Introduction
Mentre l'offerta mondiale di combustibili non rinnovabili e loro prodotti associati declino, gli scienziati sono stati messi in discussione per creare carburanti e sostanze chimiche simili da fonti di origine vegetale 1. Un aspetto chiave di questo lavoro è determinare quali specie di piante possono essere adatti per la produzione di biocarburanti e biomateriali 2,3. Tipicamente, queste materie prime vengono valutati per la lignina, cellulosa, emicellulosa e contenuti; nonché la loro suscettibilità alla destrutturazione (recalcitrance) attraverso pretrattamento termico, meccanico e / o chimico con o senza successiva saccarificazione enzimatica. Analisi più dettagliate sono utilizzati per determinare la composizione specifica della lignina ed emicellulosa frazioni nonché attività ottimali enzima necessario. Modificazioni transgeniche di piante che non possiedono intrinsecamente caratteristiche ideali per la conversione biochimica o termochimica di merci desiderati hanno fornito ai ricercatori una fonte notevolmente ampliato di pentolaprefe- materie prime 4. I metodi di analisi standard per quantificare le caratteristiche chimiche di un impianto, mentre molto utile per piccole serie di campioni, sono inadatti per lo screening rapido di centinaia o migliaia di campioni 5-7. I metodi qui descritti HTP sono stati sviluppati per valutare rapidamente ed efficacemente un gran numero di varianti di biomassa per i cambiamenti nella parete cellulare recalcitrance al degrado termochimico e / o enzimatico.
E 'fondamentale capire che i test di screening HTP qui descritti non sono state progettate per massimizzare la conversione o la resa. L'obiettivo è quello di determinare differenze relative recalcitrance intrinseca dei campioni relativa alla biomassa. Come risultato, molte delle fasi di analisi differiscono dai saggi "tipici" di conversione di biomassa, in cui l'obiettivo è di ottenere massima velocità di conversione o portata. Ad esempio, inferiori gravità pretrattamento e tempi di idrolisi enzimatica più brevi sono usati per massimizzare differirerenze tra i campioni. Nella maggior parte dei casi, carichi relativamente elevati enzimi sono utilizzati per ridurre le differenze dovute a variazioni sperimentali dell'attività enzimatica, che potrebbero falsare i risultati in modo significativo.
Tecniche rapide per determinare la composizione delle pareti cellulari delle piante e gli zuccheri monomerici liberato dopo saccarificazione enzimatica includono la robotica, personalizzati, piastre a 96 pozzetti termochimico compatibili, e modifiche di metodi di laboratorio standard 8-11 e protocolli strumentali, come la spettroscopia vibrazionale (infrarosso (IR), nel vicino infrarosso (NIR), o Raman) e la risonanza magnetica nucleare (NMR) 12-17. Queste metodologie sono fondamentali per isolare le materie prime ad alto o basso contenuto di cellulosa lignina, o quelli previsti per garantire la massima glucosio, xilosio, etanolo, ecc Questi metodi hanno permesso analisi rimpiccioliti che utilizzano minori quantità di biomassa e di consumo, con conseguente riduzione della sperimentazione spesa 18 9, pioppo 8,10, canna da zucchero canna da zucchero 8, e il panico verga 8 sono state valutate con successo con questi metodi HTP.
Lignina totale e composizione monomerica lignina sono anche comunemente quantificati tratti biomassa. La riduzione del contenuto di lignina hanno dimostrato di aumentare la digeribilità enzimatica di polisaccaridi 19,20. Il ruolo che il rapporto monomerica lignina (spesso riportato come syringyl / guaiacyl (S / G) contenuto) gioca nella decostruzione della parete cellulare vegetale è ancora sotto inchiesta. Alcuni report hanno indicato che riduzioni della S / Grapporto ha portato a un incremento delle rese di glucosio successiva all'idrolisi 21, mentre altri studi svelano la tendenza opposta 19,22. Metodi High Throughput per la valutazione lignina e dei suoi monomeri comprendono spettroscopia vibrazionale (IR, NIR, Raman e 23-26) accoppiata con analisi multivariata, e pirolisi spettrometria di massa a fascio molecolare (pyMBMS) 27,28.
Quando lo sviluppo di metodi di screening per HTP biomassa, diverse considerazioni integrali devono essere tenuti in considerazione. Un aspetto fondamentale è la complessità del metodo. Qual è il livello di abilità richiesto per la tecnica? Analisi chemometric, per esempio, richiedono competenze specifiche per la costruzione, la valutazione, e il mantenimento di modelli predittivi. I metodi standard presentano indesiderati fasi di analisi preparatoria o dati o utilizzano reagenti tossici. Sviluppo dei modelli è un processo continuo in cui i nuovi dati vengono incorporati nel modello nel tempo per aumentare la robustezza del modello. Un'altra considperazione è il risparmio di costi e una diminuzione tempi di analisi sperimentale dei metodi high-throughput proposti. Se il metodo è abbastanza rapida, ma molto costosa, non può essere una tecnica praticabile per molti laboratori di adottare. I metodi illustrati in questo manoscritto sono varianti di tecniche standardizzate, modificate per amplificare le capacità di throughput. Questi protocolli quantitativamente misurano i tratti di biomassa di interesse senza richiedere lo sviluppo di modelli predittivi. Questa è una caratteristica fondamentale di queste tecniche, poiché metodi predittivi, mentre esibendo forti correlazioni con l'analisi standard utilizzata per sviluppare i modelli, non sono precisi come effettivamente misurare la quantità di interesse per i campioni. Considerando che i metodi utilizzati sono sostanzialmente ridimensionato le versioni di metodi analitici standard di bench-scala, accuratezza e precisione sono negoziati per la velocità e il throughput. Per lo più, questo risultato è dovuto ad errori più elevati in piccolo pipettaggio volume e di peso; così come una maggiore sampia eterogeneità dimensione del campione è diminuita. Mentre le grandi serie di campioni possono essere esaminati e confrontati, grande attenzione deve essere esercitata quando si effettua il confronto tra campagne distinte e ai risultati panca scala.
