Abstract
Detecteren kleine concentraties van moleculen tot aan de individuele moleculen limiet heeft invloed op gebieden zoals vroege detectie van ziekten en fundamentele studies over het gedrag van moleculen. Single molecule detectietechnieken gewoonlijk gebruik labels zoals fluorescerende labels of quantum dots echter etiketten niet altijd beschikbaar, vergroten de kosten en complexiteit, en kan verstoren gebeurtenissen onderzocht. Optische resonatoren ontstaan als een veelbelovende manier om enkele moleculen te detecteren zonder het gebruik van labels. Momenteel de kleinste deeltje gedetecteerd door een niet-plasmonically versterkte bare optische resonator systeem oplossing een 25 nm polystyreen bol 1. We hebben een techniek die bekend staat als Frequency vergrendelen Optical Whispering Evanescent Resonator (bloem) dat deze limiet kunnen overtreffen en het bereiken van label-free single molecule detectie in waterige oplossing 2 ontwikkeld. Zoals signaalsterkte schalen met deeltje volume, ons werk is een> 100x improvement in de signaal-ruisverhouding (SNR) over de huidige stand van de techniek. Hier de procedures achteren bloem zijn voorgesteld in een poging om zijn gebruik in het veld te vergroten.
Introduction
Single molecule detectie experimenten ingezet om de hoeveelheid analyt die in biosensoren voor vroege detectie van ziekten en het onderzoek van de fundamentele eigenschappen van moleculen 3. Dergelijke experimenten worden typisch uitgevoerd met behulp labels echter etiketten niet altijd mogelijk verkrijgen voor een bepaald eiwit, verhogen de kosten, kan verstoren de gebeurtenissen bestudeerd en kan onhandig zijn, met name voor real time-eigen experimenten of point-of- care diagnostiek.
De huidige gouden standaard voor ongelabelde biosensoren is oppervlakteplasmonresonantie 4, maar de commerciële oppervlakte plasmon resonance systemen hebben typisch een typisch onderste detectielimiet in de orde van nM. Onlangs hebben optische resonatoren ontpopt als een veelbelovende technologie voor het label-free single molecule BioDetection 5. Optische resonatoren werk gebaseerd op de lange termijn (ns) opsluiting van licht 6,7. Licht is evanescentlygekoppeld in deze apparaten meestal via een optische vezel. Wanneer de golflengte van het licht dat door de vezel komt overeen met de resonantiegolflengte van de resonator, licht efficiënt paren aan de resonator. Deze gekoppelde licht totaal intern reflecteert binnen de holte resonator genereren van een verdwijnende veld in de nabijheid van de omtrek van de resonator. Aangezien deeltjes komen het verdwijnende veld en binden aan de resonator, de resonantiegolflengte van de resonator verandert evenredig met het volume van het deeltje 8.
Op het gebied van detectie vermogen, hebben microsferen resonatoren eerder is gebruikt om enkele influenza A-virus detecteren deeltjes (100 nm) 9,10. Recent zijn plasmonically versterkte microbolletjes optische resonatoren gebruikt om één runderserum albumine te detecteren moleculen 11 en 8-mer oligonucleotiden 12, maar deze benadering beperkt het deeltje capture gebied 0,3 um per 2 deondeugd. Groter gebied vast te leggen biosensoren zijn ideaal voor het maximaliseren van de kans op een deeltje detectie. Huidige-oplossing op basis-label vrij biosensing technologieën met grote (> 100 micrometer 2) capture gebieden zijn beperkt tot het opsporen van polystyreen deeltjes ≥ 25 nm.
We hebben een ongelabelde biosensoren gebaseerd op optische resonator techniek bekend als frequentievergrendeling Optical Whispering Evanescent Resonator (bloem) 13 (figuur 1) die in staat is tijdsopgeloste detectie van individuele moleculen in oplossing ontwikkeld. FLOWER maakt gebruik van de lange levensduur van foton microtoroıde optische resonatoren gecombineerd met een frequentie vergrendeling feedback control, evenwichtig detectie, en computationele filtering om kleine deeltjes te detecteren enkel eiwit moleculen. Het gebruik van frequentievergrendeling kan het systeem altijd volgen van de verschuiving van de resonantie microtoroıde als deeltjes binden, zonder te vegen of scan de laser golflengte bovengrote reeksen. De principes van de bloem kunnen worden gebruikt om de detectiemogelijkheden van andere technieken zoals plasmon enhancement verbeteren. Hierna worden de procedures voor het uitvoeren BLOEM beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experimentele Setup en Monstervoorbereiding
- Fabriceren microtoroids met de lithografie, etsen en smelten procedure zoals eerder beschreven 6. Fabriceer microtoroids op een siliciumwafel (chip) dat typisch een grote diameter van 80-100 urn en een kleinste diameter van 2 urn.
