Abstract
Rilevamento piccole concentrazioni di molecole fino al limite singola molecola ha un impatto su settori quali la diagnosi precoce della malattia, e studi fondamentali sul comportamento delle molecole. Tecniche di rilevazione di singola molecola comunemente utilizzano etichette come etichette fluorescenti o punti quantici, tuttavia, le etichette non sono sempre disponibili, aumentare i costi e la complessità, e possono perturbare gli eventi in fase di studio. Risonatori ottici sono emersi come un mezzo promettente per rilevare singole molecole senza l'uso di etichette. Attualmente la più piccola particella rilevata da un sistema di risuonatore non plasmonically potenziato nudo ottica in soluzione è a 25 nm di polistirolo sfera 1. Abbiamo sviluppato una tecnica nota come frequenza di blocco ottico Whispering Evanescent risonatore (fiore) in grado di superare questo limite e ottenere la diagnosi singola molecola label-free in soluzione acquosa 2. La potenza del segnale scale con il volume delle particelle, il nostro lavoro rappresenta un> 100x improvement nel rapporto segnale-rumore (SNR) rispetto allo stato attuale della tecnica. Qui le procedure dietro fiore sono presentati in uno sforzo per aumentare il suo utilizzo nel settore.
Introduction
Esperimenti rilevamento molecole singole sono utili per ridurre la quantità di analita usato in biosensori, per la diagnosi precoce della malattia, e per esaminare le proprietà fondamentali delle molecole 3. Tali esperimenti sono tipicamente eseguite utilizzando etichette, tuttavia, le etichette non sono sempre possibile ottenere per una particolare proteina, aumenta il costo, può perturbare gli eventi oggetto di studio, e può essere scomodo, particolarmente per tempo reale in loco esperimenti o point-of- Diagnostica di cura.
Il gold standard attuale per biosensing label-free è risonanza plasmonica di superficie 4, ma i sistemi commerciali di risonanza plasmonica di superficie in genere hanno un tipico limite inferiore di rilevamento dell'ordine di nM. Recentemente, risonatori ottici sono emersi come una tecnologia promettente per libero etichetta singola molecola biorilevazione 5. Risonatori ottica lavoro basato sul lungo termine (ns) confinamento della luce 6,7. La luce è evanescentlyaccoppiato in questi dispositivi tipicamente attraverso una fibra ottica. Quando la lunghezza d'onda della luce che attraversa la fibra corrisponde alla lunghezza d'onda di risonanza del risonatore, illuminare efficientemente accoppia il risonatore. Questa luce accoppiata riflette totalmente internamente la cavità del risonatore a generare un campo evanescente in prossimità della circonferenza del risonatore. Come particelle entrano campo evanescente e si legano al risuonatore, la lunghezza d'onda di risonanza dei cambiamenti risonatore in proporzione al volume della particella 8.
In termini di capacità di rilevamento, risonatori di microsfere sono stati in precedenza utilizzata per rilevare l'influenza A solo particelle virali (100 nm) 9,10. Recentemente, plasmonically avanzata microsfere risonatori ottici sono stati utilizzati per rilevare siero albumina bovina singola molecole 11 e oligonucleotidi 8-mer 12, tuttavia questo approccio limita l'area di cattura delle particelle di 0,3 micron 2 per device. Più grandi biosensori zona di cattura sono ideali per massimizzare la probabilità di rilevamento delle particelle. Le attuali tecnologie basate su soluzioni label-free biosensori con grandi (> 100 micron 2) aree di acquisizione si sono limitati a rilevare particelle di polistirene ≥ 25 nm.
Abbiamo sviluppato un sistema di biosensori label-free basato sulla tecnologia risonatore ottico noto come frequenza di blocco ottico Whispering Evanescent risonatore (FIORE) 13 (Figura 1), che è in grado di rilevare in tempo risolto di singole molecole in soluzione. FIORE utilizza la lunga durata fotone di risonatori ottici microtoroid combinati con frequenza di blocco di controllo di retroazione, il rilevamento equilibrato, e il filtraggio di calcolo per rilevare piccole particelle fino a singole molecole proteiche. L'uso di aggancio in frequenza consente al sistema di monitorare sempre la risonanza spostamento del microtoroid come particelle si legano, senza la necessità di spazzare o la scansione della lunghezza d'onda del laser sopragrandi intervalli. I principi di FLOWER possono essere utilizzati per migliorare le capacità di rilevazione delle altre tecniche, tra cui la valorizzazione plasmonica. In ciò che segue, vengono descritte le procedure per l'esecuzione FIORE.