La maggior parte delle fasi dispendiose comportano la manipolazione fisica della biomassa. Campioni di rettifica può richiedere diversi minuti per campione, compresa la pulizia fuori del mulino tra i campioni. Caricamento manuale, scarico, e tramogge di pulizia e riempimento e svuotamento bustine di tè e sacchetti di campionamento è anche molto alta intensità di lavoro. Mentre ogni passaggio potrebbe richiedere un minuto o più, fare migliaia di campioni possono richiedere molte ore o persino giorni. I robot possono caricare un piatto tipico reattore con biomassa in circa 3 a 4 ore o 6 per 8 piastre giorno -1 robot -1. Questa situazione dipende dai parametri di precisione utilizzati nonché il tipo e la quantità di biomassa da testare. Riempimento reattore piastre con acqua, acido diluito, o enzima viene rapidamente fatta usando un robot manipolatore liquido. Pritrattamento di una piastra pila (da 1 a 20 piastre reattore) dura tra 1 e 3 ore durante il montaggio, raffreddare e smontaggio è inclusa. Idrolisi enzimatica dura 3 giorni e l'analisi zucchero richiede circa 1 ora di tempo di preparazione, più 10 minuti per piastra reattore per completare il test e leggere i risultati. Un programma settimanale di set di pretrattamento e di analisi giorni ospita un programma di lavoro ragionevole, riducendo al minimo dispari ore e week-end sforzi per la componente umana del test e consentono l'elaborazione ~ 800 a 1.000 campioni settimana su base continuativa. La velocità massima dipende da diversi fattori, soprattutto la quantità di hardware (robot, reattori piatti, etc.) e la quantità di "software" (vale a dire, il personale) sono a disposizione per fare il lavoro manuale. Il limite superiore è pratico 2.500 a 3.000 campioni / settimana; tuttavia, che la produzione richiede operazione 7 giorni a settimana e più stagisti e tecnici degli studenti. In confronto, 3.000 campioni mediante HPLC richiederebbe circa 125 giorni di samanalisi ple più del lavoro aggiuntivo di pesare manualmente i campioni in reattori e campioni di filtraggio prima dell'analisi.
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Protocol
1. Alta-throughput determinazione del glucosio e xilosio rendimenti seguito enzimatica saccarificazione 9,29
- Preparazione del campione (macinazione, De-inamidatura, estrazione, pretrattamento)
- Macinare almeno 300 mg di ciascun campione biomassa utilizzando un mulino Wiley, tale che le particelle passano attraverso una maglia 20 (850 micron) schermo. Trasferimento a zip-top sacchetti antistatici (in genere con codici a barre) e le informazioni sul campione record al database di codici a barre.
- Aggiungere circa 250 mg o più di biomassa terra da sacchetto antistatico di un numerato (con la matita, non utilizzare inchiostro o pennarello) sacchetti da tè, con attenzione arrotolare le bustine di tè, facendo attenzione a piegare le estremità sopra la biomassa per prevenire perdita durante il de-inamidatura ed estrazione.
- Avvolgere la bustina chiusa con filo di rame ricoperto di stagno. Registrare il numero bustina di tè per ogni campione con codice a barre.
- Preparare la soluzione enzimatica de-starching da enzimi commerciali (tipicamente, 0,25% (v / v) glucoamilasi (~ 1.600 AGU / L) e1,5% (v / v) alfa-amilasi (~ 2.900 KNU-S / L) in 0,1 M di acetato di sodio (pH 5,0)). Preparare 16 ml per g di massa biomassa o 500 ml per 120 campioni bustina. Nota: Carichi in grado di rimuovere l'amido di biomassa a terra dovrebbero essere determinati empiricamente da test per l'amido dopo la digestione con una gamma di carichi di enzimi e di rapporti.
- In un contenitore di plastica, aggiungere 16 ml di soluzione di de-starching enzimatica per 1 g di massa biomassa terra. Per un protocollo de-inamidatura batch, aggiungere 120 bustine a 500 ml di soluzione tampone-enzima.
- Incubare in un agitatore a 55 ° C per 24 (± 4) ore, a 120 rpm per rimuovere possibili amido.
- Dopo il de-starching incubazione, risciacquare e immergere la biomassa in diversi litri di acqua deionizzata per 30 minuti. Ripetere questo processo due volte per rimuovere i sali tampone che possono causare urti (formazione di bolle di gas nella soluzione che può portare a un improvviso e violento aumento del livello della soluzione, provocando etanolo liquido caldo a cascatafuori dal recipiente di reazione) durante l'estrazione.
- Dopo il risciacquo completo della biomassa de-inamidato, posizionare le bustine nella colonna di estrazione Soxhlet. Non è richiesta alcuna ditale per questo passo.
- Impostare il reflusso Soxhlet, con il 95% di etanolo ed estrarre i campioni per 24 ore.
- Rimuovere le bustine dal reattore Soxhlet e diffondere in un unico strato su un vassoio piatto.
- Consentire ai campioni di asciugare durante la notte a temperatura ambiente in una cappa aspirante.
- Srotolare le bustine e riportare la biomassa secca di sacchetti antistatici codice a barre originali.
