Introduction
चिकित्सा अनुसंधान मानव कोशिका लाइनों और पशु मॉडल दोनों के अध्ययन से बेहद लाभ हुआ है। सेल लाइनों बेहतर है एक प्रणाली में घटकों के नियंत्रण, साथ ही उचित जीव से कोशिकाओं के उपयोग के लिए अनुमति देते हैं। सेल लाइनों प्रतिक्रियाओं 1 को प्रभावित कर सकता है, जो अन्य कोशिकाओं, स्ट्रोमल घटक है, और अंगों के प्रभाव पुनरावृत्ति नहीं हो सकता है, क्योंकि अधिक प्रतिनिधि, जबकि स्वास्थ्य और रोग के लिए जिम्मेदार हो सकता है, जो तंत्र की एक काफी सरल स्नैपशॉट प्रस्तुत करता है, मानव कोशिकाओं के साथ कार्य करना। दूसरी ओर, पशु मॉडल, मानव रोग और आनुवंशिक विविधता reproducing में पूरी तरह से सही नहीं है, हालांकि, अधिकांश मॉडल 2,3 में पूरे जानवर प्रणालियों के इनपुट के लिए अनुमति देकर आगे अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।
कमियों को अलग, दोनों तरीकों अपने लाभ और पूरक हैं। हालांकि, मुख्य लक्ष्य एक पूरा शरीर, बहु अंग प्रणाली में मानव कोशिकाओं और अंगों का अध्ययन करने के लिए बनी हुई है। तदनुसार, शोधों Tak हैबेहतर अंतर्निहित तंत्र की बीमारी को काबू करने के क्रम में, मानव अंगों और रोगियों से निकाले ऊतकों के अध्ययन की सुविधा में काफी प्रगति एन। शोधों जिससे पूरे शरीर में और उचित कोशिकाओं में उपचार और रोगों के परिणाम का अध्ययन सेल और पशु काम 4 के बीच दोनों दुनिया के सर्वश्रेष्ठ प्रदान करने का लाभ प्रदान करता है।
शोधों खामियों के बिना भी नहीं है। मानव रोगियों से काटा नमूनों, मेजबान से हटाने पर, तुरंत ischemia और वे अन्यथा संरक्षित किया जाएगा, जिसमें से अन्य बाहरी कारकों के अधीन हैं। यह तनाव प्रेरित आणविक और आनुवंशिक परिवर्तन में परिणाम है, और बाद में पढ़ाई में पूर्वाग्रह पैदा हो सकती है। इसलिए, बहुत प्रयास सबसे अच्छा बहाव के अध्ययनों से 5 के लिए अंग और सेल अखंडता की रक्षा करने के लिए सख्त तरीकों के माध्यम से ऊतकों निकालने और प्रसंस्करण में डाल दिया गया है। तरीकों ओ का चयन करते समय महत्वपूर्ण बात है, भविष्य के आवेदनों को बारीकी से विचार किया जाना चाहिएएफ कुछ तरीकों सेलुलर घटकों के लिए हानिकारक हो सकता है, के रूप में मानव नमूनों के प्रसंस्करण और दूसरों को बख्शते हुए रास्ते संकेतन।
मानव ऊतकों से जुड़े किसी भी अनुसंधान के लिए, विनियामक मुद्दों को संबोधित किया जाना चाहिए। Tuskegee और Belmont रिपोर्ट के बाद जैव चिकित्सा अनुसंधान निहित जोखिम अक्सर अपरिहार्य नैतिक दुविधाओं 6 में जिसके परिणामस्वरूप के साथ जुड़े थे कि तथ्य की स्वीकार्यता बढ़ रही है वहां गया था। राष्ट्रीय मानकों के लिए आवश्यकता को स्वीकार किया गया था और संघीय सरकार Belmont रिपोर्ट के सिद्धांतों की रक्षा (व्यक्तियों, उपकार, न्याय के लिए सम्मान) करने के लिए एक साधन के रूप में संस्थागत समीक्षा बोर्ड (IRBs) बनाया।
किसी भी संस्था के आईआरबी अनुसंधान प्रतिभागियों की सुरक्षा के लिए जिम्मेदार हैं, जो डॉक्टरों, शोधकर्ताओं और समुदाय के सदस्यों की एक समिति है। यह स्वैच्छिक सहमति जैव चिकित्सा अनुसंधान अध्ययन के सभी प्रतिभागियों से प्राप्त होने की आवश्यकता है, और इस सहमति के एक सूचित सहमति के लिए में प्रलेखित किया कि आरएम। सूचित सहमति की प्रक्रिया में एक को सूचित निर्णय एक अध्ययन में नामांकन के लिए, या भागीदारी जारी रखने के लिए किया जाए या नहीं पर बनाया जा सकता है, ताकि एक भागीदार के लिए पर्याप्त जानकारी प्रदान करना है। इस