au hasard les échantillons dans les tasses échantillonneur automatique en utilisant une pince à épiler pour éviter les biais en raison de la dérive possible du spectromètre au fil du temps. Remarque: Une randomisation typique des échantillons comprendrait la mesure de tous les échantillons une fois, suivie d'une re-randomisationde l'ordre des échantillons de mesure double. Programmes de randomisation sont disponibles en ligne.
- En utilisant un poinçon standard, produire manuellement des disques de filtre de verre à partir de type feuilles de fibre de verre A / D, sans liant. Tenez le filtre en fibre de verre ronde avec des pincettes, centrer sur la coupelle d'échantillon, et pousser dans l'échantillon à l'aide d'une clé Allen de 3,5 mm pour confiner la matière dans chaque tasse pendant l'expérience.
- Broyer et extraire la biomasse en utilisant les méthodes décrites dans les étapes 1.1.1 et 1.1.6-1.1.8. Cela comprend le broyage et l'extraction d'un ensemble de normes à utiliser des contrôles expérimentaux.
- Protocole Instrumental
- Étalonner le spectromètre de masse en utilisant une norme connue qui a des intensités de pointe sur toute la gamme de composés qui peuvent exister pour les échantillons expérimentaux. Pour les échantillons de biomasse typiques, utiliser perfluorotributylamine (PFTBA).
- Régler le taux de débit de gaz porteur d'hélium à 0,9 L / min à l'aide d'un débitmètre de gaz.
- Régler le four auto-échantillonneur à une température de pyrolyse de 500 ° C et la température de l'interface de 350 ° C à l'aide du logiciel d'auto-échantillonneur. Remarque: Un "acier inoxydable 1/8 chaufféligne de transfert enveloppé dans la bande de chaleur qui relie l'échantillonneur automatique pour le spectromètre de masse est contrôlé à l'aide d'un contrôleur de la chaleur à 250 ° C.
- Commencez acquisition de données sur le spectromètre de masse et attendre au moins 60 secondes pour obtenir suffisamment de données pour la collecte des spectres de fond.
- Commencez la méthode d'auto-échantillonneur automatique avec les spécifications de 2.2.2. Remarque: L'échantillonneur automatique tombe chaque échantillon individuellement dans le four échantillonneur automatique. Le temps d'acquisition de données totale est d'environ 1,5 min; Toutefois, la pyrolyse d'un échantillon typique de 4 mg est complète après 30 sec.
- Le contenu de la fiche ionique total (TIC) de chaque échantillon en utilisant un logiciel de spectromètre de masse à 0,5 sec vitesse de balayage. Intensités de record entre m / z 30 à 450.
Remarque: composés de la biomasse typiques utilisent ionisation douce à 17 eV. L'instrument peut enregistrer des intervalles plus grands de m / z 1 à 1000; Cependant, la vitesse de balayage sera limitée par la puissance du processeur. - Retirer fond à partir des spectres en utilisant le MAnuel améliorer fonctionnalité du logiciel. Note: Une portion de 60 balayage de la ligne de base au début de la collecte de données est utilisé pour calculer une valeur de fond moyen. Ce spectre d'arrière-plan moyenne est éliminée à partir des spectres de l'échantillon expérimental automatiquement dans le logiciel du spectromètre de masse.
- Importer le fichier de texte de la colonne unique créé par le logiciel de spectromètre de masse contenant les données spectrales pour chaque échantillon, dans un programme de base de données et de combiner tous les échantillons en une seule base de données. Ajouter les métadonnées applicable à la feuille de calcul. Importez les données formatées (feuille de calcul de fichiers / CSV) dans un logiciel de statistique et de signifier à normaliser les spectres pour tenir compte de la variation dans les masses d'échantillons pyrolysées.
- Utilisez un logiciel de statistique d'effectuer une analyse en composantes principales (ACP) en utilisant les données spectrales pour analyser regroupement des échantillons standards répliquées utilisées dans les mesures, ainsi que d'évaluer quels sommets font partie intégrante de la classification des produits chimiquescomposés dans les chargements complotent 28.
Remarque: les groupes PCA les échantillons en fonction de la similitude de leurs spectres, et permet un contrôle des normes de mesurer l'erreur expérimentale en raison de la dérive de l'instrument pendant la course. - Pour calculer le syringyl de lignine (S) / guaiacyle (G) le rapport, la somme des aires des pics de S (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, et 210) et diviser par la somme de G pics à 124, 137, 138, 150, 164, et 178.
