Introduction
A medida que la oferta mundial de combustibles no renovables y sus productos disminuciones asociadas, los científicos se han cuestionado para crear combustibles y productos químicos similares a partir de fuentes de origen vegetal 1. Un aspecto clave de este trabajo es determinar qué especies de plantas pueden ser adecuados para la producción de biocombustibles y biomateriales 2,3. Típicamente, estas materias primas se evalúan para la lignina, celulosa, hemicelulosa y el contenido; así como su susceptibilidad a la deconstrucción (recalcitrancia) a través de pretratamiento térmico, mecánico y / o químico con o sin posterior enzima de sacarificación. Análisis más detallados se usan para determinar la composición específica de las fracciones de lignina y hemicelulosa, así como actividades óptimas enzima necesaria. Modificaciones transgénicas de plantas que no poseen intrínsecamente características ideales para la conversión bioquímica o termoquímica a los productos básicos deseados han proporcionado a los investigadores con una fuente de gran expansión de la ollamaterias primas ciales 4. Los métodos analíticos estándar para la cuantificación de los rasgos químicos de una planta, mientras que muy útil para pequeños conjuntos de muestras, no son adecuadas para la detección rápida de cientos o miles de muestras 5-7. Los métodos descritos en este documento HTP se han desarrollado para evaluar rápida y eficazmente un gran número de variantes de biomasa para los cambios en la pared celular recalcitrante a la degradación termoquímica y / o enzimática.
Es fundamental entender que los ensayos de selección HTP descritos en este documento no han sido diseñados para maximizar la conversión o rendimiento. El objetivo es determinar las diferencias relativas en el recalcitrante intrínseca de muestras de biomasa relacionados. Como resultado, muchos de los pasos de análisis difieren de los ensayos de conversión de biomasa "típicos", donde el objetivo es obtener la máxima tasa de conversión o extensión. Por ejemplo, severidades de pretratamiento más bajas y tiempos más cortos de la enzima de hidrólisis se utilizan para maximizar diferircias entre las muestras. En la mayoría de los casos, las cargas relativamente altas de enzimas se utilizan para reducir las diferencias debidas a la variación experimental en la actividad enzimática, lo que podría alterar los resultados de manera significativa.
Técnicas rápidas para determinar la composición de la planta paredes celulares y los azúcares monoméricos liberados tras la sacarificación enzimática incluyen robótica,, placas de 96 pocillos termoquímicamente compatibles personalizados, y modificaciones de los métodos de laboratorio estándar 8-11 y protocolos instrumentales, como la espectroscopia vibracional (infrarrojos (IR), de infrarrojo cercano (NIR), o Raman) y resonancia magnética nuclear (RMN) 12-17. Estas metodologías son la clave para el aislamiento de las materias primas con alto contenido de celulosa o bajos de lignina, o los previstos para obtener el más alto de glucosa, xilosa, etanol, etc. Estos métodos han permitido a los análisis a escala reducida que emplean pequeñas cantidades de biomasa y consumibles, lo que lleva a la reducción de experimental costa 18 9, álamo 8,10, bagazo de caña 8, y el pasto varilla 8 se han evaluado con éxito el uso de estos métodos HTP.
Lignina total y la composición monomérica lignina también son comúnmente cuantificados rasgos de biomasa. Las reducciones en el contenido de lignina se ha demostrado que aumentar la digestibilidad enzimática de polisacáridos 19,20. El papel que la relación lignina monomérica (a menudo reportado como siringil / guayacil (S / G) contenido) juega en la deconstrucción de la pared celular vegetal es todavía bajo investigación. Algunos informes han indicado que las reducciones en la S / Grelación condujo a un aumento de los rendimientos de glucosa después de la hidrólisis de 21 años, mientras que otros estudios revelan la tendencia opuesta 19,22. Métodos de alto rendimiento para la evaluación de la lignina y sus monómeros incluyen espectroscopia vibracional (IR, NIR y Raman 23-26), junto con el análisis multivariado, y pirólisis espectrometría de masas de haz molecular (pyMBMS) 27,28.
En el desarrollo de métodos HTP para el cribado de la biomasa, varias consideraciones integrales deben mantenerse en mente. Un aspecto clave es la complejidad del método. ¿Cuál es el nivel de habilidad requerida para la técnica? Análisis quimiométricos, por ejemplo, requieren habilidades específicas para construir, evaluar y mantener modelos predictivos. Los métodos estándar exhiben pasos de análisis preparatorio o de datos indeseables o emplean reactivos tóxicos. Desarrollo de los modelos es un proceso continuo, donde los nuevos datos se incorpora en el modelo a través del tiempo para aumentar la robustez del modelo. Otra considración es el ahorro de costes y la disminución de los tiempos de análisis experimentales de los métodos de alto rendimiento propuestos. Si el método es bastante rápida, pero muy costoso, puede que no sea una técnica viable para muchos laboratorios a adoptar. Los métodos ilustrados en este manuscrito son variantes de técnicas estandarizadas, modificados para amplificar las capacidades de rendimiento. Estos protocolos miden cuantitativamente los rasgos de biomasa de interés sin necesidad de la elaboración de modelos predictivos. Este es un atributo clave de estas técnicas, ya que los métodos de predicción, mientras que exhiben fuertes correlaciones con el estándar de análisis utilizados para desarrollar los modelos, no son tan precisos como medir realmente la cantidad de interés para las muestras. Considerando que los métodos utilizados son esencialmente reducido versiones de los métodos estándar de análisis a escala de laboratorio, la exactitud y la precisión se negocian para la velocidad y el rendimiento. Sobre todo, este resultado se debe a errores mayores en pequeña pipeta de volumen y un peso; así como una mayor samplia heterogeneidad como tamaño de la muestra disminuye. Mientras que los grandes conjuntos de muestras pueden ser examinados y comparados, el gran cuidado debe ejercerse cuando se hacen comparaciones entre campañas separadas y con los resultados a escala de laboratorio.