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Protocol
1. Setup sperimentale e preparazione del campione
- Realizzare microtoroids utilizzando la litografia, incisione, e di fusione procedura descritta in precedenza 6. Realizzare microtoroids sulla cima di un wafer di silicio (chip) che tipicamente hanno un diametro maggiore di 80-100 micron, e un diametro minore di 2 micron.
- Rilassatevi circa un metro di fibra ottica monomodale (125 rivestimento micron, 4,3 micron modo diametri campo) dalla bobina di fibra.
- Al centro della parte srotolato della fibra ottica, spogliare un piccolo segmento (2,5 cm) del rivestimento polimerico attorno alla fibra ottica utilizzando spellafili. Nota: Questa è la porzione della fibra ottica che verrà utilizzato per evanescently luce coppia nel microtoroid.
- Pulire la fibra spogliato con alcool isopropanolo e un panno senza strofinare.
- Mantenere questa parte della fibra in posizione utilizzando un supporto di fibra in ganci magnetici.
- Sottile la fibra spogliato a ~ 500 nm da Melting e tirando con una torcia idrogeno e due motori passo-passo che si muovono in direzioni opposte a 60 micron / min. Posizionare la fibra ottica all'interno della porzione superiore della fiamma, che dovrebbe essere ~ altezza 10 mm. Arrestare tirando la fibra quando la trasmissione attraverso la fibra ferma fluttuante, che può essere controllato visivamente (guardando la luce che è dispersa lateralmente dal lampeggio fibra on e off) o collegando la fibra ad un fotodiodo che è attaccato ad un oscilloscopio .
- Cleave una estremità della fibra ottica e inserirla in un adattatore fibra nuda. Inserire questa estremità della fibra all'ingresso del fotoricevitore.
- Fibra coppia l'altra estremità della bobina fibra laser utilizzando un accoppiatore a fibre ottiche.
- La fiche microtoroid sopra un portacampioni (acciaio inox, 37,8 mm x 6.4 mm x 3.2 mm) utilizzando resina epossidica o nastro biadesivo.
- Montare il porta-campione in cima ad una fase di posizionamento che si compone di un 3 assi nano-posizionamento (nanocube) fase (vedere inventario) sulla cima di un micrometro a 3 assi. Eseguire tutti gli esperimenti su un tavolo ottico pneumaticamente isolata per ridurre al minimo le vibrazioni.
- Posizione grossolana il chip campione utilizzando un micrometro a 3 assi.
- Allineare il-microtoroid contenente chip di parallelamente alla fibra ottica utilizzando nano-posizionatore. Nota: allineare il microtoroid entro una distanza di una lunghezza d'onda della luce di ingresso (~ 633 nm). Per la visualizzazione di questo processo utilizzare due colonne di imaging (tubo con lente obiettivo e telecamera, vedere inventario) posizionato sulla parte superiore e sul lato del chip.
- Ottimizzazione della polarizzazione della luce laser diretta attraverso la fibra ottica utilizzando un controllore di polarizzazione in linea (vedere inventario) con una manopola per regolare la polarizzazione. Nota: polarizzazione ottimale si ottiene quando il dip misurata nella trasmissione della fibra ottica appare più stretto. Osserva questo tuffo su un oscilloscopio (vedere il punto 2.2 per maggiori dettagli).
- Costruireuna camera del campione da epoxying vetrino coprioggetti sulla fase del campione con un vetrino per microscopio come distanziatore. Nota: Una recinzione in plexiglass che copre l'intera installazione può essere utile per ridurre al minimo le correnti d'aria. Una piccola apertura dovrebbe essere lasciato per consentire la soluzione da pompare in utilizzando tubi.
- Equilibrare termicamente particelle sospensioni o soluzioni acquose singola molecola per ≥ 1 ora in un bagno d'acqua RT (~ 500 ml). Nota: I campioni vengono diluiti alla concentrazione desiderata in provette da microcentrifuga utilizzando i buffer associati specificati dal costruttore, ad esempio, PBS o HEPES. Se non vengono rilevati eventi di legame, aumentare la concentrazione di sale del buffer.
