Introduction
Som det globale tilbudet av ikke-fornybare energikilder og tilhørende produkter avtar, har forskere blitt utfordret til å lage lignende drivstoff og kjemikalier fra plante-avledet kilder 1. En sentral del av dette arbeidet er å avgjøre hvilke arter av planter kan være egnet for produksjon av biodrivstoff og biomaterialer 2,3. Vanligvis blir disse råstoffene evaluert for lignin, cellulose, hemicellulose og innhold; samt deres mottakelighet for dekonstruksjon (recalcitrance) gjennom termisk, mekanisk og / eller kjemisk forbehandling med eller uten påfølgende enzym forsukring. Mer detaljerte analyser anvendes for å bestemme den spesifikke sammensetning av lignin og hemicellulose fraksjoner samt optimale enzymaktivitet nødvendig. Transgene modifikasjoner av planter som ikke egentlig besitter ideelle egenskaper for biokjemiske eller termokjemisk konvertering til ønskede råvarer har gitt forskere med en sterkt utvidet kilde til pottenential råstoff 4. Standard analysemetoder for å kvantifisere de kjemiske egenskapene til en plante, mens ganske nyttig for små prøvesettene, er uegnet for den hurtige screening av hundrevis eller tusenvis av prøver 5-7. HTP foreliggende fremgangsmåter er blitt utviklet for hurtig og effektivt å evaluere et stort antall varianter biomasse for forandringer i celleveggen recalcitrance til termokjemisk og / eller enzymatisk nedbrytning.
Det er viktig å forstå at HTP screeningsanalyser beskrevet heri er ikke konstruert for å maksimalisere omdannelse eller utbytte. Formålet er å bestemme relative forskjellene i den indre recalcitrance av beslektede biomasse prøver. Som et resultat av mange av analysemåten skiller seg fra de "typiske" biomasse konverterings analyser, der målet er å oppnå maksimal konverteringsfrekvens eller grad. For eksempel er nedre forbehandling alvorlighetsgraden og kortere enzymhydrolysetider anvendes for å maksimere avvikeskjeller mellom prøvene. I de fleste tilfeller, er relativt høye belastninger enzym anvendes for å redusere forskjellene som skyldes eksperimentelle variasjoner i enzymaktivitet, som kan forskyve resultatene betydelig.
Rapid teknikker for å bestemme sammensetningen av plantecellevegger og monomere sukker frigjorte følgende enzymatisk forsukring inkluderer robotikk, tilpasset, thermochemically kompatible 96-brønners plater, og modifikasjoner av standard laboratoriemetoder 8-11 og instrumentale protokoller, for eksempel vibrasjonsspektroskopi (infrarøde (IR), nær-infrarødt (NIR), eller Raman) og kjernemagnetisk resonans (NMR) 12-17. Disse metodene er nøkkelen til å isolere råstoff med høy cellulose eller lave lignin innholdet, eller de som forventes å gi den høyeste glukose, xylose, etanol, etc. Disse metodene har aktivert nedskalerte analyser som benytter mindre mengder biomasse og forbruksvarer, som fører til reduksjoner i eksperimentell bekostning 18 9, poppel 8,10, sukkerrørbagasse 8, og switch 8 har blitt evaluert ved hjelp av disse metoder HTP.
Total lignin og lignin monomersammensetningen er også ofte kvantifisert biomasse trekk. Reduksjoner i lignin-innhold har vist seg å øke den enzymatiske fordøyelighet av polysakkarider 19,20. Rollen som ligninet monomerisk forhold (ofte rapportert som syringylaldehyd / guaiacyl (S / G) innhold) spiller i dekonstruksjon av anlegget celleveggen er fortsatt under etterforskning. Enkelte rapporter har indikert at reduksjoner i S / GForholdet førte til økt glukose gir følgende hydrolyse 21, mens andre studier avsløre motsatt trend 19,22. Høy gjennomstrømming metoder for evaluering av lignin og dets monomerer omfatter vibrasjonsspektroskopi (IR, NIR, og Raman 23-26) kombinert med multivariat analyse, og pyrolyse molekylstråle massespektrometri (pyMBMS) 27,28.
Ved utvikling HTP metoder for screening biomasse, flere integrerte hensyn må tas i betraktning. Et sentralt aspekt er kompleksiteten av fremgangsmåten. Hva er den nødvendige ferdighetsnivå for teknikken? Kjemometriske analyser, for eksempel, krever spesielle ferdigheter for å konstruere, vurdere og vedlikeholde prediktive modeller. Standard metoder vise uønskede forberedende eller dataanalyse trinn eller ansette giftige reagenser. Utvikling av modellene er en kontinuerlig prosess hvor nye data blir innlemmet i modellen over tid for å øke modellens robusthet. En annen atskilligebeid er kostnadsbesparelser og redusert eksperimentelle analyse tider av den foreslåtte høy gjennomstrømming metoder. Dersom fremgangsmåten er ganske hurtig, men meget kostbare, kan det ikke være en mulig teknikk for mange laboratorier for å ta i bruk. Fremgangsmåtene illustrert i dette manuskriptet er varianter av standardiserte teknikker, modifisert til å forsterke gjennomstrømming evner. Disse protokollene kvantitativt måle biomasse trekk av interesse uten nødvendiggjør utvikling av prediktive modeller. Dette er en viktig egenskap av disse teknikkene, siden prediktive metoder, mens stille sterke korrelasjoner med standard analyser brukt til å utvikle modeller, er ikke så nøyaktig som faktisk måle mengden av interesse for prøvene. Mens de metoder som brukes er i hovedsak skalert ned versjoner av standard benk skala analysemetoder, er nøyaktighet og presisjon handlet for fart og gjennomstrømming. Stort sett er dette resultatet skyldes høyere feil i lite volum pipettering og veiing; samt økt srikelig heterogenitet som prøvestørrelsen er redusert. Mens store prøvesett kan bli vist og sammenlignes, må det vises særlig aktsomhet når du gjør sammenligninger mellom separate kampanjer og til resultater benk skala.