Las mayoría de los pasos que consumen tiempo implican la manipulación física de la biomasa. Muestras de molienda puede tardar varios minutos por muestra, incluyendo la limpieza de la fábrica entre las muestras. Carga manual, la descarga, y tolvas de limpieza y llenado y vaciado de bolsas de té y bolsas de muestras también es muy intensivo en mano de obra. Si bien cada paso puede tardar un minuto o más, haciendo miles de muestras pueden tomar muchas horas o incluso días. Los robots pueden cargar un plato típico reactor con la biomasa en aproximadamente de 3 a 4 horas o 6 para placas de 8 días -1 -1 robot. Esta situación depende de los parámetros de precisión utilizados, así como el tipo y la cantidad de biomasa a ser probado. Llenar placas de reactores con agua, ácido diluido, o enzima se hace rápidamente usando un robot de manipulación de líquidos. Pretratamiento de una pila de placas (de 1 a 20 placas de reactores) tarda entre 1 y 3 horas cuando el conjunto, enfríe y desmontaje incluido. Hidrólisis enzimática tarda 3 días y el análisis de azúcar requiere alrededor de 1 hora de tiempo de preparación más 10 minutos por plato reactor para completar el ensayo y leer los resultados. Un programa semanal de establecidos días previos al tratamiento y análisis de capacidad para un horario de trabajo razonable, minimizando extraña horas y los fines de esfuerzos para el componente humano de la prueba y permite el procesamiento ~ 800 a 1000 muestras por semana de manera continua. El rendimiento máximo depende de varios factores, sobre todo de cómo están disponibles para hacer el trabajo manual tanto de hardware (robots, placas de reactores, etc.) y la cantidad de "software" (es decir, la dotación de personal). El límite superior práctico es 2500 a 3000 muestras / semana; sin embargo, que la producción requiere un funcionamiento 7 días a la semana y varios becarios y técnicos de los estudiantes. En comparación, 3.000 muestras por HPLC requerirían aproximadamente 125 días de samanálisis PLE más la mano de obra adicional de pesaje manualmente muestras en los reactores y las muestras de filtrado antes del análisis.
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Protocol
1. Alto rendimiento determinación de glucosa y xilosa rendimientos Siguiendo enzimática Sacarificación 9,29
- Preparación de la muestra (molienda, De-almidonado, extracción, tratamiento previo)
- Moler al menos 300 mg de cada muestra de la biomasa utilizando un molino Wiley, de tal manera que las partículas pasan a través de una malla 20 (850 micras) pantalla. Transferencia a zip-top antiestáticas bolsas (normalmente con código de barra) y la información de la muestra registro a la base de datos de código de barras.
- Añadir aproximadamente 250 mg o más de la biomasa aérea de la bolsa antiestática para una numerada (con lápiz, no use tinta o marcador) para bolsitas de té, cuidadosamente enrollar las bolsitas de té, asegurándose de doblar los extremos sobre la biomasa para prevenir pérdida durante de-almidonado y extracción.
- Envuelva la bolsita cerrada con alambre de cobre estañado. Anote el número de la bolsita de té para cada muestra con código de barras.
- Preparar solución de enzima-de almidonar de enzimas comerciales (típicamente, 0,25% (v / v) de la glucoamilasa (AGU ~ 1600 / L) y1,5% (v / v) de alfa-amilasa (~ 2.900 KNU-S / L) en acetato de sodio 0,1 M (pH 5,0)). Preparar 16 ml por g de biomasa a granel o 500 ml por 120 muestras bolsita de té. Nota: Las cargas capaces de eliminar el almidón a partir de biomasa de tierra deben ser determinadas empíricamente mediante pruebas de almidón después de la digestión con una gama de cargas enzimáticas y ratios.
- En un recipiente de plástico, añadir 16 ml de solución de-almidonar enzima por 1 g de biomasa aérea granel. Para un protocolo de-almidonado lotes, añadir 120 bolsitas de té a 500 ml de la solución tampón de la enzima.
- Incubar en un agitador a 55 ° C durante 24 (± 4) horas, a 120 rpm para eliminar posibles almidón.
- Después de la incubación de-almidonar, enjuague y empapar la biomasa en varios litros de agua desionizada durante 30 minutos. Repetir este proceso dos veces más para eliminar las sales tampón que pueden causar la ebullición (formación de burbujas de gas en la solución que puede resultar en un aumento repentino y violento en el nivel de la solución, provocando etanol líquido caliente para cascadafuera del recipiente de reacción) durante la extracción.
- Tras el lavado exhaustivo de la biomasa de-almidonado, colocar las bolsitas de té en la columna de Soxhlet para la extracción. No se requiere un dedal para este paso.
- Configure el reflujo Soxhlet, utilizando etanol al 95% y extraer las muestras durante 24 horas.
- Quite las bolsitas del reactor Soxhlet y se extendió a cabo en una sola capa en una bandeja plana.
- Permita que las muestras se sequen durante la noche a temperatura ambiente en una campana de humos.
- Desenrolle las bolsitas de té y devolver la biomasa seca de bolsas antiestáticas originales con código de barras.
