Introduction
Als de wereldwijde levering van niet-hernieuwbare brandstoffen en bijbehorende producten afneemt, hebben wetenschappers uitgedaagd om soortgelijke brandstoffen en chemicaliën maken op basis van plantaardige bronnen 1. Een belangrijk aspect van dit werk is bepalen welke soorten planten geschikt voor de productie van biobrandstoffen en biomaterialen 2,3 zijn. Meestal worden deze voedingen geëvalueerd lignine, cellulose en hemicellulose inhoud; evenals hun gevoeligheid voor deconstructie (weerbarstigheid) door middel van thermische, mechanische en / of chemische voorbehandeling met of zonder daaropvolgende enzym versuikering. Meer gedetailleerde analyses worden gebruikt om de specifieke samenstelling van de lignine en hemicellulose fracties en een optimale enzymactiviteit noodzakelijk te bepalen. Transgene modificaties van planten die niet intrinsiek bezitten ideale eigenschappen voor biochemische en thermochemische conversie naar gewenste grondstoffen hebben de onderzoekers voorzien van een zeer uitgebreide bron van de pottiële grondstoffen 4. De standaard analytische methoden voor het kwantificeren van de chemische eigenschappen van de plant, terwijl zeer bruikbaar voor kleine sample sets, ongeschikt voor het snel screenen van honderden of duizenden monsters 5-7. De HTP hierin beschreven werkwijzen zijn ontwikkeld om grote aantallen varianten biomassa snel en efficiënt te evalueren van veranderingen in celwand weerspannigheid aan thermochemische en / of enzymatische afbraak.
Het is cruciaal om te begrijpen dat de HTP screeningstesten die hierin zijn beschreven zijn niet bedoeld om de conversie of de opbrengst te maximaliseren. Het doel is om relatieve verschillen in de intrinsieke weerbarstigheid verwante biomassa monsters te bepalen. Hierdoor vele analysestappen verschillen van de "typische" biomassa conversie assays, waarbij het doel is om maximale omzetting snelheid of mate te verkrijgen. Zo worden lagere voorbehandeling severities en kortere enzymhydrolyse keer gebruikt maximaliseren afwijkenschillen tussen de monsters. Meestal gaan hoge enzymladingen gebruikt om verschillen als gevolg van experimentele variatie in enzymactiviteit, die de resultaten aanmerkelijk kunnen scheef verminderen.
Snelle technieken waarmee de samenstelling van plantaardige celwanden en de monomere suikers bevrijde volgende enzymatische versuikering omvatten robotics, aangepast, thermochemisch compatible 96-well platen en aanpassingen van standaard laboratoriummethoden 8-11 en instrumentele protocollen, zoals vibratiespectroscopie (infrarood (IR), nabij-infrarood (NIR), of Raman) en nucleaire magnetische resonantie (NMR) 12-17. Deze methoden zijn de sleutel tot het isoleren van grondstoffen met een hoog cellulose of lage gehalten lignine, of die naar verwachting de hoogste glucose, xylose, ethanol opleveren, enz. Deze methoden hebben downscaled analyses die kleinere hoeveelheden biomassa en verbruiksgoederen in dienst ingeschakeld, wat leidt tot vermindering van de experimentele kosten 18 9, populier 8,10, suikerriet bagasse 8 en switchgrass 8 zijn succesvol geëvalueerd met behulp van deze werkwijzen HTP.
Totaal lignine en lignine monomeer samenstelling worden ook vaak gekwantificeerd biomassa trekken. Verlagingen van lignine is aangetoond dat de enzymatische verteerbaarheid van polysacchariden 19,20 te verhogen. De rol die de lignine monomeer verhouding (vaak gerapporteerd als syringyl / guaiacyl (S / G)) speelt in de deconstructie van de plant celwand wordt nog onderzocht. Sommige rapporten hebben aangegeven dat een verlaging van de S / Gverhouding heeft geleid tot een verhoogde glucose opbrengst na hydrolyse 21, terwijl andere studies onthullen het tegenovergestelde trend 19,22. High throughput methoden voor het evalueren van lignine en de monomeren zijn vibrationele spectroscopie (IR, NIR, Raman en 23-26) in combinatie met multivariate analyse, en pyrolyse moleculaire bundel massaspectrometrie (pyMBMS) 27,28.
Bij de ontwikkeling van HTP methoden voor het screenen van biomassa, moet een aantal integrale overwegingen in het achterhoofd worden gehouden. Een belangrijk aspect is de complexiteit van de werkwijze. Wat is het vereiste niveau voor de techniek? Chemometrische analyses, bijvoorbeeld, vereisen bijzondere vaardigheden voor het construeren, evalueren en onderhouden voorspellende modellen. De standaard methoden vertonen ongewenste stappen voorbereidende of data-analyse of dienst giftige reagentia. De ontwikkeling van de modellen is een continu proces waarbij nieuwe gegevens worden opgenomen in het model in de tijd om de robuustheid van het model te verhogen. Andere considking is de kostenbesparing en verminderde experimentele analyse maal de voorgestelde high-throughput methoden. Als de methode tamelijk snel, maar zeer duur, kan het geen haalbare techniek voor vele laboratoria om aannemen. De werkwijzen toegelicht in dit handschrift varianten gestandaardiseerde technieken, bewerkt om de doorvoersnelheid mogelijkheden amplificeren. Deze protocollen kwantitatief de biomassa eigenschappen van belang te meten zonder de noodzaak van de ontwikkeling van voorspellende modellen. Dit is een belangrijk kenmerk van deze technieken, aangezien voorspellingsmethoden, terwijl met een sterke correlatie met de standaard analyses gebruikt om modellen te ontwikkelen, zijn niet zo nauwkeurig als werkelijk meten van de hoeveelheid van belang voor de monsters. Overwegende dat de gebruikte zijn in wezen verkleinde versies van de standaard bench-schaal analysemethoden methoden, nauwkeurigheid en precisie worden verhandeld voor snelheid en doorvoer. Meestal, dit resultaat is te danken aan hogere fouten in klein volume pipetteren en wegen; alsmede een toename van svoldoende heterogeniteit als monster wordt verkleind. Terwijl de grote sample sets kunnen worden gescreend en vergeleken, moet grote zorgvuldigheid worden betracht bij het maken van vergelijkingen tussen afzonderlijke campagnes en bench-schaal resultaten.