De mest tidkrevende trinn innebære fysisk manipulering av biomassen. Slipe prøver kan ta flere minutter per prøve, inkludert rengjøring ut møllen mellom prøvene. Manuelt lasting, lossing og rengjøring hoppers og fylling og tømming teposer og prøveposer er også svært arbeidskrevende. Mens hvert trinn kan ta et minutt eller mer, kan gjøre tusenvis av prøver ta mange timer eller dager. Robotene kan laste en typisk reaktor plate med biomasse i ca 3 til 4 timer eller 6 til 8 plater dag -1 robot -1. Denne situasjonen er avhengig av presisjons parametre brukt, så vel som typen og mengden av biomasse som skal testes. Fylling reaktorplater med vann, fortynnet syre eller enzym blir raskt utført ved hjelp av en væskehåndtering robot. PNybehandling av en plate stack (1 til 20 reaktor plater) tar mellom en og tre timer når montering, kjøle ned, og demontering er inkludert. Enzymhydrolysen tar 3 dager, og den sukkeranalyse krever ca en time av prep tid pluss 10 min per reaktor plate for å fullføre analysen, og lese resultatene. En ukentlig oversikt over fastsatt forbehandling og analyse dager plass til en rimelig arbeidsplanen, minimerer odd-timers og helge innsats for den menneskelige komponenten av analysen og gir mulighet for behandling ~ 800 til 1000 prøver per uke på en kontinuerlig basis. Den maksimale gjennomstrømning avhenger av flere faktorer, i hovedsak hvor mye maskinvare (roboter, reaktorer plater, etc.) og hvor mye "software" (dvs. bemanning) er tilgjengelig for å gjøre det manuelt arbeid. Den praktiske øvre grense er 2500 til 3000 samples / uke; krever imidlertid at produksjonen 7 dagers-en-ukers drift og flere student og teknikere. Til sammenligning ville 3.000 prøver av HPLC krever cirka 125 dager med sample analyse pluss ekstra arbeidskraft av manuelt veiing prøver i reaktorer og filtrering av prøver før analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Høy throughput Fastsettelse av glukose og Xylose Rentene Etter Enzymatisk forsukring 9,29
- Prøvepreparering (Sliping, De-stivelse, Utvinning, Forbehandling)
- Male i det minste 300 mg av hver prøve ved anvendelse av en biomasse Wiley mølle, slik at partiklene passerer gjennom en 20 mesh (850 pm) sikt. Overføring til anti-statiske zip-top poser (typisk bar-kodet) og registrere prøve informasjonen til strekkode database.
- Legg ca 250 mg eller mer av bakken biomasse fra anti-statisk pose til en nummerert (med blyant, ikke bruk blekk eller markør) te-pose, forsiktig rulle opp teposer, å være sikker på å brette endene over biomasse for å hindre tap under de-stivelse og utvinning.
- Pakk tepose lukkes med fortinnet kobbertråd. Spill tepose nummer for hver strekkodet prøve.
- Forberede de-stivelse enzymoppløsning fra kommersielle enzymer (typisk, 0,25% (v / v) glukoamylase (~ 1600 AGU / L) og1,5% (v / v) alfa-amylase (~ 2900 KNU-S / l) i 0,1 M natriumacetat (pH 5,0)). Forbered 16 ml per g bulk biomasse eller 500 ml per 120 tepose prøver. Note: Belastninger som er i stand til å fjerne stivelse fra bakke biomasse bør bestemmes empirisk ved testing for stivelse etter spaltning med et utvalg av enzym belastninger og forhold.
- I en plastbeholder, tilsett 16 ml av de-stivelse enzym løsning per 1 g av bulk bakken biomasse. For en satsvis de-stivelse-protokollen, tilsett 120 teposer i 500 ml av buffer-enzymoppløsning.
- Inkuber i en rystemaskin ved 55 ° C i 24 (± 4) hr, ved 120 rpm for å fjerne mulig stivelse.
- Etter de-stivelse inkubasjon skylles og suge biomasse i flere liter avionisert vann i 30 min. Gjenta denne fremgangsmåten ytterligere to ganger for fjerning av buffersalter som kan forårsake dunk (dannelse av gassbobler i den løsning som kan resultere i en plutselig og voldsom økning i nivået av oppløsningen og forårsaker varm væske etanol for å kaskadeut av reaksjonsbeholderen) under ekstraksjonen.
- Etter uttømmende skylling av de-stivet biomasse, plasser teposer inn i Soxhlet kolonnen for utvinning. Ingen fingerbøll er nødvendig for dette trinnet.
- Sett opp Soxhlet reflux, ved hjelp av 95% etanol og pakke prøvene i 24 timer.
- Fjern teposer fra Soxhlet reaktoren og spredt ut i et enkelt lag på en flat skuffen.