Nota: Las bolsas anti-estáticas son eficientes en la reducción de la electricidad estática en la biomasa, lo que mejora las características de manejo. Si se utilizan otras opciones de almacenamiento, biomasa adicional puede ser necesaria debido a la biomasa apego a un lado del recipiente de almacenamiento. - Transferencia de al menos 50 mg de la biomasa seca a una tolva de código de barras (utilizando más material es mejor para la dispensación precisa). Spueden códigos de barras de bolsas anti-estáticas y la tolva de recepción para asegurar el seguimiento de precisión de muestra.
- Tolvas de carga en sólidos pesando robot, prestando especial atención a la orden de las muestras en los bastidores. Cargar placas reactor suficiente para contener todas las muestras y seleccione el protocolo de dispensación en función del número de placas utilizadas.
- Robóticamente sopesar 5 mg de las muestras secas (± 0,3 mg) en acero inoxidable placas de 96 pocillos resistentes a los ácidos. Pesar 3 réplicas de cada muestra distribuida alrededor de la placa para minimizar las variaciones localizadas.
- Incluya 8 muestras de biomasa de control de un material estándar biomasa bien caracterizado con el fin de realizar un seguimiento de la realización del ensayo. Para múltiples placas, el uso de múltiples tolvas estándar de biomasa será minimizar la deriva del tamaño de partícula causada por tamizado en las tolvas de dispensación durante los ciclos repetidos.
Nota: En cada placa, debe haber 24 muestras con 3 repeticiones, 4 espacios en blanco que consisten en agua desionizada y la enzima y 8 controls, usando la biomasa estándar caracterizado previamente. Los 3 pozos de esquina de cada una de las 4 esquinas de la placa están reservados para los estándares de azúcar. - Compruebe pozos estándar en blanco y azúcar para las partículas de biomasa errantes y quitar si está presente.
- Añadir 250 ml de agua desionizada a cada pocillo, y sellar las placas con politetrafluoroetileno respaldado por adhesivo de silicona (PTFE) cinta.
- Utilizando una punta del soldador de 1/8 ", perfore la cinta de PTFE en cada puerto de vapor (117 en total) para cada plato. Use un plato vacío apilados en la placa del reactor sellado como guía y para restringir el movimiento de PTFE película.
- Sujete las placas firmemente con 0.031 juntas "de espesor reforzado con vidrio de PTFE (pre-perforadas con agujeros para los puertos de vapor) entre las placas y los platos vacíos en la parte superior e inferior de la pila. Trate previamente las muestras usando un reactor de vapor de agua fijada a 180 ° C durante 17,5 min, u otras combinaciones de temperatura / tiempo en base a la severidad deseada.
- Placas de reactores enfriar a 50 °; C por las inundaciones con agua desionizada.
- Enzimática Sacarificación
- Preparar una solución de sacarificación enzimática que consta de 8% (v / v) solución de enzima en 1,0 M de citrato de sodio, pH 5,0. Preparar 5 ml por placa reactor. Nota: La dilución requerida debe determinarse sobre la base de la actividad y contenido de proteína de la solución específica de la enzima.
- Cuando las placas son frescos, centrifúguelas en un rotor de cubeta oscilante a 1500 xg durante 20 min. Retire la película de sellado. Nota: Estas placas son pesados y las especificaciones de centrífuga debe comprobar la compatibilidad.
- Añadir 40 l de la solución de enzima de stock 8% a cada pocillo (70 mg de enzima por g de biomasa).
- Vuelva a cerrar con una nueva cinta de PTFE. Coloque la placa de sellado en pinza placa magnética.
- Mezclar suavemente las muestras por inversión (al menos 15 veces), y se incuba a 50 ° C durante 70 h.
- Cuando la sacarificación ha concluido, mezclar por inversión y centrifugar las placas a 1.500 xg durante 20 min.
- Ensayo de Azúcar
- Prepare un conjunto de 6 de la glucosa y los estándares de calibración de xilosa combinado en tampón M de citrato 0,014 (pH 5,0) que van desde 0 a 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65, y 0,75 mg / recomendada ml) y de 0 a 0,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45, y 0,6 mg / ml recomendado) para la glucosa y xilosa, respectivamente.
- Preparar la glucosa oxidasa / peroxidasa (goPod) y xilosa deshidrogenasa (XDH) los reactivos de acuerdo a instrucciones del kit.
- Con una pipeta, retire 200 l de líquido de los 4 pozos de esquina y pozos de borde adyacentes a los pozos de esquina (12 pozos en total) de la placa del reactor.
- Con una pipeta, dispensar 180 l de agua desionizada a cada pocillo de una placa de dilución de fondo plano de poliestireno de 96 pocillos. No añadir agua a los pozos convencionales y esquina 12 de azúcar (quitar estos consejos si se utiliza un cabezal de 96 canales).
- Con una pipeta, dispense 180 l de reactivo goPod a cada pocillo de la prueba de glucosa en plcomió.
- Con una pipeta, dispensar reactivo XDH 180 l a cada pocillo de la placa de ensayo xilosa.
- Con una pipeta, transferir 20 l alícuotas de hidrolizado de la placa del reactor de 96 pocillos de la placa de dilución. Pipetear de la sección superior de los pocillos para evitar los sólidos de biomasa y líquido residual en los pozos de esquina. Mezclar por trituración durante al menos 10 ciclos.
- Con una pipeta, transferir 110 l de estándares de azúcar, por duplicado, a los pozos de esquina de la placa de dilución.