De meest tijdrovende stappen omvatten de fysieke manipulatie van de biomassa. Slijpen monsters kan enkele minuten per monster, met inbegrip van het schoonmaken van de molen tussen de monsters te nemen. Handmatig laden, lossen en schoonmaken hoppers en het vullen en legen van theezakjes en sample zakken is ook zeer arbeidsintensief. Terwijl elke stap een minuut of langer kan duren, kan het doen van duizenden monsters vele uren of zelfs dagen duren. De robot kan een typische reactor geladen plaat biomassa in ongeveer 3 tot 4 uur of 6-8 platen dag -1 -1 robot. Deze situatie is afhankelijk van de nauwkeurigheid parameters, alsmede het type en de hoeveelheid biomassa te testen gebruikt. Vullen reactor platen met water, verdund zuur of enzym wordt snel gedaan met behulp van een liquid handling robot. Pherbehandeling van een stapel platen (1-20 reactor platen) duurt tussen 1 en 3 uur na montage, koelen en demontage inbegrepen. Enzymhydrolyse duurt 3 dagen en de suiker analyse vereist ongeveer 1 uur van prep tijd plus 10 min per reactor plaat om de test te voltooien en lees de resultaten. Een wekelijks schema van set voorbehandeling en analyse dagen herbergt een redelijke werkschema minimaliseren oneven uur weekend inspanningen voor menselijke component van het assay en maakt bewerking ~ 800 tot 1000 samples per week op een permanente basis. De maximale doorvoersnelheid hangt af van verschillende factoren, vooral hoeveel hardware (robots, reactoren platen, enz.) En hoeveel "software" (dwz, personeel) zijn beschikbaar voor de handmatige werk te doen. De praktische bovengrens is 2500 tot 3000 monsters / week; echter, dat de output vereist 7 dagen per week operatie en meerdere stagiaires en technici. In vergelijking zou 3000 monsters met HPLC ongeveer 125 dagen sam vereisenple analyse plus de extra arbeid van de hand met een gewicht van de monsters in de reactoren en filtering monsters voorafgaand aan analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. High-throughput bepaling van glucose en xylose Opbrengsten Na enzymatische versuikering 9,29
- Monstervoorbereiding (Malen, De-stijven, Extraction, voorbehandeling)
- Grind ten minste 300 mg van elk monster biomassa met een Wiley molen, zodat de deeltjes door een 20 mesh (850 urn) scherm. Transfer naar anti-statische zip-top zakken (meestal bar-code) en opnemen monster informatie aan de barcode database.
- Voeg ongeveer 250 mg of meer van de grond biomassa uit de anti-statische zak naar een genummerde (met potlood, geen gebruik maken van inkt of marker) theezakje voorzichtig oprollen van de theezakjes, en zorg ervoor dat de uiteinden vouw over de biomassa om te voorkomen verlies tijdens de-stijven en extractie.
- Wikkel het theezakje gesloten met tin beklede koperdraad. Noteer het theezakje nummer voor elke barcode monster.
- Bereid de-stijven enzymoplossing van commerciële enzymen (gewoonlijk 0,25% (v / v) glucoamylase (~ 1600 AGU / L) en1,5% (v / v) alfa-amylase (KNU ~ 2900-S / L) in 0,1 M natriumacetaat (pH 5,0)). Bereid 16 ml per g bulk biomassa of 500 ml per 120 theezakje monsters. Opmerking: Ladingen kan verwijderen zetmeelgehalte van gemalen biomassa empirisch worden bepaald door het testen van zetmeel na digestie met verschillende enzymes en verhoudingen.
- In een plastic container, voeg 16 ml van de stijven enzym oplossing per 1 g bulk gemalen biomassa. Voor een partij de-stijven protocol, voeg 120 theezakjes aan 500 ml van de buffer-enzymoplossing.
- Incubeer in een schudder bij 55 ° C gedurende 24 (± 4) uur bij 120 rpm om mogelijke zetmeel te verwijderen.
- Na de-de stijven incubatie, spoel en genieten van de biomassa in verschillende liter gedemineraliseerd water gedurende 30 min. Herhaal dit proces nog twee keer met buffer zouten die stoten (vorming van gasbellen in de oplossing die kan leiden tot een plotselinge en hevige stijging van het niveau van de oplossing, waardoor hete vloeistof ethanol cascade veroorzaken verwijderenuit het reactievat) tijdens de winning.
- Na de uitputtende spoelen van de-de gesteven biomassa, plaats de theezakjes in de kolom Soxhlet voor de extractie. Nr huls is vereist voor deze stap.
- Stel de Soxhlet reflux, met behulp van 95% ethanol en haal de monsters gedurende 24 uur.
- Verwijder de theezakjes uit de Soxhlet reactor en verspreid in een enkele laag op een plat lade.
- Laat de monsters een nacht drogen bij kamertemperatuur in een zuurkast.