संबंध में सूचित सहमति दस्तावेज़ अच्छा पठनीयता होनी चाहिए और आसानी से लक्ष्य की आबादी से (6 वीं से 8 वीं कक्षा पढ़ स्तर) समझा जा सकता है कि भाषा में लिखा जाना चाहिए। बलात्कार या अनुचित प्रभाव की संभावना को कम से कम किया जाना चाहिए, और इस विषय की भागीदारी पर विचार करने के लिए पर्याप्त समय दिया जाना चाहिए। प्रतिभागी को भी दंड के बिना अध्ययन के दौरान किसी भी स्तर पर सहमति वापस लेने के लिए अपने अधिकार का प्रयोग करने की अनुमति दी जानी चाहिए। स्वैच्छिक सूचित सहमति अनुसंधान के क्षेत्र में एक विषय की भागीदारी के लिए एक अनिवार्य पूर्व अपेक्षित है और यह भी 7 कानूनी रूप से प्रभावी है।
मानव की सुरक्षा के लिए नियमों के अनुसार के रूप में विषयों 21 सीएफआर 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), अध्ययन प्रतिभागियों अनुसंधान के उद्देश्य के बारे में सूचित किया जाना चाहिए, अनुसंधान में शामिल प्रक्रियाओं, भागीदारी के लिए विकल्प, समाज के लिए और संभवतः अलग-अलग करने के लिए अनुसंधान के सभी निकट जोखिम और असुविधाएँ (न केवल शारीरिक चोट, लेकिन यह भी संभव है, मनोवैज्ञानिक, सामाजिक या आर्थिक नुकसान, परेशानी, या असुविधा सहित), लाभ, विषय भाग लेने की उम्मीद है समय की लंबाई, व्यक्ति की भागीदारी स्वैच्छिक है यह दर्शाता है कि बयान सवालों करने के लिए या एक शोध से संबंधित चोट या आपातकाल की स्थिति में जवाब के लिए संपर्क करने के लिए और भाग लेने के लिए है कि इनकार ऐसे नियमित चिकित्सीय देखभाल में एक समझौते के रूप में किसी भी परिणाम या लाभ के किसी भी हानि में परिणाम नहीं होगा प्रतिभागी अन्यथा हकदार है कि गोपनीयता और से वापस लेने का अधिकार के अधीन के अधिकार के बारे में अंत में एक बयान उसकी / उसके निदान का एक परिणाम के रूप में प्राप्त होता है, और करने के लिएकिसी भी परिणाम के बिना किसी भी समय अध्ययन। अध्ययन के दौरान सहमति वापस लेने वाले प्रतिभागियों से ऊतक नमूनों बैंकिंग नहीं किया जाना चाहिए और तुरंत समाप्त हो जाना चाहिए। सूचित सहमति से एक या अधिक तत्वों की माफी व्यावहारिक रूप से आवश्यक तत्वों को या आवश्यक तत्वों लागू नहीं कर रहे हैं, जहां के अध्ययन के लिए एक परिवर्तन के बिना नहीं किया जा सकता है कि कुछ शोध परियोजनाओं के लिए आईआरबी से प्राप्त किया जा सकता है। महान देखभाल डेटा गोपनीयता को सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए। स्वास्थ्य बीमा सुवाह्यता और जवाबदेही अधिनियम (HIPAA) का उपयोग या प्रतिभागियों से लिखित सहमति के बिना "संरक्षित स्वास्थ्य सूचना" (पीएचआई) का खुलासा रोकता है कि एक संघीय कानून है। पीएचआई शामिल है, लेकिन स्वास्थ्य की जानकारी प्रेषित या बनाए रखा किसी भी रूप में या मध्यम और एक व्यक्ति के 9 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि खेतों में शामिल करने के लिए सीमित नहीं है।
इस काम के माध्यम से, हम tissu दौरान पालन किया जाना चाहिए कि प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करने का लक्ष्यई - प्रोसेसिंग खरीद सहित, और भंडारण और एक ऊतक निकासी पर के अधीन है तनाव के कारण हो सकता है कि पूर्वाग्रहों को कम करने के रूप में तो इन सख्त दिशा निर्देशों का पालन करने के महत्व पर जोर। पाठकों क्या परख (एस) के लिए सबसे अच्छा सूट अपने की जरूरत पर एक योग्य निर्णय कर सकता है, ताकि हम भी बहाव assays या ऐसे नमूनों पर किया जा सकता है कि विश्लेषण (चित्रा 1) की एक संक्षिप्त सिंहावलोकन प्रदान करने का प्रयास।