- Ontspan ongeveer een meter van de single-mode glasvezel (125 micrometer bekleding, 4,3 micrometer modus veld diameter) van de vezels spoel.
- In het midden van het afgewikkelde deel van de optische vezel, strippen een klein segment (2,5 cm) van de polymere coating rondom de optische vezel via wire strippers. Opmerking: Dit is het deel van de optische vezel die zal worden gebruikt om evanescently paar licht in de microtoroıde.
- Reinig de gestripte vezel met isopropanol alcohol en een pluisvrije doek.
- Houd dit gedeelte van de vezel vast met een vezelhouder van magnetisch klemmen.
- Dun de gestripte vezel tot ~ 500 nm door Melting en het trekken middels een waterstofatoom toorts en twee stappenmotoren bewegen in tegengestelde richtingen met 60 um / min. Plaats de optische vezel binnen het bovenste gedeelte van de vlam, die moet worden ~ 10 mm lang. Stoppen met het trekken van de vezel als de transmissie door de vezel stopt fluctuerende, die ofwel visueel kan worden gecontroleerd (door te kijken naar het licht dat zijdelings wordt verspreid van de vezel knipperen aan en uit), of door het aansluiten van de vezel van een fotodiode, die op een oscilloscoop is aangesloten .
- Aanhangen het ene uiteinde van de optische vezel en plaats deze in een kale vezel-adapter. Plaats dit uiteinde van de vezel in de ingang van de foto-ontvanger.
- Fiber paar het andere uiteinde van de vezel spoel laser met een vezeloptische koppelaar.
- Plaats de microtoroıde chip op een monsterhouder (roestvrij staal, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) met behulp van epoxy of dubbelzijdig plakband.
- Monteer de monsterhouder op een positioneertafel, dat bestaat uit een 3-as nano-positionering (nanocube) stadium (zie apparatuur lijst) op de top van een 3-assige micrometer. Voer alle experimenten op een pneumatisch geïsoleerde optische tafel om trillingen te minimaliseren.
- Grof positie het monster chip met behulp van de 3-assige micrometer.
- Lijn de-microtoroıde met chip parallel aan de optische vezel met behulp van de nano-klepstandsteller. Opmerking: Lijn de microtoroıde binnen een afstand van één golflengte van de input licht (~ 633 nm). Voor weergave van deze werkwijze gebruik van twee kolommen imaging (buis met objectief en camera, zie inventarislijst) gepositioneerd aan de bovenkant en aan de zijkant van de chip.
- Optimaliseren van de polarisatie van het laserlicht doorheen de optische vezel via een in-line polarisatie controller (zie inventarislijst) met een knop om de polarisatie te passen. Opmerking: optimale polarisatie wordt bereikt wanneer de gemeten dip in de transmissie van de optische vezel wordt het smalste. Observeer deze duik op een oscilloscoop (zie stap 2.2 voor meer informatie).
- Construereneen monster kamer door epoxying een glazen dekglaasje over het monster podium met een glazen microscoopglaasje als afstandhouder. Opmerking: Een plexiglas behuizing die de hele setup kan nuttig zijn voor het minimaliseren van luchtstromen zijn. Een kleine opening moet worden overgelaten om de oplossing via leiding te pompen.
- Thermisch evenwicht deeltjessuspensies of single-molecule waterige oplossingen ≥ 1 uur in een waterbad RT (~ 500 ml). Opmerking: De monsters worden verdund tot de gewenste concentratie in microcentrifuge buisjes met behulp van de bijbehorende buffers opgegeven door de fabrikant, bijvoorbeeld PBS of HEPES. Indien geen bindinggebeurtenissen gedetecteerd, verhoging van de zoutconcentratie van de buffer.
- Vortex deeltje bevattende oplossingen (1 ml) kort voor ~ 2 sec.
- Injecteer deeltjes bevattende oplossingen in de monsterkamer bij 1 ml / min onder toepassing van een 1 ml spuit pomp.
- Nadat het monster kamer is gevuld, schakelt u de injectiepomp.
- Wacht 30 seconden voordat het vastleggen van gegevens te minimaliserende effecten van mechanische trillingen gevolg van fluïdumstroom die de meting kunnen beïnvloeden.