- Tillate prøvene å tørke over natten ved romtemperatur i et avtrekk.
- Rull teposer og returnere tørket biomasse til originale strekkode antistatiske poser.
Merk: anti-statiske poser er effektiv på å redusere statisk elektrisitet i biomasse, bedre kjøreegenskaper. Hvis det brukes andre lagringsmuligheter, kan ytterligere biomasse være nødvendig på grunn av biomassen klynger seg til den side av oppbevaringsbeholderen. - Overføre minst 50 mg av den tørkede biomassen til en strekkodet beholder (ved bruk av mer materiale er bedre for nøyaktig dosering). Skan strekkoder av anti-statiske poser og mottaker hopper for å sikre nøyaktig sample sporing.
- Last hoppers ut mot faste stoffer veiing robot, vier oppmerksomhet til rekkefølgen av prøvene i stativene. Legg i tilstrekkelig reaktorplater for å inneholde alle prøvene og velger dispenseringsprotokoll basert på antall plater som brukes.
- Robot veie 5 mg av de tørkede prøver (± 0,3 mg) i syrefast rustfritt stål 96-brønners plater. Vei med 3 replikater av hver prøve fordelt rundt platen for å minimere eventuelle lokaliserte variasjoner.
- Inkluderer 8 kontroll biomasse prøver av en godt karakterisert biomasse standard materiale for å spore analyseytelse. For flere plater, vil bruk av flere standard biomasse hoppers minimere partikkelstørrelse avdrift forårsakes av sikting i beholderne i løpet av gjentatte utleverings sykluser.
Merk: I hver plate, bør det være 24 prøver med 3 replikater, 4 emner bestående av avionisert vann og enzym, og 8 systemadmls, ved hjelp av tidligere karakteriserte standard biomasse. De 3 hjørne brønner i hver av de 4 hjørnene av platen er reservert for sukker-standarder. - Sjekk tomme og sukker standard brønner for villfaren biomasse partikler og fjern hvis det finnes.
- Tilsett 250 ul deionisert vann til hver brønn, og forsegle platene med silikonklebemiddel-støttet polytetrafluoretylen (PTFE) tape.
- Ved hjelp av en 1/8 "loddebolt spissen, pierce PTFE tape på hver damp port (117 totalt) for hver plate. Bruk en tom plate stablet på forseglet reaktor plate som en guide, og for å begrense PTFE film bevegelse.
- Klemme platene tett med 0,031 "tykke glassforsterket PTFE pakninger (pre-punched med hull for damp porter) mellom platene og tomme plater på toppen og bunnen av stabelen. Forbehandle prøvene ved hjelp av en damp reaktor innstilt på 180 ° C i 17,5 min, eller andre temperatur / tid kombinasjoner basert på ønsket alvorlighetsgrad.
- Cool reaktor platene til 50 °; C ved flom med deionisert vann.
- Enzymatisk forsukring
- Fremstille en enzymatisk forsukring oppløsning bestående av 8% (v / v) enzym-løsning i 1,0 M natrium-citrat, pH 5,0. Forbered 5 ml per reaktor plate. Merk: Fortynning nødvendig bør fastsettes basert på aktivitet og proteininnholdet i den spesifikke lager enzymet løsning.
- Når platene er kul, sentrifuger dem i en svingende spannrotor ved 1500 xg i 20 min. Fjern forsegling film. Merk: Disse platene er tunge og sentrifuger spesifikasjoner bør sjekkes for kompatibilitet.
- Legg 40 mL av 8% enzymstamløsning til hver brønn (70 mg enzym pr g biomasse).
- Tett med ny PTFE tape. Plasser forseglet plate i magnetisk plate klemmen.
- Bland forsiktig prøvene etter inversjon (minst 15 ganger), og inkuber ved 50 ° C i 70 timer.
- Når saccharification har konkludert, bland ved inversjon og sentrifuger platene på 1500 xg i 20 min.
- Sugar Analyse
- Forbered et sett av seks glukose og xylose kombinert kalibreringsstandarder i 0,014 M citratbuffer (pH 5,0) varierende fra 0 til 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65, og 0,75 mg / ml anbefales), og 0 til 0,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 og 0,6 mg / ml anbefales) for glukose og xylose, respektivt.
- Klargjør glukoseoksydase / peroxidase (GOPOD) og xylose dehydrogenase (XDH) reagenser i henhold til instruksjonene i kit.
- Ved hjelp av en pipette, 200 ul fjerne væske fra 4 hjørnebrønner og brønner kant som grenser til hjørne brønnene (totalt 12 brønner) i reaktoren plate.
- Ved hjelp av en pipette, dispensere 180 ul deionisert vann til hver brønn av en 96-brønners polystyren flatbunnet plate fortynning. Ikke tilsett vann til de 12 sukker standard og hjørne brønner (fjerne disse tipsene hvis du bruker en 96-kanals hode).
- Ved hjelp av en pipette, 180 ul dispensere GOPOD reagens til hver brønn av glukosen pl analysespiste.
- Ved hjelp av en pipette, 180 ul dispensere XDH-reagens til hver brønn av xylose analyseplaten.
- Ved hjelp av en pipette, overfør 20 pl hydrolysat alikvoter fra 96-brønners plate til reaktoren fortynningen plate. Pipette fra den øvre delen av brønnene for å unngå faststoffer og biomasse resterende væske i hjørnebrønner. Bland ved triturering i minst 10 sykluser.