- Pour le calcul de la teneur en lignine au total, la somme des pics de lignine avec m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, et 210.
- Calculer un facteur de correction pour la mesure de mise à l'échelle pyMBMS une méthode standard pour estimer la lignine totale, comme Klason lignine. Diviser la valeur de la lignine Klason de la norme individuelle par la teneur totale en lignine mesurée pour l'échantillon standard en utilisant pyMBMS.
- Appliquer ce facteur de correction à tous comme-espèces dans l'ensemble de données. Répétez l'opération pour chaque type de biomasse analysé. Note: Le facteur de correction peut varier considérablement en fonction de la S / G de la biomasse analysé.
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Representative Results
L'effet combiné de la pré-traitement thermochimique et la saccharification enzymatique ultérieure est mesurée en fonction de la masse de glucose et xylose libérée à la fin de l'essai. Les résultats sont rapportés en termes de milligrammes de glucose et xylose libérés par gramme de biomasse. Ceci est en contraste frappant avec les données déclarées à partir d'essais banc échelle, qui est généralement déclarés comme pour cent de rendement théorique basée sur l'analyse de la composition de la matière de départ. Comme il est pas encore pratique pour effectuer des analyses de composition sur des milliers d'échantillons par semaine, les données sont mieux signalé que les niveaux de conversion sur une base de masse. Cela permet l'évaluation de l'échantillon raisonnable tant que les comparaisons sont effectuées entre les échantillons étroitement apparentées de la biomasse et la composition des échantillons ne varie pas trop.
L'objectif principal de l'essai est d'évaluer les différences relatives à la résistance de la paroi cellulaire végétale à combinée thermochimique / Enzymsaccharification ATIC toute une gamme de variantes individuelles. Il est à noter que le dosage ne cherche pas à optimiser une quelconque des conditions utilisées pour la saccharification. En fait, les conditions de gravité de prétraitement sont nettement sous-optimale afin d'élargir la gamme de sensibilité de l'essai, en ciblant un rendement de conversion finale de 50% à 70% de la théorie. Conditions de prétraitement ou à proximité optimale pousserait tous les échantillons à haute conversion, grandement réduire la gamme dynamique de l'essai. A l'inverse, le chargement de l'enzyme est beaucoup plus grande que celle typiquement rapportés pour les digestions l'échelle du laboratoire. Encore une fois, le but du procédé est de ne pas trouver le meilleur enzyme ou minimiser le coût de l'enzyme, mais de mesurer la réticence intrinsèque des parois cellulaires à l'aide de charges et de conversion très élevés de l'enzyme enlève la variabilité de l'essai.
Enfin, il est important de comprendre que la variabilité dans le dosage global est nettement supérieur à celui rapporté pour benctravaux h échelle. Les erreurs types typiques sont environ 8%, bien que la gamme est beaucoup plus large. Cela est tout simplement la nature de petite échelle, la recherche de HTP. Pipetage et les erreurs de pesage sont proportionnellement plus élevé à l'échelle pl et mg, comme le sont les pertes par évaporation et de condensation. Biomasse hétérogénéité devient une très large variable lorsque le dosage de plusieurs ordres de grandeur moins de particules dans chaque échantillon, à savoir, 5 mg vs multiple g. Les essais colorimétriques utilisés pour déterminer le glucose et le xylose bonne corrélation avec les résultats de la HPLC; Toutefois, alors que des dosages enzymatiques pour l'analyse du sucre sont rapides et peuvent être effectuées en parallèle, elles ne sont pas aussi précise que les méthodes analytiques telles que la CLHP, l'introduction d'une autre couche d'imprécision (figure 1).
En raison de toutes les considérations qui précèdent, les résultats ne devraient être interprétées et rapportées dans certaines limites. Les données doivent être examinées dans des ensembles complets, non pas comme des échantillons individuels. Répétitions sont nécessaires pour meaningful résultats. Tendances et aberrantes sont significatives, mais les résultats ne sont pas simples. Des comparaisons sont faites dans les meilleurs ensembles expérimentaux simples. Les comparaisons entre les campagnes temporellement ou spatialement séparés exigent des contrôles extrêmement serrés et un examen minutieux pour être significatif. Données d'HTP est pas directement comparables aux benchmarks ou d'autres données à l'échelle. Tendances piste entre l'HTP et d'autres échelles, mais les comparaisons d'échantillons directs ne donnent pas des résultats identiques.