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Protocol
आचार बयान: इस प्रोटोकॉल टेक्सास एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर के विश्वविद्यालय द्वारा मंजूरी दे दी है।
1. नमूना अधिप्राप्ति
- अधिशेष ट्यूमर और संबंधित सामान्य ऊतक 10-12 से अनुसंधान के ऊतकों के नमूनों को ले लीजिए। गीला बर्फ पर स्टोर नमूनों autolysis से बचने के लिए।
- एक वैकृत निदान की सुविधा के लिए सभी ऊतकों, चिकित्सा उपकरणों और आवश्यक परीक्षा के लिए पैथोलॉजी विभाग के एक शल्य प्रक्रिया के दौरान हटा विदेशी निकायों भेजें।
- लागू अनुसंधान और ऊतक बैंकिंग नीतियों और प्रक्रियाओं के अनुसार अनुसंधान के लिए आवंटित ऊतक संभाल लेना।
नोट: biospecimen संग्रह पैथोलॉजिस्ट की समन्वय शामिल है, पैथोलॉजिस्ट 'सहायकों, histotechnologists और ऊतक खरीद के विशेषज्ञों।
2. पैथोलॉजी क्वालिटी एश्योरेंस (क्यूए)
- पूरा करें और एक प्रारंभिक क्यूए उपाय के रूप में रोगी रिकॉर्ड की पुष्टि करने और नैदानिक देहात की समीक्षा के लिए एक रोगविज्ञानी परामर्शtient रिकॉर्ड (पैथोलॉजी रिपोर्ट, ऊतक स्लाइड, आदि) और ऊतकों के नमूनों। इस तरह इस biorepository सर्वोत्तम प्रथाओं 10-12 के अनुसार है आदि ट्यूमर का प्रतिशत, गल जाना, ऊतक ट्यूमर इंटरफेस है, के रूप में ब्याज के लक्षण पर न्यायाधीश के ऊतकों के नमूनों।
- प्रारंभिक समीक्षा के बाद, biospecimen के ठहरने की पूरी लंबाई के दौरान biorepository डेटा और अनुसंधान के नमूनों की आवधिक समीक्षा आचरण।
- नमूने के histopathological और अन्य जांच से लिंक परिणाम और एनोटेशन और एक मालिकाना biorepository सॉफ्टवेयर प्रणाली के माध्यम से शोधकर्ताओं को यह डेटा प्रदान करते हैं।
नोट: क्यूए प्रक्रियाओं biorepository संचालन के नैदानिक और तकनीकी पहलुओं दोनों की अखंडता को सुनिश्चित करते हैं। - सत्यापित करने और नैदानिक इस्तेमाल के लिए नमूनों को चिह्नित करने के लिए आनुवंशिक और आणविक परीक्षण प्रदर्शन करते हैं।
- लीजिए और प्रयोगशाला प्रयोगों के लिए नमूने का उपयोग किया गया है जो शोधकर्ताओं से प्रतिक्रिया के आधार पर डेटा का विश्लेषण। ट्रैकबारकोड तकनीक का उपयोग कर नमूने हैं। इस इलेक्ट्रॉनिक ट्रैकिंग सिस्टम भी biorespository सर्वोत्तम प्रथाओं 10-12 में वकालत की है।
3. नमूना / ऊतक प्रसंस्करण
- हमेशा अपने प्राकृतिक वातावरण से ऊतक के नमूने की निकासी से प्रेरित परिवर्तन सीमित करने के लिए, के रूप में जल्दी संभव के रूप में ताजा ऊतक गीला बर्फ पर नमूनों, और इस प्रक्रिया की दुकान। प्रक्रिया सामान्य ट्यूमर से मिलान और ट्यूमर के ऊतक के नमूने अलग से पार संक्रमण से बचने के लिए।
नोट: अनुसंधान प्रोटोकॉल पर आधारित, biospecimen प्रसंस्करण मीडिया में से एक या एक से अधिक प्रकार के नमूनों का संग्रह शामिल कर सकते हैं। - प्रक्रिया शुरू करने से पहले, एक बाँझ पेट्री संस्कृति डिश, एक छुरी, साथ ही ऊतक प्रसंस्करण के लिए एक सुई या संदंश तैयार करते हैं। ट्यूब, तैयार लेबल, और नमूना प्रसंस्करण (चित्रा 2) के समय सीमित करने के लिए बाहर रखा गया है कि सुनिश्चित करें।
- ऐसे रोगी का नाम, नंबर, उपचार, की तारीख के रूप में सभी प्रासंगिक ऊतक जानकारी,सर्जरी, और अध्ययन के लिए उपयुक्त हो सकता है के रूप में अन्य प्रासंगिक जानकारी, एक संस्थागत ऊतक डेटाबेस में आसानी से सुलभ बना दिया जाना चाहिए। लिमिटेड रोगी जानकारी कागज या स्प्रेडशीट के रूप में प्रयोगशाला में आयोजित किया जाना चाहिए।