- Ved hjelp av en pipette, overføres 110 ul av sukker standarder, i duplikat, til hjørne brønnene i fortynning plate.
- Ved hjelp av en pipette, overfør 20 pl aliquoter fra fortynningen platen til glukose og xylose analyseskålene. Bland ved gniing.
- Inkuber glukose og xylose analyseplatene ved romtemperatur i 30 minutter. Nøye bryte noen bobler før du leser. En varmepistol kort føres over overflaten av platen fungerer godt.
- Ved hjelp av en ultrafiolett / synlig 96-brønns plate leser, setter den målte bølgelengden til 510 nm og registrere absorbans mot en reagent blank.Denne målingen overvåker dannelsen av quinonimine, som er proporsjonal med glukosekonsentrasjonen. Glukosekonsentrasjonen beregnes ut fra kalibreringskurve basert på kalibreringsstandardene fremstilt i 1.3.1.
- Ved hjelp av en ultrafiolett / synlig 96-brønns plate leser, setter den målte bølgelengden til 340 nm og registrere absorbans. Overvåker Denne målingen reduksjon av NAD + til NADH, som er proporsjonal med xylose-konsentrasjonen. Den xylose-konsentrasjonen blir beregnet ut fra kalibreringskurven på grunnlag av kalibreringsstandardene fremstilt i 1.3.1.
2. Høy throughput Fastsettelse av Total Lignin og Lignin Monomerisk Innhold Bruke pyMBMS 28
- Prøvepreparering
- Grind og pakke biomassen ved hjelp av metodene beskrevet i trinn 1.1.1, og 1.1.6-1.1.8. Dette omfatter sliping og ekstrahering av et sett av standarder som skal brukes som forsøks kontroller.
Merk: pyMBMS Måltements ikke er partikkel-størrelsesavhengig, slik at hvis bare ved hjelp av pyMBMS protokollen, må biomassen fremstillingen utføres for å tillate prøven å passe inn i prøveholderen, <4 mm. - Ved hjelp av en liten spatel utleverings tilnærmet 4 mg (3 til 5 mg foretrekkes) av den fremstilte biomasse til en 80 ul av rustfritt stål cup konstruert for auto-sampler.
- Sørg for at minst 10% av prøvene blir analysert er standarder som de som er tilgjengelige fra National Institute of Standards and Technology (sukkerrørbagasse-8491, poppel-8492; furu-8493, eller hvete halm-8494). Standarden kan også være hvilken som helst art som er analoge til de prøvene som skal analyseres som allerede er blitt karakterisert ved bruk av standard metoder.
- Tilfeldig laste prøvene inn i auto-sampler kopper med pinsett for å unngå skjevhet på grunn av mulig spektrometer drift over tid. Merk: En typisk randomisering av prøvene vil inkludere måling av alle prøvene en gang, etterfulgt av en re-randomiseringav rekkefølgen av prøvene for måling av et duplikat. Randomisering programmer er tilgjengelig på nettet.
- Ved hjelp av en standard hulling, manuelt produsere glass filter plater fra typen A / D glassfiberplater, uten bindemiddel. Hold runde glassfiberfilter med pinsett, sentrere den over prøvekoppen, og skyv inn prøven ved hjelp av en 3,5 mm unbrakonøkkel for å begrense materialet i hver kopp under forsøket.
- Grind og pakke biomassen ved hjelp av metodene beskrevet i trinn 1.1.1, og 1.1.6-1.1.8. Dette omfatter sliping og ekstrahering av et sett av standarder som skal brukes som forsøks kontroller.
- Instrumental Protocol
- Kalibrere massespektrometer ved hjelp av en kjent standard som har toppintensiteter over hele spekteret av forbindelser som kan eksistere for de eksperimentelle prøvene. For typiske biomasseprøver, bruker perfluortributylamin (PFTBA).
- Still heliumbærergass strømningshastighet på 0,9 l / min ved anvendelse av en gass-strømningsmåler.
- Still auto-sampler ovn til en pyrolysetemperatur på 500 ° C og grensesnittet temperaturen til 350 ° C ved bruk av auto-sampler programvare. Merk: En 1/8 "rustfritt stål oppvarmetoverføringsledning innpakket i varmetape som kobler auto-sampler til massespektrometeret blir styrt ved hjelp av en varmekontroller ved 250 ° C.
- Begynn datainnsamling på massespektrometer og vent i minst 60 sekunder for å oppnå tilstrekkelige data for bakgrunnen spektra samling.
- Start automatiserte auto-sampler metode med spesifikasjonene fra 2.2.2. Merk: auto-sampler dråper hver prøve individuelt inn i auto-sampler ovn. Den totale datainnsamling tiden er ca 1,5 min; imidlertid, er pyrolyse av et typisk 4 mg prøve fullstendig etter 30 sek.
- Post total ion innhold (TIC) for hver prøve ved hjelp massespektrometer programvare på 0,5 sek scan rate. Rekord intensiteter mellom m / z 30-450.
Merk: Typiske biomasse forbindelser bruke myk ionisering ved 17 eV. Instrumentet kan ta opp større mellomrom fra m / z 1 til 1000; vil imidlertid scan rate være begrenset av datamaskinen CPU kraft. - Fjern bakgrunn fra spektra med manual forbedre funksjonen i programvaren. Merk: En 60 skanning del av basislinjen ved begynnelsen av datainnsamlingen er brukt til å beregne en gjennomsnittsbakgrunnsverdi. Dette gjennomsnittet bakgrunn spektra blir fjernet fra forsøksprøven spektra automatisk i massespektrometer programvaren.