Nota: I sacchetti antistatici sono efficienti nel ridurre l'elettricità statica nella biomassa, migliorando le caratteristiche di maneggevolezza. Se vengono utilizzate altre opzioni di archiviazione, ulteriore biomassa può essere necessaria a causa della biomassa aggrapparsi al lato del contenitore di stoccaggio. - Trasferire almeno 50 mg della biomassa essiccata in una tramoggia di codice a barre (usando più materiale è migliore per un dosaggio accurato). Spossono codici a barre dei sacchetti antistatici e la tramoggia di ricezione al fine di garantire il monitoraggio accurato del campione.
- Tramogge caricare su solidi di peso del robot, prestando molta attenzione all'ordine dei campioni nel rack. Caricare piastre reattore sufficiente per contenere tutti i campioni e selezionare il protocollo di dosaggio in base al numero di lastre utilizzate.
- Pesare robotizzato 5 mg di campioni essiccati (± 0,3 mg) in acciaio inox piastre a 96 pozzetti resistenti agli acidi. Pesare 3 repliche di ciascun campione distribuite intorno alla piastra per ridurre al minimo eventuali variazioni localizzate.
- Includere 8 campioni di controllo di biomassa di un materiale standard di biomassa ben caratterizzato, al fine di monitorare le prestazioni del dosaggio. In caso di più targhe, l'utilizzo di più tramogge biomasse standard di ridurre al minimo la dimensione delle particelle deriva causata dal setacciando nelle tramogge sopra cicli ripetuti di erogazione.
Nota: In ogni piatto, non ci dovrebbero essere 24 campioni con 3 repliche, 4 spazi vuoti consistenti di acqua deionizzata e l'enzima, e 8 Controls, utilizzando la biomassa normale precedentemente caratterizzati. Le 3 pozzetti angolo di ciascuno dei 4 angoli della piastra sono riservati per gli standard di zucchero. - Assegno in bianco e zucchero pozzi standard, per le particelle di biomassa erranti e rimuovere, se presenti.
- Aggiungere 250 ml di acqua deionizzata a ogni bene, e sigillare le piastre con politetrafluoroetilene silicone adesivo-backed (PTFE) Nastro.
- Utilizzando un "suggerimento saldatore 1/8, forare il nastro in PTFE in ciascun porto vapore (117 in totale) per ogni piatto. Utilizzare un piatto vuoto impilati su piastra reattore sigillato come guida e per limitare il movimento di PTFE pellicola.
- Fissare le piastre saldamente con 0,031 "guarnizioni spesse vetroresina PTFE (pre-perforati con fori per i porti di vapore) fra piatti e piatti vuoti sulla parte superiore e inferiore della pila. Pretrattare i campioni utilizzando un reattore a vapore per 180 ° C per 17,5 min, o altre combinazioni di temperatura / tempo in base alla gravità desiderata.
- Piastre reattore Raffreddare a 50 °; C da inondazioni con acqua deionizzata.
- Enzimatica Saccarificazione
- Preparare una soluzione di saccarificazione enzimatica composto dell'8% (v / v) in soluzione enzimatica 1.0 M sodio citrato, pH 5,0. Preparare 5 ml per piastra reattore. Nota: è necessaria la diluizione deve essere determinato sulla base di attività e di proteine della soluzione di riserva enzima specifico.
- Quando le piastre sono fresche, li centrifugare in un rotore secchio oscillante a 1.500 xg per 20 min. Rimuovere la pellicola sigillante. Nota: Queste piastre sono pesanti e le specifiche centrifuga devono essere controllate per la compatibilità.
- Aggiungere 40 ml di soluzione enzimatica magazzino 8% in ogni pozzetto (70 mg enzimatica per g di biomassa).
- Richiudere con il nuovo nastro in PTFE. Mettere piatto sigillato nel morsetto piastra magnetica.
- Mescolare delicatamente i campioni per inversione (almeno 15 volte), e incubare a 50 ° C per 70 ore.
- Quando la saccarificazione ha concluso, mescolare per inversione e centrifugare le piastre a 1.500 xg per 20 min.
- Zucchero Assay
- Preparare una serie di 6 glucosio e xilosio combinato standard di calibrazione a 0.014 tampone M citrato (pH 5,0) va da 0 a 0.750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 e 0,75 mg / ml raccomandato) e da 0 a 0.600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 e 0,6 mg / ml raccomandato) per il glucosio e xilosio, rispettivamente.
- Preparare il glucosio ossidasi / perossidasi (goPod) e xilosio deidrogenasi (XDH) reagenti in base alle istruzioni contenute nel kit.
- Usando una pipetta, rimuovere 200 ml di liquido dai 4 pozzi d'angolo e pozzi bordo adiacente ai pozzetti d'angolo (12 pozzi totali) della piastra reattore.
- Usando una pipetta, dispensare 180 ml di acqua deionizzata a ciascun pozzetto di una piastra di diluizione a fondo piatto di polistirene da 96 pozzetti. Non aggiungere acqua ai pozzi d'angolo standard e 12 di zucchero (rimuovere quei suggerimenti se si utilizza una testina a 96 canali).
- Usando una pipetta, dispensare 180 microlitri goPod di reagente in ogni pozzetto del saggio del glucosio plmangiò.
- Usando una pipetta, dispensare 180 microlitri XDH reagente a ciascun pozzetto della piastra di test xilosio.
- Usando una pipetta, 20 ml aliquote di idrolizzato dalla piastra del reattore a 96 pozzetti per piastra di diluizione. Pipettare dalla sezione superiore dei pozzetti per evitare solidi biomassa e liquido residuo in pozzi angolo. Mescolare triturazione per almeno 10 cicli.