- Rol de theezakjes en de terugkeer van de gedroogde biomassa originele streepjescode van anti-statische zakken.
Opmerking: De anti-statische zakken zijn efficiënt bij het verminderen van statische elektriciteit in de biomassa, verbetering van de rijeigenschappen. Als andere opslagopties worden gebruikt, kunnen aanvullende biomassa nodig zijn vanwege de biomassa vasthouden aan de zijkant van de opslaghouder. - Overdracht ten minste 50 mg van de gedroogde biomassa een barcode hopper (gebruik van meer materiaal is beter voor nauwkeurige dosering). Skunnen barcodes antistatische zakken en de stortbunker nauwkeurige sample volgen waarborgen.
- Hoppers lading op vaste wegen robot, met veel aandacht voor de volgorde van de monsters in de rekken. Laad genoeg reactor platen om alle monsters bevatten en selecteer de afgifte-protocol gebaseerd op het aantal gebruikte platen.
- Robot weegt 5 mg van de gedroogde monsters (± 0,3 mg) in zuurbestendig roestvrij staal 96-wells platen. Weeg 3 herhalingen van elk monster verdeeld rond de plaat aan een gelokaliseerde variaties te minimaliseren.
- Omvat 8 control biomassa monsters van een goed gekarakteriseerde biomassa standaardmateriaal teneinde assayprestaties volgen. Voor meerdere platen, zal het gebruik van meerdere standaard biomassa hoppers deeltjesgrootte drift veroorzaakt door zeven in de hoppers dan herhaald doseren cycli te minimaliseren.
Opmerking: In elke plaat, moeten er 24 monsters met 3 herhalingen, 4 blanks bestaande uit gedemineraliseerd water en enzymen, en 8 controls via de eerder gekarakteriseerde standaard biomassa. De 3 hoek putten van elk van de 4 hoeken van de plaat zijn gereserveerd voor de suiker normen. - Controleer leeg en suiker standaard putten voor de dolende biomassa deeltjes te verwijderen indien aanwezig.
- Voeg 250 gl gedeïoniseerd water aan elk putje en de platen afdichten met silicone lijm-backed polytetrafluorethyleen (PTFE) tape.
- Met behulp van een 1/8 "soldeerbout tip, doorboren de PTFE-tape aan elkaar stoom poort (117 in totaal) voor elke plaat. Gebruik een leeg bord gestapeld op afgedichte reactor plaat als een gids en het beperken PTFE-film beweging.
- Klem de platen goed af met 0,031 "dik glasvezelversterkt PTFE pakkingen (geperforeerd met gaten voor stoom poorten) tussen de platen en de lege borden op de boven- en onderkant van de stapel. Behandel de monsters via stoom reactor ingesteld op 180 ° C gedurende 17,5 min of andere temperatuur / tijd-combinaties op basis van gewenste ernst.
- Koel reactor platen 50 °; C door overstromingen met gedemineraliseerd water.
- Enzymatische versuikering
- Bereid een enzymatische versuikering oplossing bestaande uit 8% (v / v) enzymoplossing in 1,0 M natriumcitraat, pH 5,0. Bereid 5 ml per reactor plaat. Opmerking: Moet verdund worden moet worden bepaald op basis van activiteiten en eiwitgehalte van de specifieke voorraad enzymoplossing.
- Wanneer de platen zijn koel, centrifugeer ze in een swinging bucket rotor bij 1500 xg gedurende 20 min. Verwijder afdichting film. Opmerking: Deze platen zijn zwaar en de centrifuge specificaties moeten worden gecontroleerd op compatibiliteit.
- Voeg 40 ul van de 8% enzym voorraadoplossing aan elke well (70 mg enzym per gram biomassa).
- Verzegelt met nieuwe PTFE-tape. Plaats verzegelde plaat in magnetische plaat klem.
- Meng de monsters door omkeren (ten minste 15 maal) en incubeer bij 50 ° C gedurende 70 uur.
- Wanneer de versuikering heeft gesloten, meng door inversie en centrifuge de platen bij 1500 xg gedurende 20 min.
- Sugar Assay
- Bereid een reeks van 6 glucose en xylose gecombineerd kalibratienormen in 0,014 M citraatbuffer (pH 5,0) van 0 tot 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 en 0,75 mg / ml aanbevolen) en 0-,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 en 0,6 mg / ml aanbevolen) respectievelijk glucose en xylose.
- Bereid de glucose oxidase / peroxidase (goPod) en xylose dehydrogenase (XDH) reagens volgens de instructies in de kit.
- Met behulp van een pipet, verwijder 200 ul van vloeistof uit de 4 hoeken putten en rand putten grenzend aan de hoek putten (12 in totaal putten) van de reactor plaat.
- Met behulp van een pipet, afzien 180 ui gedeïoniseerd water aan elk putje van een 96-well polystyreen met vlakke bodem verdunning plaat. Geen water toe te voegen aan de 12 suiker standaard en hoek putten (verwijder deze tips bij gebruik van een 96-kanaals head).
- Met behulp van een pipet, afzien 180 ul goPod reagens aan elk putje van de glucose test platen.
- Met behulp van een pipet, afzien 180 ul XDH reagens aan elk putje van de xylose assay plaat.
- Met behulp van een pipet 20 ul hydrolysaat fracties van de 96-well reactor plaat om de verwatering plaat. Pipet uit het bovenste gedeelte van de putten biomassa vaste stoffen en restvloeistof in de hoek putjes voorkomen. Meng door trituratie ten minste 10 cycli.
- Met behulp van een pipet 110 ul van suiker normen, in tweevoud, op de hoek putjes van de verdunning plaat.