- Importerer enkelt kolonne tekstfil opprettet av massespektrometer programvaren som inneholder de spektrale data for hver prøve, inn i en database program og kombinere alle prøvene inn i en database. Legg gjeldende metadata til regnearket. Importere de formaterte data (regneark / CSV fil) inn i en statistisk programpakke og mener normalisere spektra å ta hensyn til variasjon i pyrolyserte prøve massene.
- Bruke en statistisk programvarepakke for å utføre en prinsipal komponent analyse (PCA) ved hjelp av de spektrale data for å analysere gruppering av de replikerte standardprøver som brukes i målingene, samt for å evaluere hvilke topper er integrert i klassifiseringen av kjemiskeforbindelser i de belastninger plotter 28.
Merk: PCA grupper prøvene basert på likheten av deres spektra, og tillater en sjekk av standarder for å måle eksperimentelle feil på grunn av instrumentdrift under kjøringen. - For å beregne lignin syringylaldehyd (S) / guaiacyl (G) ratio, oppsummere områdene S topper (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, og 210) og dividere med summen av G topper ved 124, 137, 138, 150, 164, og 178.
- For å beregne det totale lignininnhold, sum lignin-toppene med m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, og 210.
- Beregne en korreksjonsfaktor for skalering av pyMBMS måling til en standard metode for beregning av total lignin, som Klason lignin. Fordel Klason lignin verdien av den enkelte standard med den totale lignin innhold målt for at standardprøve ved hjelp pyMBMS.
- Bruk denne korreksjonsfaktor for alle som arter i datasettet. Gjenta for hver type biomasse analysert. Note: kan Korreksjonsfaktoren varierer betydelig, basert på S / G av biomassen analysert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kombinerte virkning av termokjemisk forbehandling og etterfølgende enzym forsukring måles som en funksjon av massen av glukose og xylose frigjøres ved slutten av analysen. Resultatene er gjengitt i form av milligram av glukose og xylose frigitt per gram biomasse. Dette står i sterk kontrast til data rapportert fra benkskalaanalyser, som vanligvis rapporteres som prosent teoretisk utbytte basert på sammensetningsanalyse av utgangsmaterialet. Som det er ennå ikke praktisk å gjennomføre komposisjonsanalyse på tusenvis av prøver per uke, er data beste rapportert som konverterings nivåer på en massebasis. Dette gjør det mulig for rimelig prøven evaluering så lenge gjøres sammenligninger mellom nært beslektede prøver av biomasse og sammensetningen av prøvene ikke varierer for mye.
Det primære målet med analysen er å vurdere de relative forskjeller i motstand av anlegget celleveggen til kombinert termo / enzymatic saccharification tvers av en rekke individuelle varianter. Det er verdt å merke seg at analysen ikke forsøke å optimalisere noen av forholdene som brukes for forsukring. Faktisk forbehandling alvorlighetsgrad betingelser er vesentlig suboptimal for å utvide sensitiviteten området av analysen, rettet mot en endelig omdannelse utbytte på 50% til 70% av det teoretiske. Forbehandlingsbetingelser ved eller nær optimal ville presse alle prøver til høy omdannelse, i stor grad begrense det dynamiske området av analysen. Motsatt, er enzymet laste mye større enn det som vanligvis rapportert for benk-skala spaltninger. Igjen, er målet for metoden ikke å finne den beste enzym eller minimere kost enzymet, men for å måle den indre recalcitrance av celleveggene til omdannelse og ved hjelp av meget høye enzym ladninger fjerner variabilitet fra analysen.
Endelig er det viktig å forstå at variasjonen i den totale analysen er signifikant høyere enn det som er rapportert for bench-skala arbeid. Typiske standardfeil er rundt 8%, men utvalget er mye bredere. Dette er rett og slett innholdet i småskala, HTP forskning. Pipettering og veiefeil er proporsjonalt høyere ved ul og mg skala, som er fordamping og kondenserings tap. Biomasse heterogenitet blir en meget stor variabel når analysering av flere størrelsesordener mindre partikler i hver prøve, det vil si, 5 mg vs. multiple g. Den kolorimetriske analyser anvendes for å bestemme glukose og xylose korrelere godt med HPLC-resultater; imidlertid, mens enzymbundet analyser for sukkeranalyse er rask og kan utføres i parallell, er de ikke så presis som analytiske metoder så som HPLC, innføring av et annet lag av unøyaktighet (figur 1).
På grunn av alle de ovennevnte betraktninger, bør kun tolkes og rapportert innenfor visse begrensninger resultater. Data bør undersøkes i hele sett, ikke som enkeltprøver. Gjentak er nødvendig for meaningful resultater. Trender og uteliggere er meningsfylt, men enkelt resultatene ikke. Sammenligninger er best laget i enkle eksperimentelle sett. Sammenligninger på tvers av timelig eller romlig separert kampanjer krever ekstremt tette kontroller og nøye gransking for å være meningsfylt. HTP data er ikke direkte sammenlignbare med referanse eller annen skala data. Trender spore mellom HTP og andre skalaer, men direkte prøve sammenligninger gir ikke identiske resultater.