- Con una pipeta, transferir 20 alícuotas de la placa de dilución para los de glucosa y xilosa placas de ensayo. Mezclar por trituración.
- Incubar las glucosa y xilosa placas de ensayo a temperatura ambiente durante 30 min. Romper con cuidado las burbujas de la superficie antes de leer. Una pistola de calor pasó brevemente sobre la superficie de la placa funciona bien.
- El uso de un lector de placas de 96 pocillos ultravioleta / visible, ajuste la longitud de onda medida a 510 nm y registrar la absorbancia contra un blanco de reactivo.Esta medición supervisa la formación de quinonimina, que es proporcional a la concentración de glucosa. La concentración de glucosa se calcula a partir de la curva de calibración basada en los estándares de calibración preparadas en 1.3.1.
- El uso de un lector de placas de 96 pocillos ultravioleta / visible, ajuste la longitud de onda medida a 340 nm y registrar la absorbancia. Esta medición supervisa la reducción de NAD + a NADH, que es proporcional a la concentración de xilosa. La concentración de xilosa se calcula a partir de la curva de calibración en base a los estándares de calibración preparadas en 1.3.1.
2. Alto rendimiento Determinación del total de lignina y lignina contenido monomérico Usando pyMBMS 28
- Preparación de la muestra
- Moler y extraer la biomasa utilizando los métodos descritos en los pasos 1.1.1, y 1.1.6-1.1.8. Esto incluye la molienda y extracción de un conjunto de normas para usar como controles experimentales.
Nota: El measur pyMBMSelemen- no dependen del tamaño de partícula, por lo que si solamente utilizando el protocolo pyMBMS, la preparación de biomasa deben llevarse a cabo para permitir que la muestra para encajar en el soporte de la muestra, <4 mm. - Usando una pequeña espátula de dispensación de aproximadamente 4 mg (3 a 5 mg preferidos) de la biomasa preparada en una taza de acero inoxidable de 80 l diseñado para la auto-muestreador.
- Asegúrese de que al menos el 10% de las muestras que se analizan son las normas de control, como las disponibles en el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (bagazo de caña de azúcar-8491; álamo-8492; de pino-8493; o el trigo de la paja-8494). El estándar también puede ser cualquier especie análogas a las muestras a analizar que ya han sido caracterizados utilizando métodos estándar.
- Aleatoriamente cargar las muestras en las copas de auto-sampler utilizando pinzas para evitar el sesgo debido a la posible deriva espectrómetro con el tiempo. Nota: Una aleatorización típica de las muestras sería incluir la medición de todas las muestras de una vez, seguido de un re-aleatorizacióndel orden de las muestras para una medición por duplicado. Programas de aleatorización están disponibles en línea.
- Usando un taladro estándar, producir manualmente discos de filtro de vidrio de tipo láminas de fibra de vidrio A / D, sin aglutinante. Sujete el filtro de fibra de vidrio redonda con pinzas, centrarlo sobre la copa de la muestra, y empuje en la muestra utilizando una llave Allen de 3,5 mm para confinar el material en cada taza durante el experimento.
- Moler y extraer la biomasa utilizando los métodos descritos en los pasos 1.1.1, y 1.1.6-1.1.8. Esto incluye la molienda y extracción de un conjunto de normas para usar como controles experimentales.
- Protocolo Instrumental
- Calibrar el espectrómetro de masas usando un estándar conocido que tiene intensidades de los picos en toda la gama de compuestos que pueden existir para las muestras experimentales. Para las muestras típicas de biomasa, utilice perfluorotributilamina (PFTBA).
- Ajuste la velocidad de flujo del gas portador de helio a 0,9 L / min utilizando un medidor de flujo de gas.
- Ajuste el horno de auto-muestreador a una temperatura de pirólisis de 500 ° C y la temperatura de interfaz a 350 ° C utilizando el software de auto-muestreador. Nota: A "de acero inoxidable 1/8 calientalínea de transferencia de calor envuelto en cinta que conecta el auto-muestreador al espectrómetro de masas se controla mediante un controlador térmico a 250 ° C.
- Comience la adquisición de datos en el espectrómetro de masas y espere al menos 60 segundos para obtener datos suficientes para la recopilación de antecedentes espectros.
- Comience el método de auto-muestreador automático con las especificaciones de 2.2.2. Nota: La auto-muestreador gotas de cada muestra individualmente en el horno de auto-muestreador. El tiempo total de adquisición de datos es de aproximadamente 1,5 min; Sin embargo, la pirólisis de una típica muestra de 4 mg es completa después de 30 seg.
- Contenido Registro de iones totales (TIC) de cada muestra utilizando el software espectrómetro de masas en la velocidad de barrido de 0,5 seg. Intensidades de Registros entre m / z 30-450.
Nota: los compuestos de biomasa típicas utilizan ionización suave a 17 eV. El instrumento puede grabar intervalos mayores de m / z 1 a 1000; Sin embargo, la tasa de exploración estará limitada por el poder de la CPU del ordenador. - Eliminar fondo de los espectros utilizando el manual mejorar función en el software. Nota: Una porción 60 de barrido de la línea de base al comienzo de la recogida de datos se utiliza para calcular un valor medio de fondo. Este promedio espectros de fondo se quita de los espectros de la muestra experimental automáticamente en el software espectrómetro de masas.