- Met behulp van een pipet 20 pi fracties van de verdunning plaat om de glucose en xylose assay platen. Meng door trituratie.
- Incubeer glucose en xylose testplaten bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Breken elk oppervlak luchtbellen zorgvuldig voor te lezen. Een warmte kanon even over het oppervlak van de plaat werkt goed.
- Met behulp van een ultraviolet / zichtbare 96 putjes plaatlezer, stellen de gemeten golflengte 510 nm en noteer de absorptie tegen een blanco reagens.Deze meting bewaakt de vorming van quinonimine, dat evenredig is aan glucoseconcentratie. De glucoseconcentratie wordt berekend uit de kalibratiecurve gebaseerd op de calibratiestandaarden bereid in 1.3.1.
- Met behulp van een ultraviolet / zichtbare 96 putjes plaatlezer, stellen de gemeten golflengte 340 nm en noteer de absorptie. Deze meting bewaakt de reductie van NAD + tot NADH, die evenredig is met xylose concentratie. De xylose concentratie wordt berekend uit de kalibratiecurve gebaseerd op de calibratiestandaarden bereid in 1.3.1.
2. High-throughput Bepaling van Total en Lignine Lignine Monomeer content met behulp pyMBMS 28
- Monstervoorbereiding
- Slijpen en haal de biomassa met behulp van de in de stappen 1.1.1 en 1.1.6-1.1.8 beschreven methoden. Dit geldt ook voor het slijpen en het extraheren van een set van standaarden als experimentele controles gebruiken.
Opmerking: De pyMBMS MEASURements zijn niet deeltjesgrootte afhankelijk, dus als alleen met behulp van de pyMBMS protocol, moet de voorbereiding van biomassa worden uitgevoerd om het monster te passen in de monsterhouder, <4 mm. - Met een kleine spatel afgifte ongeveer 4 mg (3 tot 5 mg de voorkeur) van de bereide biomassa in een 80 ui roestvrijstalen beker ontworpen voor de autosampler.
- Zorg ervoor dat ten minste 10% van de monsters geanalyseerd zijn controlenormen zoals die verkrijgbaar bij de National Institute of Standards and Technology (suikerriet bagasse-8491; populieren-8492; pine-8493, of stro-8494). De standaard kan ook elke soort analoog aan de te analyseren monsters reeds gekarakteriseerd met behulp van standaard werkwijzen.
- Willekeurig laden van de monsters in de auto-sampler bekers met een pincet om vertekening te vermijden wegens mogelijke spectrometer drift in de tijd. Noot: een randomisatie van de monsters zou de meting van alle samples eenmaal, gevolgd door een re-randomisatie omvattenvan de orde van de monsters een duplicaat metingen. Randomisatie programma's zijn online beschikbaar.
- Met behulp van een standaard perforeren, handmatig glas filter discs van het type A / D glasvezel platen, zonder bindmiddel. Houd de ronde glasvezel filter met een pincet, centreren het over het monster cup, en duwen in het monster met behulp van een 3,5 mm inbussleutel om het materiaal in elke kop tijdens het experiment te beperken.
- Slijpen en haal de biomassa met behulp van de in de stappen 1.1.1 en 1.1.6-1.1.8 beschreven methoden. Dit geldt ook voor het slijpen en het extraheren van een set van standaarden als experimentele controles gebruiken.
- Instrumental Protocol
- Kalibreer de massa spectrometer met een bekende standaard die piekintensiteiten over het gehele bereik van verbindingen die kunnen bestaan voor de experimentele monsters over. Voor typische biomassa monsters gebruiken perfluortributylamine (PFTBA).
- Stel het draaggas helium debiet 0,9 l / min onder toepassing van een gasmeter.
- Stel de autosampler oven om een pyrolysetemperatuur van 500 ° C en de interface temperatuur 350 ° C via de autosampler software. Opmerking: een 1/8 "RVS verwarmdtransportleiding verpakt in verwarmingsband dat de autosampler verbinding met de massaspectrometer wordt via een warmte-controller bij 250 ° C.
- Begin data-acquisitie op de massaspectrometer en wacht ten minste 60 seconden om voldoende gegevens voor de achtergrond spectra collectie te verkrijgen.
- Start de automatische autosampler methode met de specificaties van 2.2.2. Opmerking: de auto-sampler daalt elk monster afzonderlijk in de auto-sampler oven. De totale data acquisitie is ongeveer 1,5 min; echter, pyrolyse van een typische 4 mg monster voltooid na 30 sec.
- Recordbedrag iongehalte (TIC) van elk monster met behulp massaspectrometer software op scansnelheid 0,5 sec. Neem intensiteiten tussen m / z 30-450.
Opmerking: Typische biomassa verbindingen gebruik zachte ionisatie op 17 eV. Het instrument kan grotere intervallen vanaf m / z 1 opnemen op 1000; zal echter scansnelheid worden beperkt door de computer CPU-kracht. - Verwijder de achtergrond van de spectra met behulp van de malijkse verbeteren functie in de software. Opmerking: gedeelte van de basislijn aan het begin van de gegevensverzameling A 60 scan wordt gebruikt om een gemiddelde achtergrondwaarde te berekenen. Dit gemiddelde achtergrondspectra wordt uit het experimentele monster spectra automatisch in de massaspectrometer software.
- Importeren enkele kolom tekstbestand door de massaspectrometer software die de spectrale gegevens voor elk monster in een databaseprogramma breiden en alle monsters in een gegevensbank. Voeg eventueel van toepassing metagegevens naar de spreadsheet. Importeer de opgemaakte gegevens (spreadsheet / CSV-bestand) in een statistisch softwarepakket en betekenen normaliseren van de spectra om rekening te houden met variatie in de gepyrolyseerde monster massa.