Data representasjon faller vanligvis i trender, utliggere, eller sub-populasjon / variant sammenligninger. Et eksempel på trender er en undersøkelse av recalcitrance av 755 naturlige varianter av poppel samplet over et bredt spekter i Pacific Northwest i USA 19. Recalcitrance av disse prøvene ble plottet mot deres lignininnhold og syringylaldehyd / guaiacyl forhold som bestemt ved pyMBMS. Resultatene tyder på at så S / G stiger, recalcitrance reduseres til en S / G-forhold på rundt 2, hvor recalcitrance improvement flater ut (figur 2). Utliggere kan tydelig ses på figur 3, hvor den Pt4CL1 genet ble nedregulert på poppel. Flere hundre sortar ble screenet og flere er tydelig økt i recalcitrance, som dokumentert av redusert sukker utgivelsen. Figur 4 viser en studie der flere forskjellige hvete-strå varianter ble dyrket på flere steder over to år og høst etter flere variasjoner i vekstbetingelser , noe som resulterer i 20 distinkte populasjoner basert på kombinasjoner av de ovennevnte variabler. Disse prøvesettene er lett skilles og indikerer positive og negative variablene for recalcitrance. Figur 5 viser hvordan pyMBMS kan brukes for å evaluere endringer i celleveggen sammensetning. Masse spektrale fragmentene er tilordnet ulike ligninprodukter monomerer (tabell 1). Når man sammenligner en prøve med høy lignin vs. høyt karbohydratinnhold, de forskjeller i de spektrale data er åpenbar. Than bruker av pyMBMS data kombinert med en hovedkomponentanalyse (PCA) er illustrert i figur 6. I dette eksempel ble prøvene klassifisert i henhold til lav eller høy nitrogengjødsling. Lignin og karbohydratinnholdet justere omvendt langs PC1. Bruken av de viktigste komponentbelastninger plott kan hjelpe til i å identifisere hvilke kjemiske egenskaper blir forklart i skårer klassifiseringen plottet, samt belyse hvilke egenskaper endrer seg mellom prøve klynger.
Figur 1: Sammenligning av glukose og xylose kvantifisering ved hjelp av high-throughput kolorimetriske analyser vs. HPLC 9. Sammenligning av glukose og xylose-påvisning ble utført ved å bruke Xylose dehydrogenase (XDH, øvre panel) og Glukose oksidase / peroksidase (GOPOD, nedre panel) high-throughput kolorimetriske assays enzymkoblede og høy ytelse lflytende hydro kromatografi.
Figur 2: recalcitrance av poppel cellevegger som en funksjon av syringylaldehyd til guaiacyl (S / G) innholdet i lignin 9 Økning av recalcitrance av poppel cellevegger som en funksjon av syringylaldehyd til guaiacyl (S / G) innhold i ligninfraksjonen har. blitt observert og rapportert. 755 poppel kjerneprøver av samme poppel sorten ble tatt over flere hundre miles av skog i nordamerikanske Pacific Northwest og skjermet for glukose og xylose meldingen etter termo forbehandling og enzymet forsukring. Resultatene ble plottet mot S / G-forhold på celleveggen lignin som bestemmes av pyMBMS. Recalcitrance avtar med økende S / G til ca 2, hvor den forblir konstant ved høyere S / G. Teoretiske verdier er basert på BESC "standard" poppel og er kun ment som en reference for sammenligning.
Figur 3:. Recalcitrance i nedregulert Pt4CL1 uttrykk i poppel Down-regulering av Pt4CL1 genet i poppel resulterte i liten variasjon i celleveggen recalcitrance mellom kloner, men flere drastisk økte recalcitrance varianter er lett identifiseres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: recalcitrance i ulike wheatstraw populasjoner Effektene av sorten type, åsted for dyrking, gjødslings, og vanning hastighet resultat i klart skjelnes recalcitrance nivåer.. Forskjellige symboler representerer different eksperimentelle vekstvilkår. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 5: Anvendelse av pyMBMS for analyse av kjemiske forandringer i plantecellevegger 28. Toppene som er merket med piler er lignin-fragmenter, og ble brukt for å evaluere (a) høy lignin (b) medium lignin eller (c) lavt lignininnhold.
Figur 6:. Principal Component Analysis score tomt på forskjeller i celleveggen kjemien i folkerike trær vokst med høyere og lavere befruktning priser 28 (Top) Prinsipal komponent analyseskårer plotte illustrerer en distinkt klassifisering, og derfor forskjeller i celleveggen kjemien i folkerike trær vokst med høyere og lavere befruktning priser. Principal komponent en partisjonert prøvene basert på høyere lignin (negativ) eller høyere karbohydrat (positive) innholdet. (Nederst) De viktigste komponent belastninger belyse hvilke kjemiske komponenter bytte mellom de to klynger av prøvene i score plottet. De positive ladninger korrelerer med de positive resultatet, som er representant for høyere karbohydratinnhold, mens negativt korrelert belastninger justere med negative resultater og dermed en høyere lignin innhold.