Représentation des données tombe généralement sur les tendances, les valeurs aberrantes, ou sous-population / variantes comparaisons. Un exemple de tendances est une enquête auprès des récalcitrants de 755 variants naturels de peuplier échantillonnées sur une large gamme dans le Pacifique Nord-Ouest des États-Unis 19. La réticence de ces échantillons a été tracée en fonction de leur teneur en lignine et syringyl / guaiacyle rapport tel que déterminé par pyMBMS. Les résultats indiquent que S / G augmente, récalcitrant diminue jusqu'à un rapport S / G de l'ordre de 2, où le impr de réticenceniveaux OUVEMENT off (figure 2). Les valeurs aberrantes peut être clairement vu dans la figure 3, où le gène Pt4CL1 a été régulée à la baisse dans le peuplier. Plusieurs centaines de cultivars ont été examinés et plusieurs sont clairement augmenté en récalcitrant, comme en témoigne la libération de sucre a diminué. La figure 4 montre une étude dans laquelle plusieurs différentes variétés de blé paille ont été cultivées sur plusieurs sites sur deux ans et la récolte après plusieurs variations dans les conditions de croissance , résultant en 20 populations distinctes basées sur des combinaisons de ces variables. Ces ensembles d'échantillons sont facilement distingués et indiquent les variables positives et négatives pour récalcitrant. Figure 5 montre comment pyMBMS peuvent être utilisés pour évaluer les changements dans la composition de la paroi cellulaire. Masse fragments spectrales sont affectées aux différents monomères de la lignine (tableau 1). Lorsque l'on compare un échantillon à haute lignine vs. haute teneur en glucides, les disparités dans les données spectrales sont apparents. Til utilise des données pyMBMS couplés avec une analyse en composantes principales (ACP) est illustrée à la figure 6. Dans cet exemple, les échantillons sont classés selon basse ou haute fertilisation azotée. Lignine et le contenu en glucides aligner inversement long PC1. L'utilisation du poids des composantes principale intrigue peut aider à identifier les traits chimiques sont expliquées dans le complot scores de classification, ainsi que l'élucidation traits qui changent entre les grappes de l'échantillon.
Figure 1: Comparaison de glucose et le xylose quantification utilisant à haut débit essais colorimétriques vs 9 HPLC. Comparaison de la détection du glucose et du xylose a été réalisée en utilisant le xylose déshydrogénase (XDH, panneau supérieur) et la glucose oxydase / peroxydase (goPod, panneau inférieur) à haut débit colorimétriques dosages enzyme-linked et de haute performance LChromatographie iquid.
Figure 2: réticence des parois cellulaires de peuplier en fonction de syringyl à guaiacyle (S / G) contenu dans la lignine 9 Augmentation de la réticence des parois cellulaires de peuplier en fonction de syringyl à guaiacyle (S / G) contenu dans la fraction de lignine a. été observés et rapportés. 755 échantillons de carottes de peupliers de la même cultivar de peuplier ont été prises sur plusieurs centaines de miles de la forêt dans l'American Pacific Northwest Nord et projetés pour le glucose et le xylose de presse après traitement thermochimique préalable et de l'enzyme de saccharification. Les résultats ont été représentés graphiquement en fonction du rapport S / G dans la lignine de la paroi cellulaire, comme déterminé par pyMBMS. Récalcitrante diminue avec l'augmentation S / G jusqu'à environ 2, où il reste constant au plus haut S / G. Les valeurs de rendement théoriques sont basés sur le BESC "standard" et le peuplier sont fournis comme un référenCE aux fins de comparaison.
Figure 3:. Récalcitrant dans régulé à la baisse Pt4CL1 expression dans peuplier Down-régulation du gène Pt4CL1 peuplier a abouti à peu de variation dans la paroi cellulaire récalcitrant entre les clones, mais plusieurs variantes de réticence considérablement accrues sont facilement identifiés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 4: récalcitrant dans diverses populations Wheatstraw Les effets du type de cultivar, du site de la culture, l'application d'engrais, et le résultat de taux d'arrosage dans les niveaux de réticence clairement distinctes.. Différents symboles représentent différent conditions expérimentales de croissance. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Application de pyMBMS pour l'analyse des changements chimiques dans les parois cellulaires des plantes 28 Les pics désignés par des flèches sont des fragments de lignine, et ont été utilisés pour évaluer (a) haute lignine (b) lignine moyenne ou (c) à faible teneur en lignine.