- Gebruik een statistisch softwarepakket a principal component analysis (PCA) uitvoeren met het spectrale gegevens groepering van de gerepliceerde standaardmonsters gebruikt bij de metingen analyseren en te evalueren welke pieken integraal indeling van chemische zijnverbindingen in de belasting 28 te plotten.
Opmerking: PCA groepen de monsters op basis van de gelijkenis van hun spectra en maakt een controle van de normen experimentele fout meten vanwege instrument drift tijdens de run. - Om de lignine syringyl (S) / guaiacyl (G) verhouding berekenen som van de gebieden van de S pieken (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 en 210) en delen door de som van G pieken bij 124, 137, 138, 150, 164 en 178.
- Om de totale lignine-gehalte te berekenen, tel de lignine pieken met m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194 en 210.
- Berekenen van een correctiefactor voor het schalen van de pyMBMS meting om een standaard methode voor het schatten van de totale lignine, zoals Klason lignine. Verdeel de Klason lignine waarde van de individuele norm door het totale ligninegehalte gemeten die standaard monster met behulp pyMBMS.
- Pas deze correctiefactor al like-soorten in de dataset. Herhaal dit voor elk type biomassa geanalyseerd. Noot: De correctiefactor kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van de S / G van de biomassa geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gecombineerde effect van de thermochemische voorbehandeling en daaropvolgende enzym versuikering wordt gemeten als een functie van de massa van glucose en xylose vrijgegeven op het einde van de test. De resultaten worden in termen van mg glucose en xylose vrijkomt per gram biomassa. Dit staat in schril contrast met gerapporteerde gegevens van bench-scale testen die gewoonlijk wordt gerapporteerd als percentage theoretische opbrengst gebaseerd op analyse van de samenstelling van het uitgangsmateriaal. Omdat het nog niet praktisch samenstelling analyse op duizenden monsters per week, worden gegevens best gerapporteerd als omzettingen op massabasis. Dit maakt redelijk monster evaluatie zolang de vergelijkingen worden gemaakt tussen nauw verwante monsters van biomassa en de samenstelling van de monsters niet te veel verschillen.
Het primaire doel van de test is om de relatieve verschillen in weerstand van de plantencelwand gecombineerde thermochemische / enzym evaluerenATIC versuikering een heel scala van individuele varianten. Het is vermeldenswaard dat de test niet proberen om alle van de voor versuikering te optimaliseren. In feite, voorbehandeling ernst omstandigheden aanzienlijk suboptimaal om de gevoeligheid van de assay te breiden, gericht op een uiteindelijke conversie opbrengst van 50% tot 70% van de theoretische. Voorbehandelingsomstandigheden op of bij optimale zouden alle monsters duwen om hoge omzetting, sterk verkleinen van het dynamisch bereik van de assay. Omgekeerd enzymlading veel groter is dan die typisch gerapporteerd voor bench-schaal digesties. Wederom is het doel van de methode is de beste enzym niet te vinden of het enzym te minimaliseren, maar de intrinsieke weerspannigheid van de celwanden meten conversie en gebruik van grote enzymladingen verwijdert variabiliteit van het assay.
Tenslotte is het belangrijk te begrijpen dat de variabiliteit in het algemene assay aanzienlijk hoger dan die gerapporteerd voor bench-schaal werken. Typische standaard fouten zijn ongeveer 8%, hoewel het bereik is veel breder. Dit is gewoon de aard van de kleinschalige, HTP onderzoek. Pipetteren en een gewicht van fouten zijn verhoudingsgewijs hoger bij de ui en mg schaal, net als door verdamping en condensatie verliezen. Biomassa heterogeniteit wordt een zeer groot variabeler testen enkele orden van grootte minder deeltjes in elk monster, dat wil zeggen, 5 mg versus meervoudige g. De colorimetrische assays toegepast om te bepalen glucose en xylose correleren met HPLC resultaten; Hoewel enzymgekoppelde assays voor suikeranalyse snel en kan in parallel worden uitgevoerd, zijn zij niet zo nauwkeurig als analytische methoden zoals HPLC, introduceren een andere laag van onnauwkeurigheid (figuur 1).
Vanwege alle bovenstaande overwegingen, moeten de resultaten alleen worden geïnterpreteerd en gerapporteerd binnen bepaalde beperkingen. De gegevens moeten worden onderzocht in het gehele sets, niet als individuele monsters. Herhalingen zijn vereist voor meaningful resultaten. Trends en uitschieters zijn zinvol, maar enkele resultaten niet. Vergelijkingen zijn best gedaan binnen enkele experimentele sets. Vergelijkingen tussen tijdelijk of ruimtelijk gescheiden campagnes vereisen zeer strenge controles en zorgvuldig onderzoek zinvol zijn. HTP gegevens niet direct vergelijkbaar met benchmarks of andere grootschalige data. Trends volgen tussen de HTP en andere schalen, maar directe monster vergelijkingen niet dezelfde resultaten op.