नोट:। केवल अनुसंधान अर्थात प्रकृति के लिए प्रासंगिक biospecimen जानकारी एकत्र, रोग विशिष्ट जानकारी के लिए आदि बुनियादी जैव चिकित्सा अनुसंधान, नैदानिक अनुसंधान, शोध, biorepository कर्मचारियों को वर्तमान साहित्य द्वारा आवश्यक समझा डेटा और शासी संगठनों एकत्र करना चाहिए उचित निदान और सार्थक अनुसंधान किया जाता है। यह भी शामिल है, लेकिन ट्यूमर ग्रेड और कैंसर के मंचन जानकारी तक सीमित नहीं है। - विश्लेषण के प्रत्येक प्रकार, साथ ही excisions के स्थान के लिए आवश्यक ऊतक वर्गों के आकार के बारे में फैसला करने के लिए अग्रिम में सभी वांछित बाद के प्रयोगों की योजना है। असंभव हालांकि आदर्श रूप में, सभी विश्लेषण ऊतक heterogenei के लिए खाते के क्रम में पूरे ऊतक खंड के प्रतिनिधि होना चाहिएTy और नीचे की ओर विश्लेषण की सीमा पूर्वाग्रह। चित्रा 2 में दिखाया गया के रूप में अग्रिम में सभी आवश्यक वस्तुओं को बाहर करना।
- सतह के खिलाफ फ्लैट खुला पेट्री संस्कृति डिश में ऊतक नमूना रखें।
नोट: केवल पहचान के नमूने को संभालने के लिए और पहचान स्वास्थ्य डेटा की समीक्षा करने के biorepository कर्मचारियों अधिकृत अनुमति दें। जांचकर्ता आईआरबी द्वारा विनियमित के रूप में हस्ताक्षर किए सूचित सहमति से अनुमति दी है और केवल उन रोगी पहचानकर्ता का उपयोग करना चाहिए। सभी नमूनों को पर्याप्त रूप से लेबल किया जाना चाहिए और कम से कम एक अद्वितीय ऊतक पहचान संख्या और ऊतक प्रकार में शामिल होना चाहिए। HIPAA के नियमों के अनुसार, लेबल में किसी भी पीएचआई शामिल न करें। - इसकी संरचना और आयाम का एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए, सभी कोणों से नमूना निरीक्षण किया। सुई के साथ पकवान की तह तक नमूना पिन, और इसकी सबसे बड़ी और सबसे अच्छा प्रतिनिधि अक्ष के साथ ऊतक दोटूक लिए आगे बढ़ें।
- ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा काट और एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर माइकर में जगहशाही सेना को स्थिर समाधान के 1ml युक्त ocentrifuge ट्यूब। यह नमूना प्रक्रिया के शेष के लिए बर्फ पर रखा गया है और जब तक जरूरत 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
नोट: शाही सेना के साथ काम कर रहे हैं, दस्ताने हमेशा पहना जाना चाहिए, और RNase मुक्त फिल्टर सुझावों गिरावट और आरएनए संदूषण की संभावना को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। - पेट्री संस्कृति डिश के ढक्कन में एक खुली और पूर्व लेबल बायोप्सी कैसेट बाहर करना। 5 मिमी करने के लिए 3 से अधिक गहरा नहीं ऊतक का एक टुकड़ा बाहर कट और कैसेट को हस्तांतरण। 72 घंटे की एक न्यूनतम के लिए 10% में कैसेट तटस्थ बफर formalin (NBF) रखें। आयल एम्बेडिंग से पहले लंबी अवधि के भंडारण के लिए 70% इथेनॉल में कैसेट स्थानांतरण।
नोट: कैसेट की लेबलिंग पेंसिल में या अन्यथा लेबलों मिटा देगा प्रसंस्करण के दौरान xylene के उपयोग के रूप में सिफारिश मार्कर के साथ बाहर किया जाना चाहिए। - ऊतक का एक टुकड़ा काट और एक ऊतक मोल्ड में जगह है। इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) परिसर में ऊतक अनुभाग को कवर, और इसे तुरंत फ्रीजcryosectioning के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर। इस ऊतक अनुभाग cryosectioning के लिए तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