- Importe el archivo de texto de una sola columna creado por el software espectrómetro de masas que contiene los datos espectrales para cada muestra, en un programa de base de datos y combinar todas las muestras en una sola base de datos. Añadir los metadatos aplicables a la hoja de cálculo. Importe los datos con formato de hoja de cálculo (archivo / CSV) en un paquete de software estadístico y la media de normalizar el espectro para dar cuenta de la variación en las masas de muestra pirolizados.
- Use un paquete de software estadístico para llevar a cabo un análisis de componentes principales (PCA) usando los datos espectrales para analizar agrupación de las muestras replicadas estándar utilizados en las mediciones, así como para evaluar qué picos son parte integral de la clasificación de los productos químicoscompuestos en las cargas parcela 28.
Nota: Los grupos de PCA las muestras en base a la similitud de sus espectros, y permite una verificación de los estándares para medir el error experimental debido a la deriva instrumento durante la carrera. - Para calcular la siringil lignina (S) / guayacil (G) ratio, sumar las áreas de los picos S (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, y 210) y se divide por la suma de G picos en 124, 137, 138, 150, 164, y 178.
- Para calcular el contenido total de lignina, sumar los picos de lignina con m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, y 210.
- Calcular un factor de corrección para escalar la medición pyMBMS a un método estándar para la estimación de la lignina total de, como Klason lignina. Divida el valor lignina Klason de la norma individual del contenido total de lignina medido para esa muestra estándar utilizando pyMBMS.
- Aplique este factor de corrección a todas las especies como en el conjunto de datos. Repita el procedimiento para cada tipo de biomasa analizada. Nota: El factor de corrección puede variar en función significativa en la S / G de la biomasa analizada.
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Representative Results
El efecto combinado del pretratamiento termoquímico y posterior enzima de sacarificación se mide como una función de la masa de glucosa y xilosa liberado al final del ensayo. Los resultados se reportan en términos de miligramos de glucosa y xilosa liberados por gramo de biomasa. Esto está en marcado contraste con los datos reportados a partir de ensayos a escala de banco, que generalmente se reporta como por ciento de rendimiento teórico basado en análisis de la composición del material de partida. Como todavía no es práctico para llevar a cabo análisis de la composición de miles de muestras por semana, los datos son mejores reporta como niveles de conversión sobre una base de masas. Esto permite la evaluación muestra razonable siempre y cuando las comparaciones se hacen entre las muestras estrechamente relacionadas de la biomasa y la composición de las muestras no varía demasiado.
El objetivo principal del ensayo es evaluar las diferencias relativas en la resistencia de la pared celular vegetal a combinado termoquímica / enzymsacarificación ático en una amplia gama de variantes individuales. Vale la pena señalar que el ensayo no intenta optimizar cualquiera de las condiciones usadas para la sacarificación. De hecho, las condiciones de severidad de pretratamiento son significativamente subóptimas con el fin de ampliar el rango de sensibilidad del ensayo, dirigidas a un rendimiento de conversión final del 50% al 70% del teórico. Condiciones de pretratamiento en o cerca de óptima sería empujar todas las muestras a alta conversión, estrechando considerablemente el rango dinámico del ensayo. Por el contrario, la carga de la enzima es mucho mayor que típicamente reportados para digestiones banco de escala. Una vez más, el objetivo del método no es encontrar la mejor enzima o minimizar el costo de la enzima, pero para medir la obstinación intrínseca de las paredes de las células a la conversión y el uso de cargas muy altas de enzimas elimina la variabilidad de ensayo.
Por último, es importante entender que la variabilidad en el ensayo general es significativamente mayor que la reportada para benctrabajo h escala. Errores estándar típicas son alrededor del 8%, aunque el alcance es mucho más amplio. Esto es simplemente la naturaleza de pequeña escala, la investigación HTP. Pipeteo y errores de pesaje son proporcionalmente más alta en la escala de l mg y, al igual que las pérdidas por evaporación y condensación. La heterogeneidad de la biomasa se convierte en una variable muy grande cuando el ensayo de varios órdenes de magnitud menos partículas en cada muestra, es decir, 5 mg vs. múltiple g. Los ensayos colorimétricos utilizan para determinar la glucosa y la xilosa se correlacionan bien con los resultados de HPLC; Sin embargo, mientras que los ensayos ligados a enzimas para el análisis de azúcar son rápidos y pueden llevarse a cabo en paralelo, que no son tan precisos como los métodos analíticos tales como HPLC, la introducción de otra capa de imprecisión (Figura 1).
Debido a todas las consideraciones anteriores, los resultados sólo deben ser interpretadas y reportados dentro de ciertas limitaciones. Los datos deben ser examinadas en conjuntos completos, muestras no como individuales. Se requieren repeticiones de mearesultados ningful. Tendencias y valores atípicos son significativas, pero los resultados individuales no son. Las comparaciones se hacen mejor en los juegos de experimentos individuales. Las comparaciones entre las campañas temporal o espacialmente separadas requieren controles muy ajustados y un cuidadoso examen para que tenga sentido. Datos de HTP no es directamente comparable con puntos de referen- cia o datos de otra escala. Tendencias pista entre el HTP y otras escalas, pero las comparaciones de muestras directas no dan resultados idénticos.