| m / z | Molecular oppdraget 30 | S / G / H oppdrag |
| 94 | fenol | S / G / H |
| 120 | Vinylfenol | H |
| 124 | Guaiacol | G |
| 137 | Ethylguaiacol, homovanillin, coniferyl alkohol | G |
| 138 | Methylguaiacol | G |
| 150 | Vinylguaiacol | G |
| 154 | Syringol | S |
| 164 | Allyl- + propenyl- guaiakol | G |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | S |
| 168 | 4-metyl-2,6-dimetoksyfenol | S |
| 178 | Coniferyl aldehyd | G |
| 180 | Coniferyl alkohol, syringylethene | S, G |
| 182 | Syringaldehyde | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
Tabell 1:. Peak m / z og oppdrag for lignin-avledet pyrolyse fragmenter som oppdages ved massespektrometri Liste over typiske forbindelser oppdages av pyMBMS. Molekylære oppdrag basert på Evans, RJ og TA Milne (1987). Molekylær karakterisering av pyrolyse av biomasse Energy Fuels og 1 (2).: 123-137.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigste prøveprepareringstrinn for å oppnå nøyaktige og reproduserbare data ved gjennomføring av high-throughput screening eksperimenter er som følger:
Sugar Slipp analyse:
Generelt blir prøvene fremstilt i masse som strekker seg fra noen titalls til flere tusen av gangen. Hver hovedtrinn utføres typisk for alle prøver før fremover for å minimalisere variasjoner i preparatet mellom prøver. De-stivelse ikke opprinnelig var en del av protokollen, og kan utelates i visse tilfeller. Wood kjerneprøver og senesced urteaktige materialer er gjennomgående lav i stivelse, og derfor ikke krever de-stivelse for å redusere variabilitet. Stivelse er et stort problem; men i prøve sett med grønne vev planter, spesielt for store prøvesett der innhøstingen skjer over flere timer. Som stivelse stiger på dagtid og er oppbrukt i løpet av mørket, kan stivelse nivåer variere betydelig over several h og glukose fra stivelse er umulig å skille fra glukose fra cellulose, derfor kan høy stivelse nivåer føre til distortedly lave recalcitrance målinger. Selve laste enzym i destarching trinnet er av mindre betydning, så lenge det er tilstrekkelig høy aktivitet til å fjerne alt tilgjengelig stivelse innenfor tidsrammen av stivelseshydrolysetrinnet. Variasjoner i de spesifikke enzymer som anvendes, tid, temperatur, volum og omrøringshastighet av stivelsen-fjerningstrinnet kan selvfølgelig føre til forskjeller i stivelsesfjerningsnivåer og priser og bør bestemmes empirisk når det er mulig. Til slutt, når innpakning teposer for utvinning, bruk fortinnet kobbertråd. Bart kobbertråd kan forårsake uønskede kjemiske reaksjoner med enzymet løsning, noe som gir falske sukkerverdier. Tin-belagt kobber løst dette problemet mens rustfritt stål wire var ikke formbare nok til å holde de teposene tett lukket.
Konsekvent størrelse-reduksjon av biomasse er kritisk til accuhastighetsdata for to grunner: 1) finmalt biomasse, mens lettere og konsekvent dispenseres, er også lettere å fordøye enn grovere materiale. 2) Biomasse som er for grovt kan tette beholderne, noe som resulterer i utilstrekkelig materiale eller, hvis den tette bare delvis å blokkere åpningen, kan den fungere som en sil og tillater kun fine partikler gjennom, å redusere den observerte recalcitrance av prøven. Hvis for lite biomasse finnes i de trakter, kan belegge det sidene av beholderen, forårsaker roboten til å anta beholderen er tom, og prøven vil bli hoppet i utleveringsprosessen. I tillegg kan små mengder av biomasse bidrar til å overdrevet prøve heterogenitet, særlig ettersom tettere partikler (for eksempel bark) har en tendens til å sile til bunnen av kjeglen og bli utlevert første. Når mindre enn 50 mg materiale er tilgjengelig, kan analysen likevel bli utført; imidlertid bør prøvene være hånd veies. Men resultatene av hånd-veie er mer variable enn de fra robotic veiing.
Den faktiske mengden biomasse som kreves for de forberedende trinnene er ikke godt definert. Vi har foreslått 250 mg som et fornuftig utgangspunkt, men viser hver biomasse prøve forskjellige egenskaper når det gjelder tap som følge av håndtering, sliping, og trekke ut så vel som blir holdt opp i traktene eller blir utlevert reproduserbart. Heterogeniteten av biomasse på tvers av typer, og selv innenfor samme type utelukker en mer definert protokoll. De som ønsker å implementere disse analysemetodene vil bare trenger å bestemme mange av disse variablene for seg selv, selv om erfaringen gjør gjøre det lettere.
Et annet trinn som kan innføre feil er å blande i mikrotiterplater, som er notorisk vanskelig og er kritisk i disse analyser av flere grunner. Enzymløsningen brukes er konsentrert, og kan være stratifisert ved tilsats til brønnene, begrensende enzym tilgjengelighet til biomassen. Som saccharification inntektene, det sugars løslatt kan også stratify og konsentrere nær biomasse og avhengig av sampling dybde, kan sukker analyser være kunstig høy eller lav. Dette er grunnen til at det er viktig å blande prøvene etter enzymtilsetning og forsukring enzym, som tillater grundig blanding av enzymer med biomassen for enda forsukring og jevn fordeling av de resulterende sukkerarter for å tillate konsistent sukkeranalyse. I form av plater som ikke inneholder biomasse, for eksempel fortynning eller analyseplater, og blanding ved gjentatt pipettering (finmaling) vist seg å være langt bedre enn risting. Imidlertid, som løsninger i denne protokollen har varierende tetthet og partikkelnivåer, pipetteringshastighet og vertikal spiss plassering i væskesøylen er kritisk. Hvis hastigheten er for fort, dårlig presisjon grunnet kavitasjon (aspirasjon) og væskeansamling i spissen (utlevering) kan forekomme. Hvis spissen er for dypt i brønnen, kan biomasse tette spissen eller tuppen kan bli presset til bunns, hindrer nøyaktig aspirasjon, og deter mer overflateområde for væske å klamre seg til, og overføring til det neste trinn. Sistnevnte problem kan avhjelpes noe ved kontroll spissen uttakshastigheten, som lavere spiss fjerning tillater væsken å bli fjernet til den samlede mengde oppløsning av overflatespenningen. Hvis spissen tilbaketrekking er for treg, kan pipettert væske krype tilbake i bulk løsning også. Biomasse partikler har også en tendens til å klynge seg til tips og bli overført til fortynning plate, der de kan tette spissen under blanding eller overføring til analyseplatene, og skaper unøyaktigheter i prøvevolumer som analyseres. Disse partikler kan også forstyrre den spektroskopiske analyse av analyseplater hvis de tilstoppe lysstrålen under lese.