- Usando una pipetta, 110 ml di standard di zucchero, in duplice copia, per i pozzi d'angolo della piastra di diluizione.
- Usando una pipetta, trasferire 20 microlitri aliquote dalla piastra di diluizione alla glucosio e xilosio piastre test. Miscelare triturazione.
- Incubare le piastre di glucosio e xilosio test a temperatura ambiente per 30 min. Rompere con attenzione tutte le bolle di superficie prima della lettura. Una pistola termica brevemente passato sopra la superficie della piastra funziona bene.
- L'utilizzo di un lettore di piastre a 96 pozzetti ultravioletta / visibile, impostare la lunghezza d'onda misurata a 510 nm e registrare l'assorbanza contro un bianco reagente.Questa misura monitora la formazione di quinonimine, che è proporzionale alla concentrazione di glucosio. La concentrazione di glucosio è calcolata dalla curva di calibrazione in base agli standard di taratura preparate al punto 1.3.1.
- L'utilizzo di un lettore di piastre a 96 pozzetti ultravioletta / visibile, impostare la lunghezza d'onda misurata a 340 nm e registrare l'assorbanza. Questa misura monitora la riduzione di NAD + in NADH, che è proporzionale alla concentrazione xilosio. La concentrazione xilosio viene calcolata dalla curva di calibrazione in base agli standard di taratura preparate al punto 1.3.1.
2. Alta-throughput Determinazione del totale lignina e lignina Monomerico contenuti utilizzando pyMBMS 28
- Preparazione del campione
- Macinare ed estrarre la biomassa utilizzando i metodi descritti nei passaggi 1.1.1, e 1.1.6-1.1.8. Questo include macinazione e l'estrazione di una serie di standard da utilizzare come controlli sperimentali.
Nota: Il measur pyMBMSements non granulometria dipende, quindi se solo utilizzando il protocollo pyMBMS, preparazione biomassa devono essere effettuate per consentire al campione di essere introdotto nel portacampioni, <4 mm. - Utilizzando una spatolina erogazione circa 4 mg (da 3 a 5 mg preferiti) della biomassa preparato in una tazza di acciaio inossidabile 80 microlitri progettato per l'auto-campionatore.
- Assicurarsi che almeno il 10% dei campioni analizzati sono in fase di norme di controllo, come quelli disponibili presso il National Institute of Standards and Technology (canna da zucchero bagassa-8491, pioppo-8492; pino-8493, o paglia di grano-8494). Lo standard può anche essere qualsiasi specie analoghe ai campioni da analizzare che sono già stati caratterizzati utilizzando metodi standard.
- Caricare in modo casuale i campioni nelle tazze di auto-campionatore con una pinzetta per evitare distorsioni a causa di possibili derive spettrometro nel corso del tempo. Nota: Un tipico randomizzazione dei campioni dovrebbe includere la misurazione di tutti i campioni una volta, seguita da una ri-randomizzazionedell'ordine dei campioni per la misurazione duplicato. Programmi di randomizzazione sono disponibili online.
- Usando un hole-pugno di serie, produrre manualmente dischi filtranti di vetro dal tipo fogli A / D in fibra di vetro, senza legante. Tenere il filtro in fibra di vetro rotondo con pinzette, centrare la tazza campione e spingere nel campione con una chiave a brugola da 3,5 mm per confinare il materiale in ogni tazza durante l'esperimento.
- Macinare ed estrarre la biomassa utilizzando i metodi descritti nei passaggi 1.1.1, e 1.1.6-1.1.8. Questo include macinazione e l'estrazione di una serie di standard da utilizzare come controlli sperimentali.
- Protocollo strumentale
- Calibrare lo spettrometro di massa utilizzando uno standard noto che ha intensità dei picchi sull'intera gamma di composti che possono esistere per i campioni sperimentali. Per i campioni tipici di biomassa, utilizzare perfluorotributilammina (PFTBA).
- Impostare la portata del gas di trasporto elio a 0,9 L / min usando un misuratore di flusso del gas.
- Impostare il forno autocampionatore ad una temperatura di pirolisi di 500 ° C e la temperatura di interfaccia a 350 ° C utilizzando il software autocampionatore. Nota: riscaldata A "in acciaio inox 08/01linea di trasferimento di calore avvolto in nastro che collega l'autocampionatore al spettrometro di massa viene controllata tramite un regolatore di calore a 250 ° C.
- Inizia acquisizione dati sulla spettrometro di massa e attendere almeno 60 secondi per ottenere dati sufficienti per la raccolta sfondo spettri.
- Avviare il metodo di auto-campionatore automatico con le specifiche da 2.2.2. Nota: L'autocampionatore gocce ogni campione singolarmente nella fornace autocampionatore. Il tempo totale di acquisizione dei dati è di circa 1,5 minuti; tuttavia, pirolisi di un tipico campione 4 mg è completa dopo 30 sec.
- Record tenore totale di ioni (TIC) di ogni campione utilizzando software spettrometro di massa a velocità di scansione di 0,5 sec. Record intensità tra m / z 30-450.
Nota: composti biomassa tipiche usano ionizzazione morbido a 17 eV. Lo strumento può registrare grandi intervalli di m / z 1 a 1.000; tuttavia, velocità di scansione sarà limitata dalla potenza della CPU del computer. - Rimuovere sfondo dagli spettri utilizzando la manuale migliorare funzione del software. Nota: Una porzione 60 di scansione della linea di base all'inizio di raccolta dati vengono usati per calcolare un valore medio di sfondo. Questo spettri medi sfondo viene rimossa dal campione sperimentale spettri automaticamente nel software spettrometro di massa.