Representación de datos normalmente cae en comparaciones tendencias, valores atípicos, o sub-población / variantes. Un ejemplo de las tendencias es un estudio de la obstinación de 755 variantes naturales de álamo de la muestra en un amplio rango en el noroeste del Pacífico de los Estados Unidos 19. La obstinación de estas muestras se representó frente a su proporción de contenido de lignina y siringil / guayacil según lo determinado por pyMBMS. Los resultados indican que a medida que se eleva S / G, la obstinación disminuye hasta una relación S / G de aproximadamente 2, donde el impr recalcitranteniveles OVIMIENTO off (Figura 2). Los valores atípicos se pueden ver claramente en la figura 3, donde el gen Pt4CL1 se había reducido regulado en el álamo. Varios cientos de cultivares fueron seleccionados y varios se incrementan claramente en la obstinación, como lo demuestra la liberación de azúcar disminuyó. La figura 4 muestra un estudio en el que se cultivan diversas variedades de trigo de la paja diferentes en varios lugares de interés de más de dos años y la cosecha después de varias variaciones en las condiciones de crecimiento , lo que resulta en 20 poblaciones distintas basadas en combinaciones de las variables anteriores. Estos conjuntos de muestras son fácilmente distinguibles e indican variables positivas y negativas para la obstinación. Figura 5 muestra cómo se pueden utilizar pyMBMS para evaluar los cambios en la composición de la pared celular. Masa fragmentos espectrales se asignan a diferentes monómeros de lignina (Tabla 1). Al comparar una muestra con alta lignina vs. alto contenido de hidratos de carbono, las disparidades en los datos espectrales son evidentes. Tl uso de datos pyMBMS junto con un análisis de componentes principales (PCA) se ilustra en la Figura 6. En este ejemplo, las muestras se clasifican de acuerdo a la fertilización de baja o alta de nitrógeno. La lignina y el contenido de hidratos de carbono se alinean a lo largo de PC1 inversamente. El uso del principal saturaciones en componentes parcela puede ayudar en la identificación de los rasgos químicos se están explicados en la trama clasificación puntuaciones, así como la aclaración de que los rasgos están cambiando entre los conglomerados de la muestra.
Figura 1: Comparación de glucosa y xilosa cuantificación utilizando ensayos colorimétricos de alto rendimiento vs. 9 HPLC. Comparación de la detección de glucosa y xilosa se llevó a cabo usando xilosa deshidrogenasa (XDH, panel superior) y glucosa oxidasa / peroxidasa (goPod, panel inferior) ensayos ligados a enzimas colorimétricos de alto rendimiento y alto rendimiento lcromatografía iquid.
Figura 2: recalcitrancia de las paredes celulares de álamo como una función de siringil a guayacil (S / G) contenido en lignina 9 El aumento de la obstinación de las paredes celulares de álamo como una función de siringil a guayacil (S / G) contenido en la fracción de lignina tiene. sido observado y reportado. 755 muestras de núcleo de álamo del mismo cultivar álamo fueron tomadas durante varios cientos de millas de bosque en el noroeste del Pacífico de América del Norte y se seleccionaron para la glucosa y xilosa liberación después del pretratamiento termoquímico y enzimas de sacarificación. Los resultados se representan frente a la relación S / G en la lignina de la pared celular según lo determinado por pyMBMS. Recalcitrancia disminuye con el aumento S / G hasta alrededor de 2, donde permanece constante en mayor S / G. Valores de rendimiento teóricos se basan en el BESC "estándar" álamo y se proporcionan como una reference para la comparación.
Figura 3:. Obstinación en las reguladas expresión Pt4CL1 en álamo Down-regulación del gen Pt4CL1 en álamo produjo poca variación en la obstinación de la pared celular entre los clones, sin embargo varios aumento drásticamente variantes obstinación se identifican fácilmente. Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.
Figura 4: la obstinación en varias poblaciones Wheatstraw Los efectos del tipo de cultivo, lugar de cultivo, la aplicación de fertilizantes y riego resultado tasa en los niveles de la obstinación claramente distinguibles.. Diferentes símbolos representan diferent condiciones de crecimiento experimentales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. Aplicación de pyMBMS para el análisis de cambios químicos en las paredes celulares de la planta 28 Los picos marcados con flechas son fragmentos de lignina, y se utilizaron para evaluar (a) alta lignina (b) lignina medio o (c) bajo contenido de lignina.
Figura 6:. De componentes principales resultados de análisis gráfico de las diferencias en la composición química de la pared celular de los árboles poblados crecido con tasas de fertilización más altos y más bajos de 28 (arriba) Análisis de componentes principalesanota gráfico que ilustra una clasificación distinta, y por lo tanto, las diferencias en la química de la pared celular de los árboles cultivados poblados con tasas de fertilización superiores e inferiores. Componente principal 1 repartió las muestras sobre la base de mayor lignina (negativo) o carbohidratos contenidos (positivos) superiores. (Abajo) Las principales saturaciones en componentes dilucidar qué componentes químicos cambian entre los dos grupos de muestras en la trama puntuaciones. Las cargas positivas se correlacionan con los resultados positivos, que son representativos de los contenidos de hidratos de carbono más altos, mientras que las cargas se correlacionaron negativamente alinean con resultados negativos y, por tanto, un mayor contenido de lignina.
| m / z | Asignación Molecular 30 | S / G asignación / H |
| 94 | fenol | S / G / H |
| 120 | Vinilfenol | H |
| 124 | Guayacol | G |
| 137 | Etilguayacol, homovanillin, alcohol coniferílico | G |
| 138 | Metilguayacol | G |
| 150 | Vinilguayacol | G |
| 154 | Siringol | S |
| 164 | Alil- + guayacol propenilo | G |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | S |
| 168 | 4-metil-2,6-dimetoxifenol | S |
| 178 | Coniferil aldehído | G |
| 180 | Alcohol coniferílico, syringylethene | S, G |
| 182 | Siringaldehído | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
Tabla 1:. Pico m / z y asignaciones para los fragmentos de la pirólisis de lignina derivada detectada por espectrometría de masas Lista de compuestos típicos detectados por pyMBMS. Asignaciones moleculares basados en Evans, RJ y TA Milne (1987). Caracterización molecular de la pirólisis de la biomasa Energía y Combustibles 1 (2):. 123-137.