- Particella Vortex contenenti soluzioni (1 ml) per breve tempo per ~ 2 sec.
- Iniettare soluzioni contenenti particelle nella camera campione a 1 ml / min usando una pompa a siringa da 1 ml.
- Dopo la camera del campione ha riempito, spegnere la pompa a siringa.
- Attendere 30 secondi prima di registrare i dati per ridurre al minimogli effetti delle vibrazioni meccaniche derivanti dal flusso di fluido che può influenzare la misura.
Blocco 2. Frequenza
- Re-coppia toroide alla fibra ottica spostando il supporto del campione con il nanopositioner, perché l'accoppiamento sarà disturbata a causa di iniezione di liquido.
- Individuare la lunghezza d'onda di risonanza del microtoroid attraverso la scansione laser ingresso computer controllato attraverso una varietà di lunghezze d'onda. Eseguire questo passaggio inviando un segnale di forma d'onda di tensione triangolare un elemento piezoelettrico all'interno del controller laser che regola la lunghezza d'onda del laser. Effettuare esperimenti usando la luce visibile (635 nm ± 2,5 nm) in quanto vi è un basso assorbimento di luce in acqua a questa lunghezza d'onda.
- Misurare la trasmissione della luce attraverso la fibra ottica collegando l'uscita della fibra ottica in un fotoricevitore auto-equilibrata. Inserire l'uscita del fotoricevitore in un oscilloscopio utilizzando un cavo BNC. Osservare on l'oscilloscopio che alla lunghezza d'onda di risonanza del microtoroid, trasmissione attraverso la fibra ottica gocce.
- Attaccare l'uscita del fotoricevitore all'ingresso principale della frequenza bloccaggio regolatore a reazione (vedere inventario) tramite un cavo.
- Eseguire il controller di feed back di blocco in modalità di blocco automatico con picco top di chiusura con una frequenza di dithering di 2 kHz e un'ampiezza di lunghezza d'onda di oscillazione del 19 fm. Empiricamente configurare le impostazioni proporzionale integrale derivati nella finestra del software utilizzando Ziegler-Nichols regole di tuning 14. Nota: questi valori devono solo essere impostata una volta all'inizio di tutti gli esperimenti.
- Auto-bloccare la lunghezza d'onda del laser alla lunghezza d'onda di risonanza del microtoroid. Eseguire questo passaggio dopo aver riempito la camera del campione. Nota: Se lo spostamento della lunghezza d'onda è troppo grande, quindi il regolatore di feedback perderà di blocco e passare automaticamente alla modalità di scansione al fine di individuare la posizione di risonanza lunghezza d'onda. Questo occurs per lunghezza d'onda si sposta più grande di circa un linewidth (almeno 600 fm per tutti i sistemi esaminati qui).
- Registrare l'uscita del regolatore a reazione a 20 kHz utilizzando una scheda di acquisizione dati a 24 bit. Esportare i dati come file di testo tramite software di acquisizione dati.
3. Elaborazione Dati e analisi
- Fourier trasformare i dati in MATLAB.
- Passa-basso i dati utilizzando un filtro "muro di mattoni" con un cutoff a 1 kHz per rimuovere la frequenza di dithering imposto di 2 kHz (vedi codice supplementare sul file Schermata 1).
- Notch computazionalmente filtrare i dati utilizzando una dimensione della finestra di 16 Hz. Nota: Questo viene fatto per rimuovere fonti note di rumore, in questo caso, 60 Hz rumore elettronico linea e le sue armoniche, nonché 100 Hz (proveniente dal driver laser) e sue armoniche (vedi codice supplementare file Schermata 1).
- Fourier inversa trasformare i dati di nuovo nel dominio del tempo.
- Filtro mediano i dati utilizzando una finestradimensioni di 1.001 campioni (vedi Codice supplementare sul file Schermata 2).
- Individuare cambio di passo nella lunghezza d'onda di risonanza utilizzando l'algoritmo passo ricerca di Kerssemakers et al. 15.
- Genera istogrammi di ampiezza di ciascuna fase di legame.
- Calcola dimensione delle particelle con Eq. (1) (vedi Discussione).