Datarepresentatie valt meestal in trends, uitschieters, of sub-populatie / variant vergelijkingen. Een voorbeeld van de trends is een overzicht van weerspannigheid van 755 natuurlijke varianten van populieren bemonsterd over een breed bereik in de Pacific Northwest van de Verenigde Staten 19. De weerbarstigheid van deze monsters werd uitgezet tegen hun lignine-gehalte en syringyl / guaiacyl verhouding zoals bepaald door pyMBMS. De resultaten geven aan dat als S / G stijgt, weerspannigheid af totdat een S / G-verhouding van ongeveer 2, waarbij de weerbarstigheid improvement niveaus (afbeelding 2). Uitschieters duidelijk te zien in figuur 3, waarbij de Pt4CL1 gen neerwaarts gereguleerd in populier. Honderden cultivars werden gescreend en een aantal duidelijk toegenomen in weerspannigheid, zoals blijkt uit de afgenomen suiker afgifte. Figuur 4 toont een onderzoek waarin verschillende tarwestro variëteiten werden gekweekt bij verschillende bezienswaardigheden dan twee jaar na oogst verschillende variaties groeiomstandigheden , resulterend in 20 verschillende populaties gebaseerd op combinaties van de bovengenoemde variabelen. Deze sample sets gemakkelijk onderscheiden en geven positieve en negatieve variabelen weerspannigheid. Figuur 5 toont hoe pyMBMS kan worden gebruikt om veranderingen in celwand compositie evalueren. Massaspectrale fragmenten worden toegewezen aan verschillende lignine monomeren (tabel 1). Wanneer een monster met hoge lignine vs. hoge gehalte aan koolhydraten te vergelijken, de verschillen in de spectrale gegevens zijn duidelijk. Thij gebruik van pyMBMS gegevens gekoppeld aan een principal component analysis (PCA) is weergegeven in figuur 6. In dit voorbeeld worden de monsters gerangschikt volgens lage of hoge stikstofbemesting. Lignine en koolhydraten inhoud lijn omgekeerd langs PC1. Het gebruik van de hoofdcomponent belastingen perceel kan helpen te bepalen welke chemische eigenschappen worden uiteengezet in de scores classificatie plot, evenals verhelderend welke eigenschappen veranderen tussen het monster clusters.
Figuur 1: Vergelijking van glucose en xylose kwantificatie met behulp van high-throughput colorimetrische assays vs. HPLC 9. Vergelijking van glucose en xylose detectie werd uitgevoerd met xylose dehydrogenase (XDH, bovenste paneel) en glucose oxidase / peroxidase (goPod, onderste paneel) high-throughput colorimetrische enzymgekoppelde assays en krachtige liquid chromatografie.
Figuur 2: weerspannigheid van populier celwanden als functie van syringyl (S / G) in lignine 9 guaiacyl verhogen van de weerbarstigheid van populieren celwanden als functie van syringyl (S / G) in de lignine fractie guaiacyl heeft. waargenomen en gerapporteerd. 755 populieren kern monsters van hetzelfde populier cultivar werden overgenomen paar honderd mijl van bos in de Noord-Amerikaanse Pacific Northwest en gescreend op glucose en xylose vrijlating na thermochemische voorbehandeling en enzym versuikering. De resultaten werden uitgezet tegen de S / G-verhouding in de celwand lignine zoals bepaald door pyMBMS. Weerbarstigheid afneemt met toenemende S / G tot ongeveer 2, waarbij deze constant bij hogere S / G blijft. Theoretische opbrengst waarden zijn gebaseerd op de BESC "standaard" populier en gelden als reference ter vergelijking.
Figuur 3:. Weerspannigheid in-down gereguleerd Pt4CL1 meningsuiting in populier Beneden-regeling van de Pt4CL1 gen in populier resulteerde in weinig variatie in de celwand weerspannigheid tussen klonen echter meerdere drastisch toegenomen weerspannigheid varianten zijn gemakkelijk te herkennen. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.
Figuur 4: weerspannigheid in diverse Wheatstraw populaties De effecten van het type cultivar, plaats van de teelt, bemesting en water geven resultaat tarief in duidelijk te onderscheiden weerspannigheid niveaus.. Verschillende symbolen vertegenwoordigen different experimenteel groeiomstandigheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Toepassing van pyMBMS voor de analyse van chemische veranderingen in plantaardige celwanden 28 De pieken aangegeven met pijlen zijn ligninefragmenten, en werden gebruikt om (a) hoog lignine (b) medium lignine of (c) lage lignine evalueren.
Figuur 6:. Belangrijkste component analyse scores plot van de verschillen in de celwand chemie van dichtbevolkte bomen begroeid met hogere en lagere bemesting tarieven 28 (Top) Belangrijkste component analysescores plot toont een duidelijke indeling en dus verschillen in de celwand chemie van dichtbevolkte gegroeide bomen bij hogere en lagere bemestingsdoseringen. Hoofdbestanddeel 1 gepartitioneerd de monsters op basis van hogere lignine (negatief) of hoger koolhydraten (positief) inhoud. (Onder) Het belangrijkste belastingen component toe te lichten die chemische componenten veranderen tussen de twee clusters van monsters in de scores plot. De positieve ladingen correleren met de positieve scores die representatief hogere gehalten koolhydraat zijn, terwijl negatieve correlatie beladingen sluiten negatieve scores en derhalve hoger ligninegehalte.