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Discussion
Los pasos clave de preparación de muestras para la obtención de datos precisa y reproducible cuando se realizan experimentos de selección de alto rendimiento son las siguientes:
Azúcar Ensayo de lanzamiento:
En general, las muestras se preparan en lotes que van desde unas pocas docenas a varios miles a la vez. Cada paso importante se lleva a cabo típicamente para todas las muestras antes de mover hacia adelante con el fin de minimizar las variaciones en la preparación entre las muestras. De-almidonado no era originalmente parte del protocolo y se puede omitir en ciertos casos. Muestras del núcleo de madera y materiales herbáceos seniles son consistentemente bajos en almidón y, por lo tanto no requieren de-almidonar para reducir la variabilidad. El almidón es una gran preocupación; Sin embargo, en conjuntos de muestras de tejido de plantas verdes, especialmente para grandes conjuntos de la muestra, donde la cosecha se produce durante varias horas. Como los niveles de almidón aumentan durante las horas del día y se agotan en la oscuridad, los niveles de almidón pueden variar significativamente en sh arios y glucosa del almidón es indistinguible de la glucosa de la celulosa, por lo tanto, los niveles altos de almidón pueden conducir a mediciones distorsionada bajas recalcitrante. La carga real de la enzima en la etapa de destarching es de menor preocupación, siempre y cuando haya suficiente actividad para eliminar el exceso de todo el almidón accesible dentro del marco de tiempo de la etapa de hidrólisis del almidón. Las variaciones en las enzimas específicas utilizadas, tiempo, temperatura, velocidad de volumen, y la agitación de la etapa de extracción de almidón sin duda puede dar lugar a diferencias en los niveles de extracción de almidón y las tasas y se deben determinar empíricamente cuando sea posible. Por último, al envolver las bolsitas de té para la extracción, utilice cable de cobre estañado. Alambre de cobre desnudo puede causar reacciones químicas no deseadas con la solución de enzima, dando falsos valores de azúcar. Cobre recubierto de estaño resuelto este problema mientras alambre de acero inoxidable no era lo suficientemente maleable para guardar las bolsitas de té bien cerrado.
Tamaño de reducción consistente de la biomasa es fundamental para accudatos de frecuencia por dos razones: 1) finamente molido biomasa, mientras que dispensa más fácil y consistente, también es más fácil de digerir que la material más grueso. 2) La biomasa que es demasiado grueso puede obstruir las tolvas, lo que resulta insuficiente en el material o, si la obstrucción solamente está bloqueando parcialmente la abertura, puede actuar como un tamiz y sólo permitir que las partículas finas a través de, la disminución de la recalcitrancia observada de la muestra. Si demasiado poco biomasa está contenida en las tolvas, puede cubrir los lados de la tolva, haciendo que el robot para asumir la tolva está vacío y la muestra se saltado en el proceso de dispensación. Además, los bajos niveles de biomasa pueden contribuir a la heterogeneidad de la muestra exagerada, especialmente en forma de partículas más densas (tales como corteza) tienden a tamizar a la parte inferior del cono y ser dispensada primero. Cuando menos de 50 mg de material está disponible, el ensayo aún puede llevarse a cabo; Sin embargo, las muestras deben ser sopesado a mano. Sin embargo, los resultados de la mano con un peso son más variables que los de robarpesaje ótica.
No está bien definido el monto real de la biomasa necesaria para las etapas preparatorias. Hemos sugerido de 250 mg como un punto de partida razonable, sin embargo, cada muestra de biomasa presenta diferentes características en cuanto a las pérdidas debidas a la manipulación, molienda y extracción, así como que se celebra en las tolvas o que se dispensa de forma reproducible. La heterogeneidad de la biomasa a través de tipos e incluso dentro de un mismo tipo se opone a un protocolo más definido. Las personas que deseen poner en práctica estos métodos de ensayo sólo tendrá que determinar muchas de estas variables para sí mismos, aunque la experiencia hace que sea más fácil.
Otro paso que puede introducir errores es la mezcla en placas de microtitulación, que es notoriamente difícil y es crítico en estos ensayos por varias razones. La solución de enzima utilizada se concentra y se puede estratificar después de la adición a los pocillos, enzima limitante de la accesibilidad a la biomasa. Como sacarificación procede, el sugars liberados también puede estratificar y concentrarse cerca de la biomasa y dependiendo de la profundidad de muestreo, ensayos de azúcar puede ser artificialmente alta o baja. Es por esto que es vital para mezclar las muestras después de la adición de la enzima y la enzima de sacarificación, permitiendo una mezcla completa de las enzimas con la biomasa, incluso para la sacarificación y la distribución uniforme de los azúcares resultantes para permitir el análisis de azúcar consistente. En las placas que no contienen biomasa, tales como placas de dilución o de ensayo, mezclar mediante pipeteo repetido (trituración) ha demostrado ser muy superior a agitación. Sin embargo, como soluciones en este protocolo tienen densidades variables y niveles de partículas, la velocidad de pipeteado y ubicación vertical punta en la columna de líquido es crítico. Si la velocidad es demasiado rápida, poca precisión debido a la cavitación (aspiración) y la retención de líquido en la punta (dispensación) puede ocurrir. Si la punta es demasiado profunda en el pozo, la biomasa puede obstruir la punta o la punta puede ser presionado hasta el fondo, lo que impide la aspiración precisa, y noes más área de superficie exterior para el líquido de aferrarse a y arrastre al paso siguiente. Este último problema puede ser un tanto mitigado por el control de la velocidad de retirada de punta, como la eliminación de la punta más lenta permite que el líquido sea retirado de la solución a granel por la tensión superficial. Si la retirada de punta es demasiado lento, líquido pipeta puede colarse de nuevo en la solución a granel también. Partículas de biomasa también tienen una tendencia a aferrarse a la punta y se convierten transferido a la placa de dilución, en el que puedan obstruir la punta durante la mezcla o la transferencia a las placas de ensayo, la creación de inexactitudes en volúmenes de muestra que se analiza. Estas partículas también pueden interferir con el análisis espectroscópico de las placas de ensayo si se ocluyen el haz de luz durante la lectura.