- एक बाहर कट या ऊतक के कई टुकड़े और एमएसीएस बफर युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब (1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), 0.5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA)) cytometry विश्लेषण बाद में प्रवाह के लिए के लिए उन्हें स्थानांतरित । प्रवाह cytometry के लिए आवश्यक है जब कोशिकाओं ट्यूमर विसंघटन, सेल निर्धारण और permeabilization के दौरान खो दिया जा सकता है, के रूप में बड़े नमूनों बेहतर हो सकता है। आम तौर पर, इस धारा के अंत में लिया जा सकता है, एक बार सभी अन्य टुकड़े संसाधित किया गया है। बचे हुए प्रतिनिधि ट्यूमर नमूना फ्लो के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इस ट्यूब 4 डिग्री सीओ पर संग्रहीत / एन या एक सेल निलंबन (चरण 4 देखें - प्रवाह cytometric धुंधला) में प्रवाह cytometric धुंधला तुरंत बाद पाचन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- 0.5 मिमी x 0.5 मिमी की अधिकतम आकार से टुकड़े कोई बड़ा में ऊतक के शेष कट और क्रायोजेनिक के लिए उन्हें स्थानांतरिततरल नाइट्रोजन में तत्काल ठंड के लिए शीशियों। भविष्य का विश्लेषण करती है और सहयोगी प्रयोजनों के लिए इन तस्वीर जमी नमूनों का इस्तेमाल किया जा सकता है।
नोट: सीधे संपर्क गंभीर चोट पैदा कर सकता है के रूप में तरल नाइट्रोजन के साथ कार्य करते समय अतिरिक्त ध्यान रखा जाना चाहिए। आंखें पक्ष ढाल के साथ या एक चेहरा ढाल के साथ सुरक्षा चश्मे के साथ रक्षा की जानी चाहिए। क्रायोजेनिक दस्ताने भी splashing और सीधे संपर्क की वजह से तरल नाइट्रोजन जलने से रक्षा करने के लिए पहना जाना चाहिए। दस्ताने ठीक से फिट हैं, लेकिन उन में जल्दी करना चाहिए तरल नाइट्रोजन छप हटाया जा करने के लिए पर्याप्त ढीला होना चाहिए।
4. प्रवाह cytometric धुंधला
- ऊतक homogenization
- DMEM (40 एमएल), DNase मैं (50 यू / एमएल) और कोलेजिनेस मैं (2 मिलीग्राम / एमएल) के साथ पाचन मध्यम तैयार। एक पेट्री डिश के ढक्कन में एमएसीएस बफर में ताजा या हे / एन संग्रहीत ट्यूमर प्लेस, और पाचन माध्यम के साथ डूब।
नोट:। विभिन्न पाचन तरीकों मौजूद हैं, लाभ के साथ प्रत्येक (यानी, कोशिका की सतह प्रोटीन पूर्वअभिव्यक्ति, व्यवहार्यता)। आप अपने वांछित बहाव के आवेदन के लिए उचित विधि है सुनिश्चित करें। - ट्यूमर एक पेस्ट की तरह बनावट है जब तक बाहर से एक सुई के साथ डिश के नीचे, और कटौती करने के लिए पिन ट्यूमर, एक छुरी के साथ केंद्र के लिए। लीक से बचने के लिए एक प्लास्टिक की थैली में एक 50 मिलीलीटर ट्यूब, सील और जगह पर ट्यूमर मिश्रण स्थानांतरण। एक मशीन के लिए ट्यूब स्थानांतरण, और 225 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटा पर बारी बारी से।
- एक 70μm सेल झरनी के माध्यम से ट्यूमर सेल निलंबन फ़िल्टर। 250 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। 1 मिलीलीटर FACS बफर (500 मिलीलीटर पीबीएस, 1 मिलीलीटर 0.5 एम शेयर EDTA, 10 मिलीलीटर एफसीएस या एफबीएस) में Resuspend सेल गोली।
- एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और 1x10 7 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में फिर से निलंबित। स्थानांतरण धुंधला के लिए एक साथ 96 दौर नीचे की थाली में अच्छी तरह से प्रति 100 μl (10 6 कोशिकाओं)।
