Abstract
Dyremodeller er viktige verktøy for å studere patofysiologi og farmakologi av nevropatisk smerte. Dette manuskriptet beskriver de kirurgiske og atferdsmessige prosedyrer for å studere trigeminal nevropatisk smerte hos rotter. For å møte det spesielle ved trigeminal nevropatiske smertesyndromer, er infraorbital nerve (Ion) utsatt for en kronisk innsnevring skade (CCI) ved løst ligere nerve. En intra-orbital tilnærmingen presenteres her for å avsløre og ligere ion i orbital hulrom. Etter ION ligation, rotter vise endringer i spontan adferd og respons på von Frey hår stimulering som er tegn på vedvarende smerte og mekanisk allodyni. To faser kan defineres i utviklingen av de atferdsmessige endringer. I løpet av den første uken etter ion-CCI (fase 1), rotter viser en økt og asymmetrisk ansikt grooming aktivitet, det vil si, med ansiktsvask stryk primært rettet mot nerve-skadet ION territorium. Det skilles mellom ansiktet grooming atferd som er en del av en mer generell kroppspleieatferd, som fortsatt i stor grad upåvirket av Ion-CCI, og ansiktet grooming at verken foran eller etterfulgt av kroppen grooming, som er betydelig økt etter ion-CCI. I løpet av denne perioden, er respons på mekanisk stimulering av ION territorium redusert. Dette hyporespons er brått erstattet av en ekstrem hyperreaktivitet der selv svært svake stimulanse intensiteter provosere nocifensive atferd (fase 2). De fenomenologiske likheter mellom disse atferdsendringer og rapportert tegn på ansikts smerte (dvs. tiltak mot skadelig stimulering av ansiktet) antyder tilstedeværelsen av dysestesi / parestesi og mekanisk allodyni i ligert ION territorium.
Introduction
Skade på somatosensoriske nerver fører oftest til tap av følelse. Det er ikke godt forstått hvorfor og hvordan, i noen tilfeller fører til kronisk smerte perifer nerveskade. Som et resultat, smertefull nevropati forbli en utfordrende tilstand for å behandle en og resultere i store reduksjoner i pasientenes livskvalitet 2-3. Dyremodeller er et viktig verktøy for å undersøke effekten av eksisterende og nyutviklede medisiner og å identifisere de patofysiologiske mekanismene som er involvert i utvikling og vedlikehold av nevropatisk smerte. Blant de viktigste utfordringene for translasjonell smerte forskning er å identifisere og måle spontan smerte hos dyr (dvs. fysiologiske, atferdsmessige eller andre manifestasjoner som indikerer tilstedeværelse av smerte hos dyr som ikke blir utfordret med sondering stimulations som er akutt lagret på motivets basal tilstand ). Det overordnede målet med denne prosedyren er å kirurgisk indusere eninfraorbital nerveskade i en rotte som fører til utvikling av både spontan og fremkalt nocifensive oppførsel som kan anvendes for å studere mekanismene som er involvert i trigeminal nevropatisk smerte og dens behandling.