Konsekvent fargeutvikling timing er avgjørende for GOPOD og XDH analyser. Fargen-utvikling må få lov til å gå til ferdigstillelse; imidlertid en tendens til at GOPOD analysen farge vil fortsette å stige etter ferdigstillelse og NADH som genereres av XDH assay langsomtavtar på grunn av spontan oksydasjon av NADH. Som et resultat, kan timing variabilitet føre til inkonsistente sammenligning av data mellom separate plater. Bør overvåkes analyse trinnene nøye, så stans på grunn av maskinvare eller programvare problemer kan føre til store forskjeller i analyse ganger. Anvendelsen av sukker standarder og standard biomasse kontrollbrønner på hver plate kan bidra til å redusere dette til en viss grad.
PyMBMS:
Standarder må vurderes nøye for pyMBMS eksperimenter for sammenligning til standard våtkjemimetoder. På grunn av den forskjellige lignin sammensetning (S / G-forhold) av biomasse arter, må korreksjonsfaktoren bli bestemt ved anvendelse av en representativ standard som er den samme art som den eksperimentelle prøven. Hvis det ikke finnes noen passende standard tilgjengelige, kan forskjeller i lignin-konsentrasjonen bli sammenlignet ved hjelp av de intensiteter av lignin-forløpere direkte. Høy S / G-forhold (over ~ 3,5) kan føre til overvurdering av lignin innhold ved pyMBMS. Dette er forårsaket av tendensen for S lignin som skal fortrinnsvis frigjøres under de standardbetingelser som brukes i denne fremgangsmåten. I tillegg er mengden av prøve som kreves for pyMBMS målinger avhenger av typen av biomasse anvendes. Isolerte lignin og lignin- modellforbindelser krever mindre materiale (0,1 mg), som ved hjelp av større porsjoner av prøven kan mette detektoren.
Et annet kritisk punkt i PyMBMS prosessen er forsiktig justering av instrumentet til en kjent standard som perfluortributylamin (PFTBA) før hvert forsøk. PFTBA inneholder molekylære topper over hele spekteret av typiske biomasse, og derfor lar uniform instrument tuning mellom eksperimentelle kjøringer. Den midtre del av PFTBA spektrene er innstilt slik at m / z 131 og m / z 219 er ca 50% av intensiteten av m / z 69. Denne innstilling blir brukt til å fremheve typiske topper sees under myk ionisering (17 eV) benyttet for å minimere fragmentering av ioner til lavere massene som c Annot lett identifiseres.
Det bør bemerkes at disse metodene ikke er analysemetoder for nøyaktig kvantifisering av analytter av interesse. Snarere disse high-throughput teknikker er for screening av store biomasse sett for å identifisere de som innehar de ønskede kjemiske egenskaper. Disse metodene bør bare brukes for screening, rangering, og korrelasjon av prøver innen et datasett. Datasett kan ikke sammenlignes direkte når oppsamles på forskjellige dager på grunn av kilder for variasjon som instrumental drift, endringer i enzymaktivitet, omgivelsesfuktighet i biomassen som følge av forandringer i luftfuktigheten, variasjoner i temperatur, og forskjeller i tips og absorbansen plate masse . I tillegg er forbehandling brukt i prøveopparbeidelse protokollen ikke en optimal forbehandling strategi, men snarere har blitt spesielt designet for å være sub-optimal. Dette gjør at små forskjeller mellom de planter som skal belyses mer effektivt.
jove_content "> Den viktigste fordelen med å vedta høy gjennomstrømming metoder er at mange flere prøver kan måles i samme periode 18. For eksempel, er en vanlig metode for å analysere karbohydrater produsert under en syre eller enzymatisk forsukring bruk av høy-ytelse væskekromatografi (HPLC). selig et al., tilstand som den allestedsnærværende to-trinns syrehydrolyse, men ganske nyttig og viktig for kvantifisering av strukturelle karbohydrater, begrenser forskere å være i stand til å evaluere ca 25 prøver per uke 9. Mens de analytiske instrumentering ansatt i high-throughput metoder kan ikke gi følsomheten til en standard teknikk som HPLC, gir rask analyse forskere luksusen av å være i stand til å vurdere store mengder prøver. I tillegg er de med høy gjennomstrømming metoder ofte har nedskalert eksperimentelle protokoller, redusere bruken av forbruksvarer, og derfor redusere eksperimentelle kostnader og avfall.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
- Henry, R.
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M.
- Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A.