- DMEM (40 एमएल), DNase मैं (50 यू / एमएल) और कोलेजिनेस मैं (2 मिलीग्राम / एमएल) के साथ पाचन मध्यम तैयार। एक पेट्री डिश के ढक्कन में एमएसीएस बफर में ताजा या हे / एन संग्रहीत ट्यूमर प्लेस, और पाचन माध्यम के साथ डूब।
- व्यवहार्यता और एंटीबॉडी धुंधला
- प्रत्येक के लिए व्यवहार्यता दाग समाधान के 200 μl अच्छी तरह से और मिश्रण जोड़ें। Incuअंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए, पीटा। 250 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट, और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला पर कोशिकाओं स्पिन।
- FACS बफर के 200 μl में सतह एंटीजन के लिए (निर्माता के अनुसार) की सिफारिश / titrated एकाग्रता में एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें। अंधेरे में, 4 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट में कोशिकाओं को सेते हैं। 250 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट, और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला पर कोशिकाओं स्पिन।
- , FACS बफर के 200 μl के साथ धो 250 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट, और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला पर कोशिकाओं नीचे स्पिन। FACS बफर के 200 μl में कोशिकाओं Resuspend और अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए कोशिकामापी प्रवाह करने के लिए आगे बढ़ें।
नोट: इंट्रासेल्युलर फ्लो धुंधला प्रदर्शन कर, तो चरण 4.2.2 और 4.2.3 के बीच निर्धारण और permeabilization कदम और intracellular धुंधला प्रदर्शन करते हैं। साइटोकाइन धुंधला प्रदर्शन कर करते हैं, कोशिकाओं की सिफारिश के रूप में पूर्व सक्रिय पूर्ववर्ती धुंधला होना चाहिए, और इस तरह के monensin रूप इंट्रासेल्युलर प्रोटीन परिवहन और स्राव के एक अवरोध करने के सक्रियण के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिएघुलनशील कारकों की अवधारण किया जाता है। फिक्स्ड कोशिकाओं एक प्रवाह cytometer पर अंधेरे से पहले अधिग्रहण में 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्पकालिक (एक सप्ताह) संग्रहित किया जा सकता है।
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Representative Results
नीचे प्रदर्शित परिणाम एक संसाधित मेलेनोमा ट्यूमर पर व्यापक प्रतिरक्षा phenotyping के लिए फ्लो gating रणनीति को दर्शाती है। धुंधला के दिन, ऊतक के नमूने 225 आरपीएम रोटेशन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर, पच जाता है और कोलैजिनेज़ मैं और 60 मिनट के लिए DNase मैं ऊष्मायन के साथ homogenized गया था। पाचन के बाद, सेल निलंबन मलबे को खत्म करने के लिए एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था और कोशिकाओं प्रतिरक्षा सेल phenotyping के लिए एंटीबॉडी cytometry प्रतिदीप्ति लेबल प्रवाह के साथ दाग रहे थे। एमएसीएस बफर में 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक संग्रहीत हे / एन पर कई मार्करों के लिए gating रणनीति और धुंधला (चित्रा 3) के नीचे दिखाया गया है। दिखाया गया है, 4 डिग्री सेल्सियस पर एमएसीएस बफर में वर्णित है और संग्रहीत हे / एन के रूप में संसाधित नमूनों अत्यंत सीमित मृत्यु दर दिखा। इसके अलावा, यह आंकड़ा रूप में ऊपर वर्णित है कि प्रसंस्करण ऊतक मेलेनोमा ट्यूमर में प्रतिरक्षा सेल सबसेट की बहु रंग व्यापक phenotyping की अनुमति देता है दर्शाता है।