Consistente momento el desarrollo del color es fundamental para goPod y ensayos XDH. El color-desarrollo se debe permitir que se complete; sin embargo, el color de ensayo goPod tiende a continuar subiendo después de la finalización y el NADH generado por el ensayo de XDH lentamentedisminuye debido a la oxidación espontánea de la NADH. Como resultado, el momento de la variabilidad puede dar lugar a comparaciones inconsistentes de datos entre placas separadas. Las etapas del ensayo deben ser controlados cuidadosamente, como paros debido a problemas de hardware o software pueden dar lugar a grandes diferencias en los tiempos de ensayo. El uso de estándares de azúcar y pozos de control de biomasa estándar en cada placa puede ayudar a mitigar esto hasta cierto punto.
PyMBMS:
Las normas deben ser considerados cuidadosamente para pyMBMS experimentos para la comparación con los métodos estándar de química húmeda. Debido a la composición de lignina diferentes (S / G proporciones) de las especies de biomasa, el factor de corrección debe ser determinada utilizando un estándar representativo que es la misma especie que la muestra experimental. Si no hay disponible estándar apropiado, las diferencias en la concentración de lignina se pueden comparar utilizando las intensidades de los precursores de lignina directamente. Alto S / coeficientes G (más de ~ 3.5) pueden dar lugar a una sobreestimación de lcontenido ignin por pyMBMS. Esto es causado por la tendencia de S lignina que se libere preferentemente en las condiciones estándar que se utilizan en este método. Además, la cantidad de muestra requerida para pyMBMS mediciones depende del tipo de biomasa utilizada. Compuestos de lignina y modelo de lignina aislados requieren menos material (0,1 mg), como el uso de alícuotas más grandes de la muestra se puede saturar el detector.
Otro paso crítico en el proceso PyMBMS es cuidadosa afinación del instrumento a un estándar conocido como perfluorotributilamina (PFTBA) antes de cada experimento. PFTBA contiene picos moleculares en todo el espectro de la biomasa típica y, por tanto, permite un ajuste instrumento uniforme entre las corridas experimentales. La región media de los espectros PFTBA se sintoniza de modo que m / z 131 y m / z 219 son de aproximadamente 50% de la intensidad de m / z 69. Este ajuste se utiliza para destacar los picos típicos vistos bajo ionización suave (17 eV) usaron para minimizar la fragmentación de los iones a un menor que c masas Annot ser fácilmente identificados.
Cabe señalar que estos métodos no son métodos analíticos para la cuantificación exacta de analitos de interés. Más bien, estas técnicas de alto rendimiento son para el cribado de grandes conjuntos de biomasa para identificar aquellos que poseen los rasgos químicas deseadas. Estos métodos sólo deben utilizarse para la detección, clasificación, y la correlación de las muestras dentro de un conjunto de datos. Los conjuntos de datos que no se pueden comparar directamente cuando se cobran en diferentes días debido a las fuentes de variación tales como la desviación instrumental, los cambios en la actividad enzimática, contenido de humedad ambiente en la biomasa, debido a los cambios de humedad, cambios de temperatura, y las diferencias en las extremidades y un montón de placas absorbancia . Además, el pretratamiento utilizado en el protocolo de preparación de la muestra no es una estrategia de pre-tratamiento optimizado, sino que ha sido diseñado específicamente para ser sub-óptimo. Esto permite sutiles diferencias entre las plantas no se ha dilucidado de manera más eficiente.
jove_content "> El principal beneficio de la adopción de métodos de alto rendimiento es que muchas más muestras se pueden medir en el mismo período de tiempo 18. Por ejemplo, un método común para el análisis de hidratos de carbono producidos durante una sacarificación ácida o enzimática es el uso de altas prestaciones cromatografía líquida (HPLC). Selig et al., afirman que el ubicuo hidrólisis ácida de dos pasos, aunque bastante útil y de suma importancia para la cuantificación de los hidratos de carbono estructurales, limita los investigadores para ser capaz de evaluar aproximadamente 25 muestras por semana 9. Mientras que la analítica instrumentación empleada en las metodologías de alto rendimiento puede no proporcionar la sensibilidad de una técnica estándar como HPLC, el análisis rápido permite investigadores el lujo de ser capaz de evaluar grandes cantidades de muestras. Además, los métodos de alto rendimiento a menudo han downscaled protocolos experimentales, reducir el uso de consumibles, y por lo tanto, la disminución de los costos de experimentación y de residuos.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
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