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Representative Results
Eventi di legame delle particelle sono chiaramente visto come variazioni a gradino in lunghezza d'onda di risonanza del microtoroid nel tempo (Figura 2A). Le altezze di questi passaggi sono indicati come un istogramma della figura 2B. Figure 2-4 mostrano tracce rappresentative del legame di esosomi (nanovesicles), 5 nm perline di silice, e single umane interleuchina-2 molecole, rispettivamente. Il fatto che gli eventi a gradino scala con granulometria mostra che la tecnica è stata eseguita correttamente. Questo può essere analizzata generando un istogramma di altezze gradini (Figura 2B) e confrontando l'altezza massima passo osservato previsioni teoriche, come discusso di seguito.
Figura 1. Schema a blocchi del sistema di rilevamento toroide. La luce da un diodo laser sintonizzabile è Spalato w ith una porzione inviato attraverso la fibra ottica che accoppia la luce in toroide e l'altra porzione inviato direttamente in un ingresso di un fotoricevitore auto-equilibrata. L'uscita della fibra ottica viene inviato nel secondo ingresso del fotoricevitore auto-equilibrato. L'uscita del fotoricevitore viene inviato al controllore feedback che modula la luce laser per individuare il valore della lunghezza d'onda di risonanza del microtoroid. Come particelle si legano al toroide, gli spostamenti di frequenza di risonanza. La differenza tra la lunghezza d'onda del laser e la lunghezza d'onda di risonanza del microtoroid viene inviato ad un controllore proporzionale-integrale-derivativo che consente al laser per abbinare la lunghezza d'onda del toroide modo più rapido e agevole possibile. Fare click qui per visualizzare un grande versione di questa figura.
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Figura 2. Resonance cambiamento della lunghezza d'onda nel tempo di 20 nm perline legano alla superficie del microtoroid. (A) Spostamento in risonanza lunghezza d'onda del microtoroid nel tempo di 20 nm perline legano alla superficie. (B) Istogramma delle altezze (ampiezze) di ogni evento di risonanza lunghezza d'onda passo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Resonance cambiamento della lunghezza d'onda nel tempo come singoli esosomi legano alla superficie del microtoroid. Eventi di legame individuali sono considerati come variazioni discrete (passi) a lunghezza d'onda di risonanza nel tempo."> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Resonance cambiamento della lunghezza d'onda nel tempo 5 nm perline di silice si legano alla superficie del microtoroid. Particelle aderire alla superficie del toroide tramite adsorbimento passivo. Particelle eventi vincolanti sono visti come passi discreti in lunghezza d'onda di risonanza del toroide nel tempo. Desorbimento di una particella è visto come un passo verso il basso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Resonance cambiamento della lunghezza d'onda nel tempo come IL-2 molecole legano alla superficie del microtoroid. Eventi di legame macromolecolarisono visti come passi discreti in lunghezza d'onda di risonanza nel tempo. Questi passaggi sono simili a quelli in figura 4, come i due tipi di particelle sono di dimensioni più o meno simili. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Come si lega una particella, la lunghezza d'onda di risonanza (λ) del toroide aumenta. Se una particella non associa, la lunghezza d'onda di risonanza diminuisce corrispondentemente (un evento step-down). Il diametro delle particelle (d) può essere determinata attraverso istogrammi di ampiezza di ogni passo di lunghezza d'onda. L'altezza di ogni gradino d'onda varia a causa di variazioni dimensionali della particella legato e causa la posizione sulla microtoroid cui si lega la particella. La variazione massima della risonanza lunghezza d'onda (gradino) si verifica quando le particelle si legano all'equatore del microtoroid dove il campo elettrico (E 0, max) è massimo. Questa altezza massima gradino (Δλ) è legato alla diametro delle particelle attraverso Eq. (1) 8, dove a è il raggio della particella, D è una costante dielettrica in base all'indice di rifrazione della particella legato e suoi media circostanti, m V è il volume modalità di light all'interno microtoroid determinato attraverso simulazioni ad elementi finiti 2, e E 0 (r s) è l'ampiezza del campo elettrico all'equatore particella determinata anche attraverso simulazioni ad elementi finiti:
Inversione Eq. (1) indica che l'intensità del segnale (Δλ) scale con volume di particelle (3). Il nostro fattore dielettrico è definito come:
dove è l'indice di rifrazione del mezzo circostante, ed è indice di rifrazione della particella. Stime teoriche per granulometria basato su equazione (1), nonché istogrammi e dimensioni cal aggiuntivical- sono presentati in 2, 16.