Figure 6:. Composante principale scores d'analyse parcelle de différences dans la composition chimique de la paroi cellulaire des arbres peuplés cultivés avec des taux de fertilisation supérieures et inférieures 28 (Haut) analyse en composantes principalespartitions tracé illustrant une classification distincte, et par conséquent, les différences dans la composition chimique de la paroi cellulaire des arbres cultivés peuplées avec des taux de fécondation supérieures et inférieures. Composante principale 1 partagé les échantillons en fonction de la lignine plus élevée (négative) ou plus élevés en glucides (positifs). (En bas) Les principales charges de composants élucider les composants chimiques changent entre les deux groupes d'échantillons dans le complot des scores. Les charges positives sont en corrélation avec les scores positifs, qui sont représentatifs des teneurs plus élevées en hydrates de carbone, tandis que les chargements négativement corrélés rallient à des scores négatifs et, par conséquent, une plus forte teneur en lignine.
| m / z | Cession moléculaire 30 | S / G / H cession |
| 94 | phénol | S / G / H |
| 120 | Vinylphénol | H |
| 124 | Guaiacol | g |
| 137 | Ethylguaiacol, homovanillin, coniféryle | g |
| 138 | Methylguaiacol | g |
| 150 | Vinylguaiacol | g |
| 154 | Syringol | S |
| 164 | Allyle + propényle guaïacol | g |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | S |
| 168 | 4-méthyl-2,6-diméthoxyphénol | S |
| 178 | Aldéhyde coniférylique | g |
| 180 | L'alcool coniférylique, syringylethene | S, G |
| 182 | Syringaldéhyde | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
Tableau 1:. Haute m / z et les affectations de fragments de pyrolyse dérivés de la lignine telle que détectée par spectrométrie de masse Liste des composés typiques détectées par pyMBMS. Missions moléculaire basée sur Evans, RJ et TA Milne (1987). La caractérisation moléculaire de la pyrolyse de la biomasse énergie et de combustibles 1 (2):. 123-137.
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Discussion
Les principales étapes de préparation d'échantillons pour obtenir des données précises et reproductibles lors de la conduite des expériences de criblage à haut débit sont les suivantes:
Sucre Essai de libération:
En général, les échantillons sont préparés en lots allant de quelques dizaines à plusieurs milliers à la fois. Chaque étape majeure est typiquement effectuée pour tous les échantillons avant de se déplacer vers l'avant afin de minimiser les variations entre les échantillons en cours de préparation. De-amidonnage était pas initialement partie du protocole et peut être omis dans certains cas. Des échantillons de carottes bois et des matériaux herbacées sénescentes sont toujours faibles en amidon et, par conséquent, ne nécessite pas de dé-amidonnage pour réduire la variabilité. L'amidon est une préoccupation majeure; Toutefois, dans des ensembles d'échantillons de plantes de tissu vert, en particulier pour les grands ensembles d'échantillons où la récolte se poursuit pendant plusieurs heures. Comme les niveaux d'amidon augmentent pendant les heures de clarté et sont épuisés dans l'obscurité, les niveaux d'amidon peuvent varier considérablement au fil slusieurs h et de glucose à partir d'amidon est indiscernable de glucose à partir de la cellulose, par conséquent, les niveaux élevés d'amidon peuvent conduire à des mesures de réticence distortedly faibles. Le chargement de l'enzyme réelle dans l'étape de destarching est moins préoccupante, tant qu'il y est une activité suffisante pour éliminer l'excès d'amidon tout accessible dans le laps de temps de l'étape d'hydrolyse de l'amidon. Variations dans les enzymes spécifiques utilisées, le temps, la température, la vitesse de l'étape d'amidon de suppression de volume, et l'agitation peuvent certainement conduire à des différences dans les niveaux et les taux d'élimination de l'amidon et doivent être déterminées empiriquement lorsque cela est possible. Enfin, lorsque l'emballage des sachets de thé pour l'extraction, utiliser du fil de cuivre étamé. Fil de cuivre nu peut provoquer des réactions chimiques indésirables avec la solution enzymatique, donnant des valeurs de sucre faux. Cuivre étamé résolu ce problème en fil d'acier inoxydable n'a pas été suffisamment malléable pour garder les sachets hermétiquement fermé.