- Importare il file di testo unico colonna creata dal software spettrometro di massa contenente i dati spettrali per ciascun campione, in un programma di database e combinare tutti i campioni in un database. Aggiungere qualsiasi metadati applicabile al foglio di calcolo. Importare i dati formattati (foglio elettronico di file / CSV) in un pacchetto software statistico e significa normalizzare gli spettri per tenere conto di variazioni nelle masse campione pirolizzati.
- Utilizzare un pacchetto software statistico per eseguire una analisi delle componenti principali (PCA) utilizzando i dati spettrali per analizzare raggruppamento dei campioni standard replicati utilizzati nelle valutazioni, nonché per valutare quali picchi solidali alla classificazione di chimicacomposti nelle carichi tramano 28.
Nota: i gruppi PCA campioni basati sulla somiglianza dei loro spettri, e permette un controllo degli standard per misurare errore sperimentale derivante da strumenti deriva durante la corsa. - Per calcolare il syringyl lignina (S) / guaiacyl (G) rapporto, sommare le aree dei picchi S (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, e 210) e dividere per la somma dei picchi G a 124, 137, 138, 150, 164, e 178.
- Per calcolare il contenuto totale di lignina, sommare i picchi lignina con m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, e 210.
- Calcolare un fattore di correzione per la misura di scala pyMBMS ad un metodo standard per la stima lignina totale, come Klason lignina. Dividere il valore di lignina Klason dello standard individuale per il tenore totale lignina misurato per il campione standard utilizzando pyMBMS.
- Applicare questo fattore di correzione per tutte come specie nel set di dati. Ripetere per ogni tipo di biomassa analizzato. Nota: Il fattore di correzione può variare notevolmente in base al S / G della biomassa analizzato.
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Representative Results
L'effetto combinato del pretrattamento termochimica e successiva saccarificazione enzimatica è misurata in funzione della massa di glucosio e xilosio rilasciato alla fine del test. I risultati sono riportati in termini di milligrammi di glucosio e xilosio rilasciato per grammo di biomassa. Ciò è in netto contrasto con i dati riportati da saggi di bench-scala, che di solito è riportato come percentuale rendimento teorico basato sull'analisi compositiva del materiale di partenza. Poiché non è ancora pratico per effettuare analisi composizionale su migliaia di campioni alla settimana, i dati vengono meglio riportato come livelli di conversione su una base di massa. Questo permette la valutazione ragionevole campione finché i confronti sono realizzati tra campioni strettamente connesse biomassa e la composizione dei campioni non varia troppo.
L'obiettivo primario del test è quello di valutare le differenze relative resistenza della parete cellulare vegetale al combinato termochimica / enzymsaccarificazione ATIC tutta una serie di singole varianti. Vale la pena notare che il test non tenta di ottimizzare qualsiasi delle condizioni utilizzate per saccarificazione. In effetti, le condizioni di gravità pretrattamento sono significativamente subottimale per ampliare la gamma di sensibilità del test, il targeting una resa di conversione finale del 50% al 70% del teorico. Condizioni di pretrattamento o in prossimità ottimale sarebbe spingere tutti i campioni di alta conversione, restringendo notevolmente la gamma dinamica del saggio. Viceversa, l'enzima caricamento è molto maggiore di quella normalmente riportato per digestioni panchina scala. Ancora una volta, l'obiettivo del metodo non è di trovare la migliore enzima o minimizzare il costo dell'enzima, ma per misurare la riluttanza intrinseca delle pareti cellulari di conversione e con carichi molto elevati enzima rimuove variabilità dal saggio.
Infine, è importante capire che la variabilità nel saggio complessivo è significativamente superiore a quello riportato per benclavoro h scala. Errori standard tipici sono circa l'8%, anche se la gamma è molto più ampia. Questo è semplicemente la natura della piccola, la ricerca HTP. Pipettaggio e gli errori di pesatura sono proporzionalmente più elevata a scala microlitri e mg, come lo sono perdite per evaporazione e condensazione. Biomassa eterogeneità diviene molto grande variabile quando saggiare diversi ordini di grandezza meno particelle in ciascun campione, cioè, 5 mg vs multipla g. I test colorimetrici utilizzati per determinare il glucosio e xilosio correlano bene con risultati HPLC; Tuttavia, mentre i saggi enzimatici-linked per analisi zucchero sono veloci e possono essere eseguite in parallelo, non sono precisi come metodi analitici quali HPLC, introducendo un altro strato di imprecisione (Figura 1).
A causa di tutte le considerazioni di cui sopra, i risultati devono essere interpretati e riportati entro certi limiti solo. I dati devono essere esaminati in interi set, non come singoli campioni. Repliche sono necessari per mearisultati valida-. Tendenze e valori anomali sono significativi, ma i risultati non sono singoli. I confronti sono fatti meglio all'interno dei set sperimentali singoli. Confronti tra campagne temporalmente o spazialmente separate richiedono controlli molto stretti e un attento esame per essere significativo. Dati HTP non è direttamente paragonabile a benchmark o dati altra scala. Tendenze binario tra la HTP e altre scale, ma i confronti diretti del campione non danno risultati identici.