| m / z | Moleculaire opdracht 30 | S / G / H werkstuk |
| 94 | fenol | S / G / H |
| 120 | Vinylfenol | H |
| 124 | Guaiacol | G |
| 137 | Ethylguaiacol, homovanillin, coniferyl alcohol | G |
| 138 | Methylguaiacol | G |
| 150 | Vinylguaiacol | G |
| 154 | Syringol | S |
| 164 | Allyl- + propenyl guaiacol | G |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | S |
| 168 | 4-Methyl-2,6-dimethoxyfenol | S |
| 178 | Coniferyl aldehyde | G |
| 180 | Coniferylalcohol, syringylethene | S, G |
| 182 | Syringaldehyde | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
Tabel 1:. Peak m / z en opdrachten voor lignine afgeleide pyrolyse fragmenten zoals gedetecteerd door massaspectrometrie Lijst van typische verbindingen gedetecteerd door pyMBMS. Moleculaire opdrachten gebaseerd op Evans, RJ en TA Milne (1987). Moleculaire karakterisatie van de pyrolyse van biomassa Energy Fuels en 1 (2):. 123-137.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste monstervoorbereiding stappen voor het verkrijgen van nauwkeurige en reproduceerbare gegevens bij het uitvoeren van high-throughput screening experimenten zijn als volgt:
Sugar afgifte test:
In het algemeen worden monsters in partijen variëren van enkele tientallen tot enkele duizenden tegelijk. Elke belangrijke stap wordt gewoonlijk uitgevoerd voor alle monsters vóór vooruit om variaties tussen monsters bereiding te minimaliseren. De-stijven was oorspronkelijk geen deel uit van het protocol en kan worden weggelaten in bepaalde gevallen. Houten kern monsters en senesced kruidachtige materialen zijn constant laag in zetmeel, en dus niet nodig de-stijven de variabiliteit te verminderen. Zetmeel is een belangrijk punt van zorg; Echter, in de steekproef sets van groene weefsel planten, vooral voor grote sample sets, waar de oogst plaatsvindt over meerdere uren. Zetmeel stijgen overdag en zijn uitgeput in het donker, kan zetmeel niveaus aanzienlijk variëren several h en glucose uit zetmeel is niet te onderscheiden van glucose uit cellulose, dus hoog zetmeelgehalte niveaus kunnen leiden tot vervormd laag weerspannigheid metingen. De werkelijke enzymlading in destarching stap van ondergeschikt belang, zolang er voldoende overmaat activiteit alle toegankelijke zetmeel binnen het tijdskader van het zetmeel hydrolysestap verwijderen. Variaties in de specifieke enzymen gebruikt, tijd, temperatuur, volume en roersnelheid van de zetmeel-verwijderingsstap kan zeker leiden tot verschillen zetmeel verwijdering niveaus en tarieven en moet empirisch worden bepaald wanneer mogelijk. Tot slot, wanneer het verpakken van de theezakjes voor de winning, gebruiken-tin beklede koperdraad. Bare koperdraad kan ongewenste chemische reacties veroorzaken met het enzym oplossing, waardoor valse suiker waarden. Tin-gecoate koper opgelost deze kwestie, terwijl roestvrij staaldraad niet kneedbaar genoeg om de theezakjes goed gesloten houden.
Consistente size-reductie van de biomassa is essentieel voor accusnelheidsgegevens om twee redenen: 1) Fijn gemalen biomassa, terwijl gemakkelijker en consistent afgegeven, is ook makkelijker te verteren dan grover materiaal. 2) Biomassa die te grof kan verstoppen de hoppers, waardoor onvoldoende materiaal of, indien de klomp slechts ten dele blokkeren van de opening, kan het fungeren als een zeef en staan alleen fijne deeltjes door, verminderen de waargenomen weerspannigheid van het monster. Als te weinig biomassa in de hoppers, omsluiten zij de zijkanten van de bak, waardoor de robot aan de hopper veronderstellen leeg en het monster wordt overgeslagen in het afgifte proces. Bovendien kunnen lage biomassa bij aan overdreven sample heterogeniteit name dichtere deeltjes (bijvoorbeeld zwoerd) vaak zeef op de bodem van de kegel en worden eerst afgegeven. Wanneer minder dan 50 mg materiaal beschikbaar is, kan de test nog steeds worden uitgevoerd; echter dient de monsters hand gewogen worden. De resultaten van kant-weging variabeler dan die van robotic wegen.
De werkelijke hoeveelheid biomassa die nodig is voor de voorbereidende stappen is niet goed gedefinieerd. We hebben voorgesteld 250 mg als een redelijk uitgangspunt echter elk biomassa monster vertoont verschillende eigenschappen met betrekking tot verliezen door het hanteren, het malen en extraheren en wordt gehouden in de hoppers of worden afgegeven reproduceerbaar. De heterogeniteit van biomassa over soorten en zelfs binnen hetzelfde type zich verzet tegen een bepaald protocol. Degenen die deze testwerkwijzen uitvoering simpelweg moeten veel van deze variabelen zelf bepalen, maar ervaring maakt het makkelijker.
Een andere stap die fouten kan introduceren is het mengen in microtiterplaten, die notoir moeilijk en is essentieel in deze assays om verschillende redenen. De enzymoplossing gebruikt wordt geconcentreerd en kan worden gestratificeerd na toevoeging aan de putjes, enzym toegankelijkheid van de biomassa. Zoals versuikering opbrengst, de sugars bezit ook stratificeren en concentreren nabij de biomassa en afhankelijk van de bemonsteringsdiepte kan suiker assays kunstmatig hoog of laag zijn. Daarom is het essentieel om monsters te mengen na toevoeging van enzym en enzym versuikering, zodat grondig mengen van de enzymen met de biomassa voor nog versuikering en uniforme verdeling van de resulterende suikers om consistente suikeranalyse. In platen die geen biomassa bevatten, zoals verdunning of assay platen, mengen door herhaalde pipetteren (aanwrijven) heeft bewezen veel beter dan schudden te zijn. Echter, als oplossingen in dit protocol hebben een variabele dichtheid en deeltjes niveaus, pipetteren snelheid en verticale tip locatie in de vloeistof kolom is van cruciaal belang. Als de snelheid te snel, slechte nauwkeurigheid als gevolg van cavitatie (aspiratie) en vloeibare retentie in de punt (doseren) kan optreden. Als de tip te diep in de put, kan de biomassa tip verstoppen en de punt kan worden gedrukt naar de bodem, waardoor accurate aspiratie, en ermeer buitenoppervlak voor vloeibare vasthouden aan en overdracht naar de volgende stap. Het laatste probleem kan enigszins worden verzacht door controle van de tip terugbeweegsnelheid, tragere tip verwijdering van vloeistof mogelijk worden verwijderd om de bulkoplossing door oppervlaktespanning. Als tip terugtrekking is te traag, kan gepipetteerd vloeistof terug in de bulk oplossing kruipen ook. Biomassadeeltjes hebben ook de neiging om vast te houden aan de uiteinden en wordt overgebracht naar de verdunning plaat, waar de punt verstoppen tijdens het mengen of overdracht naar testplaten, waardoor onnauwkeurigheden in monstervolumes geanalyseerd. Deze deeltjes kunnen ook interfereren met de spectroscopische analyse van de testplaten als ze verstoppen de lichtstraal tijdens het lezen.