Conformément réduction de taille de la biomasse est essentielle pour accudonnées sur les taux pour deux raisons: 1) finement broyé biomasse, tandis distribué plus facilement et de manière cohérente, est également plus facile à digérer que les matériaux plus grossiers. 2) La biomasse qui est trop grossier peut boucher les trémies, résultant en matériau insuffisant ou, si le sabot est seulement bloque partiellement l'ouverture, il peut agir comme un tamis et permettre seulement à travers de fines particules, ce qui diminue la réticence de l'échantillon observé. Si trop peu de biomasse est contenue dans les trémies, il peut enrober les côtés de la trémie, amener le robot à assumer la trémie est vide et l'échantillon sera ignoré dans le processus de distribution. En outre, de faibles niveaux de biomasse peuvent contribuer à échantillon exagérée hétérogénéité, en particulier sous forme de particules denses (tels que la couenne) ont tendance à tamis au fond du cône et de se distribuer en premier. Lorsque moins de 50 mg de matériau est disponible, l'analyse peut toujours être effectuée; Cependant, les échantillons devraient être pesé à la main. Cependant, les résultats de la main-pesage sont plus variables que ceux de Robpesant otique.
Le montant réel de la biomasse nécessaire pour les étapes préparatoires ne sont pas bien définis. Nous avons suggéré de 250 mg comme un point de départ raisonnable, cependant, chaque échantillon de la biomasse présente des caractéristiques différentes en ce qui concerne les pertes dues à la manipulation, le broyage et l'extraction ainsi que d'être tenue dans les trémies ou en cours de distribution reproductible. L'hétérogénéité de la biomasse dans tous les types et même au sein du même type empêche un protocole plus défini. Ceux qui souhaitent mettre en œuvre ces méthodes de dosage aurez simplement besoin de déterminer bon nombre de ces variables pour eux-mêmes, bien que l'expérience ne le rendre plus facile.
Une autre étape qui peut introduire des erreurs est le mélange dans des plaques de microtitrage, qui est notoirement difficile et est essentiel dans ces essais pour plusieurs raisons. La solution d'enzyme utilisée est concentré et peut être stratifiée lors de l'addition dans les puits, ce qui limite l'accessibilité de l'enzyme de la biomasse. Comme saccharification produit, SUGars libéré peut également stratifier et de se concentrer près de la biomasse et selon la profondeur d'échantillonnage, tests de sucre peuvent être artificiellement élevé ou faible. Voilà pourquoi il est vital de mélanger les échantillons après addition enzyme et l'enzyme saccharification, permettant un mélange intime des enzymes avec la biomasse, même pour une saccharification et une répartition uniforme des sucres obtenus pour permettre une analyse cohérente de sucre. Dans des plaques ne contenant pas de biomasse, telles que des plaques de dilution ou de dosage, de mélange par pipetage répété (de trituration) a prouvé être bien supérieure à celle agitation. Cependant, comme solutions à ce protocole ont des densités variables et les niveaux de particules, la vitesse de pipetage et le placement vertical de la pointe dans la colonne de liquide est critique. Si la vitesse est trop rapide, mauvaise précision grâce à la cavitation (aspiration) et la rétention de liquide dans la pointe (de distribution) peut se produire. Si la pointe est trop profonde dans le puits, la biomasse peut obstruer la pointe ou de la pointe peut être pressé vers le bas, ce qui empêche l'aspiration précise, et ilest plus de surface extérieure de liquide à accrocher et le report à l'étape suivante. Ce dernier problème peut être quelque peu atténuée par le contrôle de la vitesse de retrait de pointe, comme l'élimination plus lente de pointe permet au liquide d'être retiré de la solution en vrac par la tension de surface. Si pointe retrait est trop lent, liquide pipette peut se glisser de nouveau dans la solution en vrac ainsi. Particules de biomasse ont également tendance à accrocher aux conseils et passent à la plaque de dilution, où ils peuvent obstruer la pointe pendant le mélange ou le transfert des plaques d'essai, la création d'inexactitudes dans des volumes d'échantillon analysé. Ces particules peuvent également interférer avec l'analyse spectroscopique des plaques d'essai si elles occlusion du faisceau lumineux au cours de la lecture.