Rappresentazione dei dati in genere cade in confronto tendenze, valori anomali, o sub-popolazione / variante. Un esempio di tendenze è un sondaggio di riluttanza di 755 varianti naturali di pioppo campionati in un ampio intervallo nel nord-ovest del Pacifico degli Stati Uniti 19. La riluttanza di questi campioni è stata tracciata contro il loro rapporto di contenuto di lignina e syringyl / guaiacyl come determinato dal pyMBMS. I risultati indicano che sorge S / G, recalcitrante diminuisce finché un rapporto S / G di circa 2, dove il impr recalcitrancelivelli ovement off (Figura 2). I valori anomali può essere visto chiaramente in figura 3, in cui il gene Pt4CL1 era down-regolato in pioppo. Diverse centinaia di cultivar sono stati esaminati e diversi sono chiaramente aumentati a riluttanza, come dimostra il rilascio di zucchero è diminuito. La figura 4 rappresenta uno studio in cui diverse varietà di grano di paglia diverse sono state coltivate su diversi luoghi nel corso di due anni e la raccolta dopo diverse variazioni delle condizioni di crescita , con conseguente 20 distinte popolazioni basate su combinazioni di queste variabili. Questi insiemi di campioni sono facilmente distinguibili e indicano variabili positive e negative per recalcitrance. Figura 5 mostra come pyMBMS possono essere utilizzate per valutare le variazioni nella composizione della parete cellulare. Mass frammenti spettrali sono assegnati a diversi monomeri lignina (Tabella 1). Quando si confrontano un campione con elevata lignina vs alto contenuto di carboidrati, le disparità nei dati spettrali sono evidenti. Tegli usa dei dati pyMBMS accoppiato con una analisi delle componenti principali (PCA) è illustrato nella figura 6. In questo esempio, i campioni vengono classificati in base a bassa o alta concimazione azotata. La lignina e contenuto di carboidrati allineano inversamente lungo PC1. L'uso della carichi componente principale trama può aiutare a identificare quali caratteristiche chimiche vengono spiegati nella trama punteggi di classificazione, così come CHIARIRE quali tratti cambiano tra i cluster di esempio.
Figura 1: Confronto tra glucosio e xilosio quantificazione utilizzando high-throughput test colorimetrici vs HPLC 9. Confronto di rilevamento del glucosio e xilosio è stata effettuata utilizzando xilosio deidrogenasi (XDH, pannello superiore) e glucosio ossidasi / perossidasi (goPod, pannello inferiore) high-throughput colorimetriche saggi enzimatici-linked e ad alte prestazioni lcromatografia iquid.
Figura 2: recalcitrance delle pareti cellulari pioppo in funzione della syringyl a guaiacyl (S / G) contenuto in lignina 9 Aumentare la riluttanza delle pareti cellulari di pioppo in funzione della syringyl a guaiacyl (S / G) contenuti nella frazione lignina ha. stati osservati e riportati. 755 campioni di carote di pioppo dello stesso cultivar di pioppo sono state rilevate diverse centinaia di miglia di foresta in American Pacific Northwest Nord e screening per il rilascio del glucosio e xilosio dopo pre-trattamento termochimico e l'enzima saccarificazione. I risultati sono stati tracciati rispetto rapporto S / G nella lignina parete cellulare come determinato dal pyMBMS. Recalcitrance diminuisce all'aumentare S / G fino a circa 2, dove rimane costante a più alto S / G. Valori resa teorica si basano sul BESC "standard" di pioppo e sono forniti come riferimCe per il confronto.
Figura 3:. Riluttanza nell'espressione Pt4CL1 down-regolato in pioppo down-regolazione del gene Pt4CL1 in pioppo ha provocato una piccola variazione nel riluttanza parete cellulare tra cloni, invece, varie drasticamente aumentati varianti riluttanza sono facilmente identificabili. Cliccate qui per vedere una più grande versione di questa figura.
Figura 4: riluttanza in varie popolazioni Wheatstraw Gli effetti di tipo cultivar, luogo di coltivazione, concimazione, irrigazione e risultato tasso a livelli riluttanza chiaramente distinguibili.. Diversi simboli rappresentano different condizioni di crescita sperimentali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Applicazione pyMBMS per l'analisi dei cambiamenti chimici nelle pareti cellulari delle piante 28 I picchi denotati con frecce sono frammenti lignina, e sono stati utilizzati per valutare (a) elevata lignina (b) lignina medio o (c) a basso contenuto di lignina.
Figura 6:. Delle componenti principali punteggi analisi trama differenze nella chimica parete cellulare di alberi popolose cresciuti con superiori e inferiori tassi di fecondazione 28 (in alto) Analisi delle componenti principalipunteggi tracciare illustrante una classificazione distinta, e quindi, le differenze nella chimica parete cellulare di alberi popolosi coltivate con tassi di fecondazione superiori e inferiori. Principale componente 1 diviso i campioni in base a più alto lignina (negativo) o superiore di carboidrati contenuti (positivi). (In basso) Il carico dei componenti principali chiariscono che componenti chimici cambiano tra i due gruppi di campioni in punteggi trama. I carichi positivi sono correlati con i punteggi positivi, che sono rappresentativi del contenuto di carboidrati più elevati, mentre i carichi correlati negativamente allineano con punteggi negativi e, di conseguenza, più alto contenuto di lignina.
| m / z | Assegnazione molecolare 30 | S / G assegnazione / H |
| 94 | fenolo | S / G / H |
| 120 | Vinylphenol | H |
| 124 | Guaiacolo | Sol |
| 137 | Etilguaiacolo, homovanillin, alcol coniferilico | Sol |
| 138 | Methylguaiacol | Sol |
| 150 | Vinylguaiacol | Sol |
| 154 | Syringol | S |
| 164 | Allyl- + propenile guaiacolo | Sol |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | S |
| 168 | 4-metil-2,6-dimetossifenolo | S |
| 178 | Coniferilico aldeide | Sol |
| 180 | Alcol coniferilico, syringylethene | S, G |
| 182 | Siringaldeide | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
Tabella 1:. Picco m / z e le assegnazioni per i frammenti di pirolisi lignina-derivati, come rilevato da spettrometria di massa Lista di composti tipici rilevati dal pyMBMS. Assegnazioni molecolari basati su Evans, RJ e TA Milne (1987). Caratterizzazione molecolare di pirolisi di biomassa Energia e Combustibili 1 (2):. 123-137.