Regissert, isolert ansikt grooming er en unik mål på spontan nevropatisk smerte hos rotter. Etter kronisk innsnevring skade (CCI) av infraorbital nerve (Ion), rotter vise endringer i spontan atferd og som svar på taktil stimulering som er tegn på vedvarende smerte og mekanisk allodyni fire. Etter Ion-CCI, rotter viser en økt og asymmetrisk ansikt grooming aktivitet, det vil si, med ansiktsvask stryk primært rettet mot nerve-skadet ION territorium. I motsetning til skadelig stimulering av ansiktet (f.eks formalin injeksjon) 5, ikke-smertefulle sensoriske forstyrrelser (dvs. ensidig vibrissae klipping, bedøvelse infraorbital nerveblokade, bruk av mineralolje på vibrissae) gjorde ikke eller bare veldig kort (dvs. de første minuttene etter utbruddet) indusere en betydelig endring i ansiktet grooming atferd 6. Det ble konkludert med at denne unormale grooming etter ion-CCI er et atferds manifestasjon av spontane, sterkt aversive opplevelser i den skadde nerve territorium. Denne oppførselen i ION-CCI rotter bærer sterke likhetstrekk med spontan smerte hos pasienter. Videre studier har identifisert en viktig forskjell mellom ansikt grooming atferd som er en del av en mer generell kroppspleieatferd (dvs. "ansikt grooming løpet kroppspleie"), som fortsatt i stor grad upåvirket av Ion-CCI, og nocifensive ansikt grooming som verken er innledet heller ikke fulgt av kroppspleie (dvs. "isolert ansikt grooming"), som er betydelig økt etter ion-CCI 7-9. Farmakologisk, ansikt grooming under kroppen grooming utgjør en utmerket kontrollmåling for uspesifikke virkninger av rusmidler ( Etter Ion-CCI, rotter også vise endringer i respons til taktil stimulering som er veiledende av mekanisk allodyni 4, 10. I løpet av den første uken (e) etter ion-CCI, rotter ikke lenger svare på mild eller moderat taktil (dvs. von Frey ) stimuli. Dette hyporespons blir så brått erstattet av en ekstrem hyperreaktivitet der selv svært svake stimulanse intensiteter provosere nocifensive atferd. Utbruddet av hyperreaktivitet kan variere mellom rotter, men de fleste rotter har blitt hyperresponsive etter tre til fire uker etter operasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Dyr blir behandlet og ivaretatt i henhold til retningslinjene for Utvalget for forskning og etiske problemstillinger av IASP 11. Protokollen er godkjent av institusjonelle Etisk Komité.
1. Tema
- Bruk Sprague-Dawley hannrotter (250-300 g) ved ankomst.
- Hus rotter i fast bunn merder i en koloni med en fuktighet på 40-60% og en RT på 21 ± 1 ° C.
- Gjør vann og mat tilgjengelig på libitum.
- Hold rotter under en omvendt 12:12 hr mørk / lys syklus (lys på 20 timer).
2. kirurgi
- Per rotte, fremstille to stykker av krom gut ligatur (5-0) på ca. 6 cm lang og plassere dem i sterilt saltvann for å unngå uttørking og blir stiv og sprø.
- Bedøve dyret med pentobarbital (60 mg / kg, ip) og behandle med atropin (0,1 mg / kg, ip). Overvåke nivået av anestesi ved å utvide det ene benet og pinching hudmembran mellom tærne med en fingernegl for å sikre tilstrekkelig trykk påføres. Sikre at dyret ikke bøye sitt lem. Hvis det er nødvendig, gi ekstra pentobarbital.
- Barbere hodet på rotta slik at en midtlinjen skalp snitt kan gjøres på ca 25 mm med lik avstand anterior og posterior til sentrum av øynene.
- Fest rotte hode i en stereotaxic ramme eller på annen måte fiksere rotte hode. Plasser rotte på et oppvarmet pad for å opprettholde kroppstemperaturen.
- Påfør oftalmisk salve på begge øynene for å unngå skader fra tørking.
- Skrubb barberte hodet området med alkohol, da betadine.
- Lag en midtlinjen skalp snitt, utsette skallen og nesebeinet.
- Bruk en operasjon mikroskop for å utføre trinnene 02.09 til 02.16.
- Dissekere kanten av banen fri, dannet av maxillaris, frontal, tåre og kinnbens bein, ved hjelp av en bomullspinne og et par Dumont tang. Bruk penselen til såak opp blod fra mulig blødning.
- Å gi tilgang til ION, forsiktig avlede orbital innholdet med en presisjon bomullspinne, tar seg ikke å overstrekke anterior ethmoidal nerve som krysser overlegen til ion. Dissekere ION fri fra omgivende bindevev, ved anvendelse av en presisjonsbomullspinne og et par Dumont tang ved hjelp av en sprednings bevegelse. Bruk penselen til å suge opp blod fra mulig blødning.
- For å utføre en ligering, skyver den ene enden av et enkelt stykke krom gut nedover langs pannebenet, medial til ion og avansere noen få millimeter parallelt og dårligere til ion. Ligaturen er nå holdes på plass mellom ion og pannebenet.
- Slip tuppen av en 45 graders vinklet Dumont tang under ION å plassere den i umiddelbar nærhet til ligaturen. Forsiktig trekke ion lateralt å avsløre ligatur og tuppen av tang. Grip ligaturen med pinsett og trekke pinsett lateralt fra under ion. Trekk ut ligatur fra orbital hulrom til begge ender av ligaturen er mer eller mindre like langt fra ion.