Conformément synchronisation de développement de la couleur est critique pour goPod et des dosages de XDH. Le développement de la couleur doit être autorisé à aller à son terme; cependant, la couleur de dosage goPod tend à continuer à augmenter après l'achèvement et de la NADH généré par le dosage de XDH lentementdiminue en raison de l'oxydation spontanée du NADH. En conséquence, la variabilité temporelle peut conduire à des comparaisons entre les données incohérentes des plaques séparées. Les étapes de l'analyse doivent être surveillés attentivement, comme les arrêts dus à des problèmes matériels ou logiciels peuvent entraîner de grandes différences dans les temps d'analyse. L'utilisation de normes et standards de sucre puits de contrôle de la biomasse dans chaque plaque peut aider à atténuer dans une certaine mesure.
PyMBMS:
Les normes doivent être soigneusement pris en considération pour pyMBMS expériences pour la comparaison avec les méthodes chimiques par voie humide standard. En raison de la composition de la lignine différentes (S / G ratios) des espèces de la biomasse, le facteur de correction doit être déterminée en utilisant un niveau qui est représentatif de la même espèce que l'échantillon expérimental. Si il n'y a pas de norme approprié disponible, les différences de concentration de lignine peuvent être comparées en utilisant les intensités des précurseurs de lignine directement. Des taux élevés de S / G (plus de ~ 3.5) peuvent conduire à une surestimation de lcontenu ignin par pyMBMS. Cela est dû à la tendance de la lignine à S préférentiellement libérée dans les conditions standard utilisées dans ce procédé. En outre, la quantité d'échantillon nécessaire pour pyMBMS mesures dépend du type de la biomasse utilisée. Lignine et de modèles de la lignine composés isolés nécessitent moins de matériel (0,1 mg), que l'utilisation de plus grandes aliquotes de l'échantillon peut saturer le détecteur.
Une autre étape cruciale dans le processus PyMBMS est une configuration soigneuse de l'instrument à une norme connue comme perfluorotributylamine (PFTBA) avant chaque expérience. PFTBA contient pics moléculaires dans tout le spectre de la biomasse typique et, par conséquent, permet un réglage de l'instrument uniforme entre essais expérimentaux. La région centrale de la spectres PFTBA est réglé de telle sorte que m / z 131 et m / z 219 sont environ 50% de l'intensité de m / z 69. Ce réglage est utilisée pour souligner les pics typiques vus sous ionisation douce (17 eV) utilisé pour réduire au minimum la fragmentation des ions de masses plus faibles que c Annot être facilement identifié.
Il convient de noter que ces méthodes ne sont pas des méthodes d'analyse pour la quantification exacte des analytes d'intérêt. Au contraire, ces techniques à haut débit pour le criblage sont de grande biomasse fixe afin d'identifier ceux qui possèdent des caractéristiques chimiques souhaitées. Ces méthodes ne devraient être utilisés pour le dépistage, le classement, et la corrélation des échantillons dans un ensemble de données. Les ensembles de données ne peuvent pas être directement comparés lors de la collecte sur plusieurs jours en raison de sources de variation tels que la dérive instrumentale, les changements dans l'activité enzymatique, ambient teneur en humidité de la biomasse en raison de changements dans l'humidité, les fluctuations de température, et les différences de conseils et beaucoup de plaques d'absorbance . En outre, le pré-traitement utilisé dans le protocole de préparation des échantillons est pas une stratégie de prétraitement optimisé, mais a été spécialement conçu pour être sous-optimale. Ceci permet de subtiles différences entre les plantes à plus efficacement élucidés.
jove_content "> Le principal avantage de l'adoption de méthodes à haut débit est que beaucoup plus d'échantillons peuvent être mesurés de la même période de 18 ans. Par exemple, une méthode commune pour analyser les hydrates de carbone produites lors d'une saccharification acide ou enzymatique est l'utilisation de la haute performance chromatographie liquide (HPLC). Selig et al., état que l'omniprésent hydrolyse acide en deux étapes, bien que très utile et primordiale pour la quantification des hydrates de carbone structurels, limite les chercheurs d'être en mesure d'évaluer à environ 25 échantillons par semaine 9. Bien que l'analyse appareillage utilisé dans les méthodologies à haut débit ne peut pas fournir la sensibilité d'une technique standard comme HPLC, l'analyse rapide permet aux chercheurs le luxe d'être en mesure d'évaluer de grandes quantités d'échantillons. En outre, les méthodes à haut débit ont souvent downscaled protocoles expérimentaux, réduction de l'utilisation des consommables, et par conséquent, la diminution des coûts expérimentaux et des déchets.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
- Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , Earthscan. 53-80 (2009).
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
- Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).