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Discussion
Le fasi di preparazione del campione chiave per ottenere dati accurati e riproducibili per lo svolgimento di esperimenti di screening high-throughput sono i seguenti:
Zucchero saggio di rilascio:
In generale, i campioni sono preparati in lotti che vanno da poche decine a diverse migliaia per volta. Ogni punto importante è tipicamente effettuata per tutti i campioni prima di andare avanti al fine di minimizzare le variazioni in preparazione tra i campioni. De-inamidare non era originariamente parte del protocollo e può essere omesso, in alcuni casi. Campioni di carote di legno e materiali erbacee senesced sono costantemente a basso contenuto di amido e, quindi, non richiedono de-starching per ridurre la variabilità. L'amido è una delle principali preoccupazioni; tuttavia, in set di campioni di piante di tessuto verde, in particolare per le grandi serie di campioni in cui si verifica il raccolto per diverse ore. Quando i livelli di amido aumentano durante le ore diurne e sono esaurite durante buio, i livelli di amido possono variare in modo significativo nel corso sh Everal e glucosio da amido è indistinguibile dal glucosio dalla cellulosa, di conseguenza, alti livelli di amido possono portare a misure distorta bassi riluttanza. L'attuale carico enzima nel passo destarching è di minore interesse, finché c'è abbastanza attività eccessiva per rimuovere tutto l'amido accessibili entro i tempi della fase di idrolisi. Le variazioni di enzimi specifici utilizzati, ora, temperatura, tasso di volume, e l'agitazione della fase di amido di rimozione può certamente portare a differenze nei livelli di rimozione di amido e tariffe e dovrebbero essere determinati empiricamente quando possibile. Infine, quando la confezione le bustine di tè per l'estrazione, utilizzare filo di rame ricoperto di stagno. Filo di rame nudo potrebbe causare reazioni chimiche indesiderate con soluzione enzimatica, dando valori di zucchero falsi. Di rame ricoperto di stagno ha risolto questo problema, mentre filo di acciaio inossidabile non era abbastanza malleabile per tenere le bustine di tè ben chiuso.
Size-consistente riduzione della biomassa è fondamentale per accudati sui tassi per due motivi: 1) finemente macinato biomassa, mentre erogato più facilmente e in modo coerente, è anche più facile da digerire rispetto al materiale più grossolano. 2) La biomassa che è troppo grossolana può intasare le tramogge, con conseguente materiale insufficiente o, se lo zoccolo è solo parzialmente bloccando l'apertura, può agire come un setaccio e consentire solo particelle fini attraverso, diminuendo la riluttanza osservata del campione. Se troppo poco biomassa è contenuta nelle tramogge, può rivestire i lati della tramoggia, causando il robot di assumere la tramoggia è vuota e il campione verrà saltato nel processo di erogazione. Inoltre, bassi livelli di biomassa può contribuire esagerata eterogeneità del campione, in particolare sotto forma di particelle più dense (come cotenna) tendono a setaccio sul fondo del cono e ottenere erogato prima. Quando meno di 50 mg di materiale è disponibile, il test può ancora essere effettuata; tuttavia, i campioni devono essere a mano pesato. Tuttavia, i risultati di pesatura a mano sono più variabili di quelli robpesatura otic.
La quantità effettiva di biomassa necessaria per le fasi preparatorie non è ben definito. Abbiamo suggerito 250 mg come punto di partenza ragionevole, tuttavia, ogni campione biomassa presenta caratteristiche diverse per quanto riguarda le perdite dovute alla movimentazione, rettifica, e l'estrazione nonché vengano trattenuti in tramogge o essere erogato riproducibile. L'eterogeneità delle biomasse tra tipi e anche all'interno dello stesso tipo preclude un protocollo più definito. Coloro che desiderano implementare questi metodi di analisi sarà semplicemente necessario determinare molte di queste variabili per se stessi, anche se l'esperienza lo fa più facile.