- Lag en "slip knot" fra de to endene av ligaturen for å tillate perfekt kontroll over graden av innsnevring og skyv knute mot ion. Skyv knute videre for å innsnevre ion slik at diameteren på nerve er redusert med en like merkbar mengde. Foreta en normal knute på toppen av slip knute, slik at mengden av innsnevringen forblir konstant (dvs. å hindre at slissen knuten fra å skli).
- Kutt ligaturer å forlate ca 2 mm av frie endene fra knuten.
- Gjenta samme prosedyre (trinn 02.11 til 02.15) for å gjøre en andre ligation 2 mm bortsett fra den første.
- For humbug kirurgi, utfør trinn 02.02 til 02.10.
- Lukk skalp snitt bruker polyester sting (4-0) og la rotten å gjenopprette på en oppvarmet pad. Ikke la dyret uten tilsyn før det har gjenvunnet tilstrekkelige consciousness å opprettholde sternal recumbency og ikke tilbake dyret til selskap med andre dyr før det er fullt restituert.
- For å unngå forkjøpsrett analgetiske effekter på utvikling av nevropatisk smerte, ikke administrere analgesi for post-operativ smerte.
3. Behavioral Testprosedyre
- Tillat rotter akklimatiseres i minst 8 dager til boforhold før preoperativ testing.
- Tilvenne rotter til testprosedyren minst én gang daglig i tre dager før pre-operative testing.
- Conduct testing i et mørkt rom med lys fra en 60 W rød lyspære suspendert en m ovenfor sentrum av testområdet belysning sentrum, men forlater omkrets dim og resten av rommet mørkt.
- Sørg for at det er tilstrekkelig bakgrunnsstøy for å redusere interferens fra plutselige auditiv stimulering. Om nødvendig, gir hvit støy.
- Observasjon av ansiktet grooming atferd
- Transport én rotte fra kolonien til testrommet i en tildekket av plast bur uten sengetøy. Merk: Ideelt sett bør dette være en kort tur med minimale ytre stimuli.
- Plasser rotte i en tildekket, gjennomsiktig plast bur uten sengetøy (LxBxH: 24 cm x 14 cm x 17 cm) med en speilet tilbake foran et videokamera.
- Foreta en 10 min opptak av dyrets oppførsel. Under opptak, sørg eksperimentator ikke er tilstede i testrommet.
- Rengjør observasjon buret før du legger neste dyret.
- Sørg for at den registrerte atferd er analysert av en eksperimentator som er blind for den eksperimentelle tilstanden til rotte.
- Lag en oversikt over hvert ansikt grooming episode i løpet av 10 min opptak. Merk: Face grooming er definert som bevegelsesmønstre som forpotene er brakt i kontakt med ansikts-områder.
- Gjøre et skille mellom to typer ansikt grooming atferd. Dersom en sekvens hverken foran eller etterfølges avkroppspleie (dvs. grooming av et område på kroppen enn ansiktet), kategorisere episoden som isolert ansiktet grooming. Hvis kroppen grooming utføres umiddelbart før eller etter ansiktet grooming, kategorisere episoden som ansiktet grooming under kroppen grooming.
- Bestem antall ansiktet grooming episoder.
- Kategorisere en tidsperiode mellom ansikt grooming handlinger som ikke overstiger 4 sek som en intra-episode plass (dvs. en pause mellom ansikt grooming handlinger innenfor en enkelt episode).
- Kategorisere en tidsperiode mellom ansikt grooming handlinger som overstiger 4 sek som et inter-episode plass (dvs. en fullstendig avbrudd av ansikt grooming handlinger mellom to episoder).
- Mekanisk stimulering testing
- Transport rotter i grupper på opp til seks dyr fra kolonien til testrommet i en tildekket bur med sengetøy. Sørg for at dette er en kort tur med minimale ytre stimuli.
- Plasserrotter individuelt i gjennomsiktige plastmerder med sengetøy (LxBxH: 24 cm x 14 cm x 17 cm) med et hengslet lokk, slik at det kan lett åpnes og lukkes.