2. Frequentie Locking
- Opnieuw koppelen de torus de optische vezel door het bewegen van de monsterhouder met nanopositioner, omdat de koppeling wordt verstoord als gevolg van de injectie van vloeistof.
- Zoek de resonantiegolflengte van de microtoroıde door het scannen van de computergestuurde laser invoer via verschillende golflengtes. Voer deze stap voor het sturen van een driehoekige golfvorm spanningssignaal om een piëzo-elektrisch element in de laserbesturing, dat de golflengte van de laser regelt. Voeren experimenten met zichtbaar licht (635 nm ± 2,5 nm) omdat er lage absorptie van licht in het water bij deze golflengte.
- Meet de lichttransmissie door de optische vezel door de stekker van de uitvoer van de optische vezel in een automatische uitgebalanceerde foto-ontvanger. Sluit de output van de foto-ontvanger in een oscilloscoop met een BNC kabel. Observeren on de oscilloscoop dat op de resonantie golflengte van de microtoroıde, transmissie via de optische vezel daalt.
- Bevestig de output van de foto-ontvanger de belangrijkste ingang van de frequentie vergrendeling terugkoppelregeleenheid (zie inventarislijst) via een kabel.
- Voer de frequentie vergrendeling feedback controller in autolock modus met behulp van top-of-peak vergrendeling met een dither frequentie van 2 kHz en een amplitude van oscillatie golflengte van 19 fm. Empirisch set de proportionele-integrale-afgeleide instellingen in de software-venster met behulp van Ziegler-Nichols tuning regels 14. Opmerking: Deze waarden hoeven slechts eenmaal aan het begin van alle experimenten.
- Auto-lock de golflengte van de laser om de resonantie golflengte van de microtoroıde. Voer deze stap na het vullen van de monsterkamer. Opmerking: Als de golflengteverschuiving te groot is, dan is de feedback controller slot verliezen en schakelt automatisch over naar de scanmodus om de resonantie golflengte locatie te vinden. Dit ocstraathonden voor golflengte verschuift groter dan ongeveer een lijnbreedte (ten minste 600 fm voor alle systemen hier onderzocht).
- Noteer de uitvoer van de terugkoppelregelaar bij 20 kHz met een 24-bit data acquisitie kaart. De gegevens te exporteren als een tekstbestand via data-acquisitie software.
3. Data Processing & Analysis
- Fourier de gegevens om te zetten in MATLAB.
- Lage passeren de gegevens met behulp van een "brick-wall" filter met een cut-off bij 1 kHz tot de opgelegde dither frequentie van 2 kHz te verwijderen (zie Aanvullende Code File screenshot 1).
- Computationeel notch de gegevens filteren met behulp van een raam grootte van 16 Hz. Let op: Dit wordt gedaan om bekende bronnen van ruis te verwijderen, in dit geval, 60 Hz elektronische ruis en zijn harmonischen, evenals 100 Hz (afkomstig van de laser driver) en de harmonischen (zie Aanvullende Code File screenshot 1).
- Omgekeerde Fourier transformatie van de data terug naar het tijdsdomein.
- Mediaanfilter de gegevens met behulp van een venstergrootte van 1001 monsters (zie Aanvullende Code File Screenshot 2).
- Lokaliseren stap veranderingen in de resonantie golflengte met behulp van de stappen vinden algoritme van Kerssemakers et al. 15.
- Genereren van histogrammen van de amplitude van elke binding stap.
- Bereken deeltjesgrootte met Eq. (1) (zie Discussie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deeltje binding gebeurtenissen zijn duidelijk gezien als een stap-achtige veranderingen in de resonantie golflengte van het microtoroıde na verloop van tijd (Figuur 2A). De hoogte van deze stappen worden getoond als een histogram in figuur 2B. De figuren 2-4 tonen vertegenwoordiger sporen uit de binding van exosomes (nanovesicles), 5 nm silica kralen, en single humaan interleukine-2-moleculen, respectievelijk. Het feit dat de stapvormige events schaal met een deeltjesgrootte blijkt dat de techniek correct is uitgevoerd. Dit kan worden geanalyseerd door het genereren van een histogram van stap hoogte (figuur 2B) en het vergelijken van de maximale instaphoogte waargenomen theoretische voorspellingen, zoals hieronder besproken.