Consistente kleuren ontwikkeling timing is essentieel voor goPod en XDH assays. De kleur-ontwikkeling moet worden toegestaan om te gaan tot voltooiing; Echter, de goPod assay kleur neigt te blijven stijgen na voltooiing en de NADH gegenereerd door de XDH test langzaamafneemt als gevolg van spontane oxidatie van de NADH. Hierdoor timing variabiliteit kan leiden tot inconsistente vergelijkingen van gegevens tussen de afzonderlijke platen. De test stappen moeten zorgvuldig worden gecontroleerd, als werkonderbrekingen als gevolg van hardware of software problemen kunnen leiden tot grote verschillen in de test tijden. Het gebruik van standaarden suiker en standaard biomassa controleputjes op elke plaat kan helpen verzachten deze enigszins.
PyMBMS:
Normen moeten zorgvuldig worden overwogen voor pyMBMS experimenten ter vergelijking met standaard natte chemische methoden. Door de verschillende lignine samenstelling (S / G-verhoudingen) van biomassa species dient de correctiefactor bepaald met een representatief standaard die dezelfde soort als het experimentele monster. Als er geen geschikte standaard beschikbaar zijn, kunnen de verschillen in lignine concentratie worden vergeleken met behulp van de intensiteiten van de lignine voorlopers direct. Hoge S / G ratio (meer dan ~ 3.5) kan leiden tot een overschatting van de lignin inhoud door pyMBMS. Dit wordt veroorzaakt door de neiging van S lignine voorkeur worden vrijgegeven onder standaardomstandigheden gebruikt in deze werkwijze. Bovendien is de hoeveelheid monster vereist pyMBMS metingen is afhankelijk van het type gebruikte biomassa. Geïsoleerde lignine en lignine modelverbindingen vereist minder materiaal (0,1 mg), het gebruik van grotere hoeveelheden van het monster kan de detector verzadigen.
Een andere belangrijke stap in het proces is PyMBMS zorgvuldige afstemming van instrument naar een bekende standaard, zoals perfluortributylamine (PFTBA) voor elk experiment. PFTBA bevat moleculaire pieken over het hele spectrum van de typische biomassa en daarom maakt uniforme afstemming tussen experimentele runs. Het middengebied van de PFTBA spectra wordt afgesteld zodat m / z 131 en m / z 219 ongeveer 50% van de intensiteit van m / z 69. Deze afstemming wordt gebruikt typische pieken die onder zachte ionisatie versterken (17 eV) gebruikt fragmentatie van ionen minimaliseren lagere massa's die c annot gemakkelijk worden geïdentificeerd.
Opgemerkt wordt dat deze werkwijzen niet analysemethoden voor nauwkeurige kwantificatie van analyten. Integendeel, deze high-throughput technieken voor het screenen van grote biomassa bevat die bezitten de gewenste chemische eigenschappen te identificeren. Deze methoden mogen alleen worden gebruikt voor het screenen, ranking, en correlatie van de monsters binnen een dataset. Datasets niet worden vergeleken wanneer verzameld op verschillende dagen vanwege variatiebronnen zoals instrumentele drift, veranderingen in enzymactiviteit, omgevingsvochtgehalte in de biomassa door veranderingen in vochtigheid, temperatuurschommelingen, en verschillen in tips en absorptie plaat percelen . Bovendien, de voorbehandeling gebruikt bij de monsterbereiding protocol niet geoptimaliseerde voorbehandeling strategie, maar is speciaal ontworpen suboptimaal zijn. Hierdoor subtiele verschillen tussen de planten efficiënter te worden toegelicht.
jove_content "> Het belangrijkste voordeel van goedkeuring high-throughput methode is dat veel meer monsters kunnen worden gemeten in dezelfde periode 18. Bijvoorbeeld, een gemeenschappelijke methode voor het analyseren van koolhydraten geproduceerd gedurende een zure of enzymatische versuikering is het gebruik van high-performance vloeistofchromatografie (HPLC). Selig et al. stellen dat de alomtegenwoordige tweestaps zure hydrolyse, hoewel vrij nuttig en essentieel voor het kwantificeren van structurele koolhydraten, beperkt onderzoekers in staat om ongeveer 25 samples per week 9 geëvalueerd. Terwijl de analytische instrumentatie gebruikt in high-throughput methodologieën mag niet over gevoeligheid van een standaardtechniek zoals HPLC, de snelle analyse biedt onderzoekers de luxe kunnen grote hoeveelheden monsters te beoordelen. Bovendien vaak high-throughput werkwijzen experimentele protocollen verkleind, vermindering van het gebruik van verbruiksgoederen, en dus dalende experimentele kosten en afval.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
- Henry, R.
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M.
- Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A.