- Bruk en gradert serie på fem von Frey hår. Merk: kraften som kreves for å bøye hårene er 0,015 g, 0,127 g, 0,217 g, 0,745 g og 2,150 g.
- Tilvenne rottene til observasjonsburet og rekkende bevegelser i 10 min. Hvert 30 sek, åpne lokket og trykk forsiktig veggen av buret med en plaststav.
- Når dyret er i en sniffing / nei locomotion tilstand (dvs. med fire poter plassert på bakken, verken flytting eller frysing, men stiller sniffing atferd), gjelder det første von Frey hår i ION territorium nær sentrum av den vibrissal pad på den hårete huden rundt mystacial vibrissae.
- Resultat responsen fra dyret til stimulering til å tilhøre en av følgende svarkategorier 4.
- Kategorisere en fullstendig mangel på respons som0 poeng.
- Kategorisere en stimulus deteksjon (dvs. snur rotte hodet mot stimulerende objekt og stimulans objektet er så utforsket) som satte inn 1.
- Kategorisere et uttak reaksjon (ie., Slår rotte hodet sakte bort eller trekker det briskly bakover når stimuleringen er brukt, noen ganger en enkelt ansikt tørk ipsilaterale til stimulert området skjer) som satte inn 2.
- Kategorisere en flukt / angrep respons (ie., Unngår rotte videre kontakt med stimulans objekt, enten passivt ved å bevege kroppen sin bort fra stimulerende objekt å anta en huk posisjon mot buret veggen, eller aktivt ved å angripe stimulans objekt, noe som gjør biting og gripe tak bevegelser) som satte inn 3.
- Kategorisere asymmetrisk ansikt grooming (dvs. viser rotte en uavbrutt rekke av minst tre ansikt-vask slag rettet mot stimulert ansikts-området) som satte inn 4.
- Innenfor hvert dyr, gjelder stimulere tilli i stigende rekkefølge av intensitet. Etter en stimulus intensitet har blitt brukt på den ene siden, bruke den til den andre siden før du går videre til neste stimulus intensitet. Randomisere rekkefølgen ipsilaterale og kontralaterale sider blir stimulert. Legg merke til at dyret må være i et sniffing / ingen bevegelse tilstand før hver stimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ion-CCI rotter viser en sterk postoperativ økning i mengden av tid brukt på isolert ansiktet grooming (figur 1). Økningen topper på slutten av den første postoperative uke og deretter avtar i løpet av de neste ukene. De fleste nyere studier har funnet ansikt grooming å bli betydelig økt i opptil tre uker. Face grooming atferd i humbug operert rotter er mer eller mindre upåvirket.
Ion-CCI rotter viser også en nesten fullstendig mangel på respons til ipsilaterale mekanisk stimulering av ION territorium under den første postoperative uke (figur 2). I løpet av neste uke, er dette hyporespons erstattet av en hyperreaktivitet. Utbruddet av hyperreaktivitet kan variere mellom rotter, noe som gjenspeiles av den økende gjennomsnittsskår og avtagende variasjon. Hyperreaktivitet er blitt funnet å vare opp til 120 dager etter operasjonen. Det er også en liten økning i respons til contrasideveis mekanisk stimulering i ione-CCI rotter, men det kan være så vidt statistisk signifikant fra den i narre opererte rotter.
. Figur 1. Post-operative endringer i isolert ansiktet grooming atferd følgende ion-CCI datapunkter representerer gjennomsnittet (± SEM, n = 12 per gruppe) mye tid brukt på isolert ansiktet grooming (A), og gjennomsnittlig (± SEM; n = 12 per gruppe) antall isolerte ansikt grooming episoder (B) en dag før ion kirurgi (pre) og på postoperative dager 5 til 26.