Figuur 1. Blokschema toroid aftastsysteem. Licht van een afstembare diodelaser is gesplitst w et een gedeelte verzonden via de optische vezel die paren licht in de torus en het andere deel in rechtstreeks naar een ingang van een auto uitgebalanceerde foto-ontvanger. De uitgang van de optische vezel in de tweede ingang van de automatisch in evenwicht foto-ontvanger gezonden. De output van de foto-ontvanger wordt de terugkoppelregeleenheid die het laserlicht naar de waarde van de resonantie golflengte van de microtoroıde lokaliseren moduleert verstuurd. Als deeltjes binden aan de toroïde, de resonantiefrequentie verschuift. Het verschil tussen de golflengte van de laser en de resonantie golflengte van de microtoroıde is een proportionele-integrale-afgeleide controller die het mogelijk maakt de laser met de golflengte van de torus zo snel te passen en zo soepel mogelijk verzonden. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.
p_upload / 53.180 / 53180fig2.jpg "/>
Figuur 2. resonantiegolflengte veranderen in de tijd als 20 nm korrels binden aan het oppervlak van de microtoroıde. (A) Verschuiving resonantiegolflengte van het microtoroıde tijd als 20 nm korrels binden aan het oppervlak. (B) Histogram van de hoogten (amplitude) van elke resonantie golflengte step event. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. resonantiegolflengte tijd veranderen als individuele exosomes binden aan het oppervlak van de microtoroıde. Individuele bindinggebeurtenissen beschouwd als discrete veranderingen (treden) in de resonantiegolflengte tijd."> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. resonantiegolflengte tijd veranderen als 5 nm silicapareltjes binden aan het oppervlak van de microtoroıde. Deeltjes hechten aan het oppervlak van de toroids via passieve adsorptie. Deeltje binding gebeurtenissen worden gezien als discrete stappen in de resonantie golflengte van de torus in de tijd. Desorptie van een deeltje wordt gezien als een stap naar beneden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. resonantiegolflengte tijd veranderen als IL-2-moleculen binden aan het oppervlak van de microtoroıde. Macromoleculaire bindingsgebeurtenissenworden beschouwd als discrete stappen in de resonantiegolflengte tijd. Deze stappen lijken op die in figuur 4 als de twee soorten deeltjes van ongeveer vergelijkbare grootte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Als deeltjes bindt, de resonantie golflengte (λ) van de torus toeneemt. Wanneer een deeltje unbinds de resonantiegolflengte dienovereenkomstig afneemt (een naar beneden event). De deeltjesdiameter (d) kan worden bepaald door middel van histogrammen van de amplitude van elke golflengte stap. De hoogte van elke golflengtestap varieert als gevolg van variaties omvang van de gebonden deeltjes en door de ligging van de microtoroıde waarbij het deeltje bindt. De maximale verandering in resonantiegolflengte (stap hoogte) optreedt wanneer deeltjes binden aan de equator van de microtoroıde wanneer het elektrische veld (E 0, max) is een maximum. Deze maximale stap hoogte (Δλ) is gerelateerd aan deeltjesdiameter door middel van Eq. (1) 8, waarin a de straal van de deeltjes, D een diëlektrische constante basis van de brekingsindex van het gebonden deeltje en de omringende media, V m is de modus volume van lict binnen de microtoroıde bepaald door middel van eindige elementen simulaties 2 en E 0 (rs) is de amplitude van het elektrische veld op het deeltje evenaar mede bepaald door middel van eindige elementen simulaties:
Omkeren Eq. (1) geeft aan dat de signaalsterkte (Δλ) schalen met deeltje volume (3). Onze diëlektrische factor is gedefinieerd als:
waarbij de brekingsindex van het omringende medium, en de brekingsindex van het deeltje. Theoretische ramingen voor de deeltjesgrootte op basis van vergelijking (1) en extra histogrammen en grootte calningen worden in 2, 16.
FLOWER kunnen worden gemodificeerd sneller volgen door verhoging van de frequentie waarmee de frequentie vergrendeling terugkoppelregeleenheid volgt de golflengte van de microtoroıde. De gegevensverwerking kan worden gewijzigd door een voortschrijdend gemiddelde in plaats van een mediaan filter en bindingsgebeurtenissen alsnog gewonnen worden, maar de mediaan filter veroorzaakt stap randen beter worden bewaard. Beperkingen van deze techniek omvatten het feit dat de verschuiving van de golflengte microtoroıde upon deeltje binding afhankelijk van waar de resonator het deeltje landt. Aldus bevestiging van de binding van een enkel deeltje is gebaseerd op het genereren van een histogram van vele afzonderlijke bindingsgebeurtenissen. Indien geen duidelijke bindinggebeurtenissen gedetecteerd, het verhogen van de zoutconcentratie van het oplosmiddel helpt.