Un altro passo che può introdurre errori è di miscelazione in piastre di microtitolazione, che è notoriamente difficile ed è fondamentale in questi saggi per diversi motivi. La soluzione enzimatica utilizzata è concentrato e può essere stratificato per aggiunta ai pozzetti, enzima limitante accessibilità alla biomassa. Come procede saccarificazione, il sugars rilasciata può anche stratificare e concentrare vicino alla biomassa e in funzione della profondità di campionamento, saggi zucchero può essere artificialmente alto o basso. Questo è il motivo essenziale per miscelare campioni dopo aggiunta enzima e l'enzima di saccarificazione, consentendo accurata miscelazione degli enzimi con la biomassa per persino saccarificazione e distribuzione uniforme degli zuccheri risultanti per consentire un'analisi coerente zucchero. In piastre che non contengono biomassa, come piastre di diluizione o di dosaggio, miscelazione pipettando ripetutamente (triturazione) ha dimostrato di essere molto superiore rispetto agitando. Tuttavia, come soluzioni in questo protocollo hanno densità variabili e livelli di particolato, la velocità di pipettaggio e verticale posizione punta nella colonna di liquido è fondamentale. Se la velocità è troppo elevata, scarsa precisione dovuto alla cavitazione (aspirazione) e ritenzione di liquido nella punta (erogazione) si può verificare. Se la punta è troppo profonda nel pozzo, la biomassa può intasare la punta o la punta può essere premuto fino in fondo, evitando l'aspirazione preciso, e ciè più di superficie esterna per il liquido a cui aggrapparsi e riporto alla fase successiva. Quest'ultimo problema può essere mitigato da un controllo della velocità di ritiro punta, come la rimozione punta più lento permette liquido di essere rimosso per la soluzione di massa dalla tensione superficiale. Se il ritiro punta è troppo lento, liquido pipettati può insinuarsi di nuovo nella soluzione di massa come bene. Le particelle di biomassa hanno anche una tendenza ad aggrapparsi alle punte e diventare trasferito alla piastra di diluizione, dove possono intasare la punta durante la miscelazione o il trasferimento alle piastre test, la creazione di inesattezze nei volumi di campione da analizzare. Tali particelle possono interferire con l'analisi spettroscopica delle piastre test se occludono il fascio di luce durante la lettura.
Tempistica sviluppo del colore coerente è fondamentale per goPod e saggi XDH. Il colore-sviluppo deve essere permesso di andare a compimento; tuttavia, il colore test goPod tende a continuare ad aumentare dopo il completamento e la NADH generato dal test XDH lentamentedecrementi per ossidazione spontanea del NADH. Come risultato, temporizzazione variabilità può portare a confronto incoerenti di dati tra piastre separate. I passi del test devono essere monitorati con attenzione, come interruzioni a causa di problemi hardware o software possono portare a grandi differenze nei tempi di analisi. L'uso di standard di zucchero e pozzetti di controllo standard di biomassa in ogni piatto può aiutare a mitigare questo in una certa misura.
PyMBMS:
Norme devono essere attentamente considerati per pyMBMS esperimenti per il confronto di metodi chimici bagnato standard. A causa della composizione diversa lignina (rapporti S / G) di specie di biomassa, il fattore di correzione deve essere determinata con uno standard rappresentativa che è la stessa specie del campione sperimentale. Se non ci sono standard appropriati disponibili, le differenze di concentrazione lignina possono essere confrontati con le intensità dei precursori lignina direttamente. Alta S rapporti / G (oltre ~ 3.5) possono portare a una sovrastima di lcontenuti ignin per pyMBMS. Ciò è causato dalla tendenza per S lignina essere preferenzialmente svincolata alle condizioni standard usati in questo metodo. Inoltre, la quantità di campione necessaria per pyMBMS misure dipende dal tipo di biomassa utilizzata. Isolati lignina e modello lignina composti richiedono meno materiale (0,1 mg), come con maggiori aliquote di campione in grado di saturare il rivelatore.
Un altro passo fondamentale nel processo di PyMBMS è attento a punto di strumenti per uno standard conosciuto come perfluorotributilammina (PFTBA) prima di ogni esperimento. PFTBA contiene picchi molecolari attraverso l'intero spettro di tipico biomassa e, quindi, permette la sintonizzazione strumento uniforme tra prove sperimentali. La zona mediana degli spettri PFTBA è sintonizzato in modo che m / z 131 e m / z 219 sono circa il 50% dell'intensità di m / z 69. Questa accordatura è utilizzato per enfatizzare tipici picchi visto sotto ionizzazione morbida (17 eV) usata per ridurre al minimo la frammentazione di ioni per abbassare le masse che c annot essere facilmente identificata.
Va notato che questi metodi non sono metodi analitici per la quantificazione esatta di analiti di interesse. Piuttosto, queste tecniche high-throughput sono per lo screening di grandi insiemi biomassa per identificare coloro che possiedono le caratteristiche chimiche desiderate. Questi metodi devono essere utilizzati solo per lo screening, classifica, e la correlazione dei campioni all'interno di un set di dati. I set di dati non possono essere confrontati direttamente quando raccolte su diversi giorni a causa di fonti di variazione, come deriva strumentale, cambiamenti di attività enzimatica, ambiente contenuto di umidità nella biomassa causa di cambiamenti di umidità, le fluttuazioni di temperatura, e le differenze di suggerimenti e un sacco piastra assorbanza . Inoltre, il pretrattamento utilizzato nel protocollo preparazione del campione non è una strategia pretrattamento ottimizzato, ma piuttosto è stato progettato specificamente per essere sub-ottimale. Ciò consente sottili differenze tra le piante da chiarire in modo più efficiente.
jove_content "> Il vantaggio principale di adottare metodi high throughput è che molti più campioni possono essere misurati nello stesso periodo di tempo 18. Ad esempio, un metodo comune per analizzare i carboidrati prodotti durante una saccarificazione acida o enzimatica è l'uso di alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC). Selig et al., affermano che l'onnipresente acido di idrolisi in due fasi, anche se molto utile e fondamentale per la quantificazione dei carboidrati strutturali, limita i ricercatori ad essere in grado di valutare circa 25 campioni per settimana 9. Mentre l'analisi strumentazione utilizzata nei metodologie high throughput non può fornire la sensibilità di una tecnica standard come HPLC, l'analisi rapida permette ricercatori il lusso di essere in grado di valutare grandi quantità di campioni. Inoltre, i metodi high-throughput spesso hanno ridimensionato protocolli sperimentali, ridurre l'uso di materiali di consumo, e di conseguenza, riducendo i costi di sperimentazione e dei rifiuti.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
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