. Figur 2. Post-operative endringer i respons til mekanisk stimulering følgende ion-CCI datapunkter representerer gjennomsnittet (± SEM; n= 12 per gruppe) respons ledelse til von Frey hår stimulering av ligerte Ion territorium en dag før ion kirurgi (Pre) og på postoperative dager 4 til 15 (tilpasset fra Deseure et al, 2003).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest interessante aspektet av ION-CCI modellen er at den gir et unikt mål på spontane, ikke-fremkalt (nevropatisk) smerte. De fleste dyrestudier av nevropatisk smerte, ved hjelp av spinalnerve modeller, eksklusivt møte nocifensive atferd (f.eks., Vokalisering og abstinens svar), noe som reflekterer overfølsomhet for mekaniske eller termiske stimulations 12. Men politimesteren klinisk klagen hos pasienter er pågående smerte, ikke hyperalgesia eller allodynia 13.
Denne artikkelen beskriver to mål nevropatisk smerte etter ion-CCI, isolert ansikt grooming (spontan smerte) og reaksjonsevne til von Frey hår stimulering (mekanisk allodyni). Andre mål på nevropatisk smerte oppførsel følgende ion-CCI er også beskrevet andre steder, det vil si, termisk hyperalgesi 14 og kaldt allodyni 15. Videre nyutviklede metoder orofacial smertevurdering som Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) 16-17 eller måltid varighet som et mål på Orofacial nociceptive responser 18, kan vise seg å være verdifulle tiltak av smerte etter ion-CCI.
Denne artikkelen beskriver en intra-orbital tilnærming til ion. Legg merke til at to andre metoder, dvs. en perifer måte via et innsnitt inn i håret hud kaudalt for vibrissal puten og en intra-oral tilnærming, er også mulig. Selv om perifer tilnærming er langt den enkleste teknikken, har intra-orbital tilnærming den klare fordelen av å forlate den fine muskulaturen som styrer vibrissal bevegelser intakt, og kanskje enda viktigere, unngår det et snitt sår på territoriet til den skadde nerve som kan seriøst hemme sensorisk testing i den regionen. Andre forfattere har med hell brukt intra-oral tilnærming 14. Men den nære kontakten mellom ventral side av ion og en benete ryggen på ventral slutten av maxilLary bein gjør intra-oral tilnærming virke mer komplisert for oss og kirurgisk utfordrende enn intra-orbital tilnærming.
Vurderer nærhet av operasjonsområdet til munningen av rotte, anestesi via ip injeksjon (ic pentobarbital) ble valgt over innånding anestesi (f.eks isofluran). Men gitt ulempene med pentobarbital som risiko for overdose, respirasjonsdepresjon, opphoping av væske i øvre luftveier, andre anestesimidler eller inhalasjonsanastesi via en gassanestesi maske for stereotaksiske rammer, kan vurderes. I vår erfaring, forsiktig dosering, tidsriktig administrasjon av atropin så snart dyret blir bedøvd (selv delvis), vedlikehold av kroppstemperatur, og aspirasjon av væske fra øvre luftveier minimerer risikoen forbundet med pentobarbital.
Variasjon mellom ion-CCI rotter i mengdenansikt grooming atferd kan være ganske høy. Nylig har det vist seg at en del av denne variasjonen kan elimineres ved å observere rotter oftere 9. To ganger daglige observasjoner betydelig økt statistisk styrke, redusere antall dyr er nødvendig. Reaksjoner på von Frey hår stimulering av Ion territorium kategoriseres etter en serie av rang bestilt beskrivende svarkategorier (jf ovenfor). Det kan betraktes som en ulempe at dataene skal analyseres nonparametrically og representert med metriske målinger av sentraltendens (f.eks median) og variasjon (f.eks interquartiles). Det har blitt hevdet at resultatene av parametrisk analyse viser en meget god overensstemmelse med de av nonparametric analyse og at median score unnlater å riktig visualisere virkningene av forsøksbetingelser på respons score 10.