Fiore può essere modificato per l'inseguimento veloce aumentando la frequenza alla quale la frequenza di bloccaggio regolatore a reazione segue la lunghezza d'onda della microtoroid. La procedura di elaborazione dati può essere modificato utilizzando una media mobile, invece di un filtro mediano, e gli eventi di legame può ancora essere recuperato, ma il filtro mediano provoca bordi passo per essere meglio conservati. Limitazioni di questa tecnica includono il fatto lo spostamento della lunghezza d'onda del microtoroid dal legame delle particelle dipende dove sul risonatore terre particelle. Così, la conferma del legame di una singola particella si basa sulla generazione di un istogramma di numerosi eventi di legame distinti. Se non vengono rilevati eventi di legame, aumentando la concentrazione di sale del solvente aiuta.
L'importanza di questa tecnica per quanto riguarda i metodi esistenti è che non vi siano etichette necessarie per interrogare la molecola bersaglio.Legame selettiva tuttavia richiede funzionalizzazione il sensore con anticorpi. Altri vantaggi includono il fatto che da risonatori microtoroid hanno zone di cattura più grandi rispetto ai metodi ad alta sensibilità risonanza plasmonica di superficie, gli eventi di legame delle particelle sono maggiori probabilità di verificarsi. Inoltre, poiché FIORE non richiede tag fluorescenti che possono photobleach, FIORE è capace di lunghi (> 10 sec) misure con veloce (millisecondi) risoluzione temporale.
Passaggi critici all'interno del protocollo comprendono allineando il cono in fibra ottica con il microtoroid. Una volta che il toroide è immerso nel liquido, troppo movimento della fibra attraverso liquido può causare la rottura del cono, ponendo fine dell'esperimento. FLOWER nella sua formulazione attuale è quindi inadatto per esperienze sulla scala temporale di ore. Inoltre, una volta che il microtoroid è stato immerso nella liquidi e particelle legare, il fattore di qualità (Q) scende irrimediabilmente su un arco temporale di ore e peak llocco può eventualmente diventare instabile. In questa situazione è necessario un nuovo dispositivo. Perché noi dithering nostra frequenza laser in una gamma molto piccola intorno al picco di risonanza, FIORE non analizza simultaneamente per l'intero spettro di risonanza e quindi non misurare le variazioni di fattore di qualità in tempo reale come particelle si legano. Guardando il fattore di qualità prima e dopo il legame di poche particelle, non vediamo degrado significativo fattore Q. Ci aspettiamo che questo è perché i toroidi incontaminate originali hanno relativamente basso fattore Q (Q caricata in acqua di ~ 1x10 5 -5x10 6).
Notiamo che indotta da laser rumore fluttuazione viene sottratto utilizzando il fotoricevitore auto-bilanciato. Minimizziamo fluttuazioni della fibra ottica contro toroide posizionando la fibra in contatto diretto microtoroid. Inoltre, se i parametri PID non sono impostati correttamente, appariranno le fluttuazioni, vale a dire, il sistema non sarà rapidamente e accurately pista di lunghezza d'onda turni. Regole di tuning Ziegler-Nichols possono essere utilizzati per impostare correttamente il PID impostazioni 14. Seguendo le procedure descritte qui, dovrebbe essere possibile rilevare e nanoparticelle di dimensioni che vanno da centinaia di nanometri fino a pochi nanometri, tra singole molecole biologiche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tunable diode laser | Newport | TLB-6300 | |
| Laser controller | Newport | TLB-6300-LN | |
| Frequency locking feedback controller | Toptica Photonics | Digilock 110 | |
| Auto-balanced photoreceiver | Newport | Model 2007 | |
| In-line polarization controller | General Photonics | PLC-003-S-90 | |
| 24-bit data acquisition card | National Instruments | NI-PCI-4461 | |
| Recombinant human interleukin-2 | Pierce Biotechnology | R201520 | |
| 20 nm polystyrene beads | Thermo Scientific | 3020A | |
| NanoCube XYZ Piezo Stage | Physik Instrumente | P-611.3 | |
| Optical table | Newport | VH3660W-OPT | |
| Objective lens for imaging column | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| Imaging column (adaptor tube) | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| High-Res CCD camera for imaging column | Edmund Industrial Optics | NT39244 |
References
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