De betekenis van deze techniek met betrekking tot bestaande werkwijzen is dat er geen vereiste labels aan het doelmolecuul ondervragen.Selectieve binding vereist echter het functionaliseren van de sensor met antilichamen. Andere voordelen zijn het feit dat sinds microtoroıde resonatoren hebben grotere capture gebieden in vergelijking met hoge gevoeligheid surface plasmon resonance methoden, deeltje binding gebeurtenissen vaker optreden. Bovendien, omdat bloem geen fluorescente labels die kunnen photobleach nodig, bloem kan lange (> 10 sec) metingen met snelle (milliseconde) tijdsresolutie.
Kritische stappen in het protocol onder het uitlijnen van de optische vezel conus met de microtoroıde. Zodra de ringkern is ondergedompeld in vloeistof, teveel beweging van de vezel door middel van vloeistof kan leiden tot de conus te breken, waardoor het beëindigen van het experiment. Bloem In zijn huidige formulering daarom niet geschikt voor experimenten op de tijdschaal van uren. Daarnaast, zodra de microtoroıde is ondergedompeld in vloeistof en deeltjes te binden, de kwaliteitsfactor (Q) onherroepelijk druppels over een tijdschaal van uren en piek locking kan uiteindelijk instabiel worden. In deze situatie een nieuwe inrichting is vereist. Omdat we dithering onze laser frequentie in een zeer klein bereik rond de resonantie piek, is BLOEM niet tegelijk scannen over het hele resonantiespectrum en dus geen veranderingen in de kwaliteit factor in real-time te meten als deeltjes te binden. Kijkend naar de kwaliteit factor voor en na de binding van slechts een paar deeltjes, hebben we geen significante Q-factor degradatie zien. We verwachten dat dit is omdat de oorspronkelijke pristine toroids relatief lage Q-factor (geladen Q in water van ~ 1x10 5 -5x10 6).
Wij merken op dat lasergeïnduceerde fluctuatie ruis wordt afgetrokken met behulp van de automatische foto-ontvanger in evenwicht. We minimaliseren van schommelingen van de optische vezel tegen de torus door het plaatsen van de vezels in direct contact het microtoroıde. Bovendien, als PID parameters niet juist zijn ingesteld, zal de schommelingen lijken, dat wil zeggen, zal het systeem niet snel en accurately spoor golflengte verschuivingen. Ziegler-Nichols tuning regels worden gebruikt om correct te stellen de PID instellingen 14. Door de hier beschreven procedures, moet het mogelijk zijn te detecteren en maat nanodeeltjes variëren van honderden nanometers tot op enkele nanometers, waaronder een- biologische moleculen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tunable diode laser | Newport | TLB-6300 | |
| Laser controller | Newport | TLB-6300-LN | |
| Frequency locking feedback controller | Toptica Photonics | Digilock 110 | |
| Auto-balanced photoreceiver | Newport | Model 2007 | |
| In-line polarization controller | General Photonics | PLC-003-S-90 | |
| 24-bit data acquisition card | National Instruments | NI-PCI-4461 | |
| Recombinant human interleukin-2 | Pierce Biotechnology | R201520 | |
| 20 nm polystyrene beads | Thermo Scientific | 3020A | |
| NanoCube XYZ Piezo Stage | Physik Instrumente | P-611.3 | |
| Optical table | Newport | VH3660W-OPT | |
| Objective lens for imaging column | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| Imaging column (adaptor tube) | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| High-Res CCD camera for imaging column | Edmund Industrial Optics | NT39244 |
References
- Lu, T., et al. High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).
- Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators. Light: Science and Applications. , (2016).
- Knight, A. Single molecule biology. , Elsevier/Academic. (2009).
- Jonsson, U., et al. Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology. BioTechniques. 11, 620-627 (1991).
- Vollmer, F., Arnold, S. Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules. Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).
- Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip. Nature. 421, 925-928 (2003).
- Vahala, K. J.
- Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption. Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).
- Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).
- He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers. Nat Nano. 6, 428-432 (2011).
- Dantham, V. R., et al. Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity. Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).
- Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform. Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).
- Su, J. Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators. ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).
- Åström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems : an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2008).
- Kerssemakers, J. W., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442, 709-712 (2006).
- Su, T. -T. J. Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators. , California Institute of Technology. (2014).