De viktigste anvendelser av Ion-CCI-modellen er i Pharmacological testing av eksisterende eller nyutviklede smertestillende legemidler, utvikling av nye terapeutiske strategier og studiet av de patofysiologiske mekanismene som er involvert i utvikling og vedlikehold av (trigeminal) nevropatisk smerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chromic catgut | Dynek | CG504 | |
| Nembutal (pentobarbital) | Pharmacy | ||
| Atropine | Pharmacy | ||
| Clippers for small animals - Favorita II | Aesculap | GT104 | |
| Stereotaxic instrument | Stoelting | 51600 | |
| Ophthalmic ointment (Liposic) | Pharmacy | ||
| Homeothermic monitor system | Harvard Apparatus | PY8 50-7221-F | |
| Cotton applicator | Pharmacy | ||
| Precision cotton swab | Qosina | 10225 | |
| Operation microscope | Kaps | SOM 62 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45) | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Scissors - blunt tips | Fine Science Tools | 14574-09 | |
| Polyester sutures - Mersilene (4-0) | Ethicon | R871H | |
| Digital video camera | Sony | HDR-CX330E | |
| Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit | Stoelting | 58011 |
References
- Jensen, T. S., Gottrup, H., Sindrup, S. H., Bach, F. W. The clinical picture of neuropathic pain. Eur J Pharmacol. 429 (1-3), 1-11 (2001).
- Meyer Rosberg, K., et al. Neuropathic pain a multidimensional burden for patients. Eur J Pain. 5 (4), 379-389 (2001).
- Meyer Rosberg, K., et al. Comparison of the SF 36 and Nottingham Health Profile in patients with chronic neuropathic pain. Eur J Pain. 5 (4), 391-403 (2001).
- Vos, B. P., Strassman, A. M., Maciewicz, R. J. Behavioral evidence of trigeminal neuropathic pain following chronic constriction injury to the rats infraorbital nerve. J Neurosci. 14, 2708-2723 (1994).
- Clavelou, P., Pajot, J., Dallel, R., Raboisson, P. Application of the formalin test to the study of orofacial pain. Neurosci Lett. 103, 349-353 (1989).
- Vos, B. P., Hans, G., Adriaensen, H. Behavioral assessment of facial pain in rats face grooming patterns after painful and non-painful sensory disturbances in the territory of the rats infraorbital nerve. Pain. 76 (1-2), 173-178 (1998).
- Deseure, K. R., Adriaensen, H. F. Comparison between two types of behavioral variables of non evoked facial pain after chronic constriction injury to the rat infraorbital nerve. Comp Med. 52 (1), 44-49 (2002).
- Deseure, K., Adriaensen, H. Nonevoked facial pain in rats following infraorbital nerve injury a parametric analysis. Physiol Behav. 81 (4), 595-604 (2004).
- Deseure, K., Hans, G. Behavioral study of non evoked orofacial pain following different types of infraorbital nerve injury in rats. Physiol Behav. 138, 292-296 (2015).
- Deseure, K., Koek, W., Adriaensen, H., Colpaert, F. C. Continuous administration of the 5 hydroxytryptamine1A agonist (3-Chloro-4-fluoro-phenyl)-[4-fluoro-4-[[(5-methyl-pyridin-2-ylmethyl) -amino]-methyl]piperidin-1-yl]-methadone (F 13640) attenuates allodynia like behavior in a rat model of trigeminal neuropathic pain. J Pharmacol Exp Ther. 306 (2), 505-514 (2003).
- Zimmerman, M. Ethical Guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16, 109-110 (1983).
- Mogil, J. S., Crager, S. E. What should we be measuring in behavioral studies of chronic pain in animals. Pain. 112 (1-2), 12-15 (2004).
- Backonja, M. M., Stacey, B. Neuropathic pain symptoms relative to overall pain rating. J Pain. 5 (9), 491-497 (2004).
- Imamura, Y., Kawamoto, H., Nakanishi, O. Characterization of heat hyperalgesia in an experimental trigeminal neuropathy in rats. Exp Brain Res. 116, 97-103 (1997).
- Chichorro, J. G., Zampronio, A. R., Souza, G. E., Rae, G. A. Orofacial cold hyperalgesia due to infraorbital nerve constriction injury in rats reversal by endothelin receptor antagonists but not non steroidal anti inflammatory drugs. Pain. 123 (1-2), 64-74 (2006).
- Kramer, P. R., Bellinger, L. L. Meal Duration as a Measure of Orofacial Nociceptive Responses in Rodents. J Vis Exp. (83), e50745 (2014).
- Rossi, H. L., et al. Characterization of bilateral trigeminal constriction injury using an operant facial pain assay. Neuroscience. 224, 294-306 (2012).
- Anderson, E. M., et al. Use of the Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) to Measure Changes in Nociceptive Behavior. J Vis Exp. (76), 50336 (2013).