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चित्रा मानव रक्त और ऊतकों के नमूनों से बाहर किया जा सकता है जो 1. विश्लेषण। निम्नलिखित प्रसंस्करण प्रदर्शन किया जा सकता है जो assays के अवलोकन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
उचित ऊतक प्रसंस्करण और भंडारण। ऊतक प्रसंस्करण के लिए सेटअप के उदाहरण के लिए आवश्यक 2. आइटम चित्रा। ऊतक सुई और छुरी के साथ पेट्री संस्कृति डिश (ए) में विच्छेदित किया जा सकता है। ऊतक के प्रतिनिधि टुकड़े तो तब आरटी पर तीन दिन के निर्धारण के लिए एक NBF कंटेनर (सी) के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए जो बायोप्सी कैसेट (बी) के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए। ऊतक का एक टुकड़ा ख से पहले अक्टूबर समाधान में एक cryomold (डी) में रखा गया है और कवर किया जाना चाहिए-20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए eing। ऊतक का एक बड़ा टुकड़ा धुंधला प्रवाह cytometry के लिए एक 50 मिलीलीटर ट्यूब (ई) को हस्तांतरित किया जाना चाहिए और एमएसीएस बफर हे / एन में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा शाही सेना को स्थिर समाधान (एफ) के साथ एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को सौंप दिया और आरएनए निष्कर्षण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए। अंत में, बचे हुए ऊतक टुकड़ों में काट और तरल नाइट्रोजन और लंबी अवधि के भंडारण में स्नैप-ठंड के लिए cryotubes (जी) के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
व्यापक प्रतिरक्षा phenotyping के लिए चित्रा 3. प्रवाह cytometric gating रणनीति। 4 डिग्री पर cytometry मेलेनोमा ट्यूमर संग्रहीत हे पर प्रवाह / एन द्वारा व्यापक प्रतिरक्षा phenotyping gating रणनीति का उदाहरण;। सी एमएसीएस बफर 13 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
अंत में, प्रसंस्करण के तरीकों वांछित परिकल्पना तय करती है और (चित्रा 1) का प्रदर्शन किया जा करने के लिए तकनीकी assays के प्रत्याशित किया जाना चाहिए। निम्न अनुभाग ऐसे ऊतक वर्गों पर प्रदर्शन किया जा सकता है कि संभावित assays का वर्णन करने के लिए एक सिंहावलोकन के रूप में कार्य करता है। यह कोई एक संपूर्ण अवलोकन मतलब है, लेकिन तकनीक का वर्णन है और अपनी शक्तियों और कमजोरियों लिस्टिंग द्वारा गाइड नमूना प्रसंस्करण विधियों और नीचे की ओर assays के चुनाव में मदद करने का इरादा है के द्वारा होता है।
धुंधला प्रवाह cytometry हौसले से विच्छेदित ऊतक वर्गों पर प्रदर्शन किया जा सकता है, या टुकड़े 4 डिग्री सेल्सियस पर एमएसीएस बफर में हे / एन संग्रहीत। Cytometry के अति विशिष्ट phenotyping और ऊतकों के नमूनों से निकाली सेल आबादी के विश्लेषण की सुविधा, और एक ही सेल में अप करने के लिए 17 कोशिका की सतह मार्करों और intracellular प्रोटीन, साइटोकिन्स और प्रोटिएजों का धुंधला अनुमति देता प्रवाह। इसके अलावा, कुछ cytometers localizat निर्धारित करने के लिए, एकल कोशिका बढ़ाई अनुमति देते हैंकोशिका के भीतर प्रोटीन के आयन के बजाय केवल सकारात्मकता और संकेतों की तीव्रता। अंत में, बड़े पैमाने पर cytometry के नकारात्मक पक्ष कोशिकाओं lysed और इसलिए आगे सुसंस्कृत नहीं हो सकता है, हल, या एक पूरे के रूप में 14 विश्लेषण किया जाना चाहिए कि होने के साथ ही नमूने में 35 से अधिक प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। इस तकनीक में एक एकल कोशिका के स्तर पर कई मार्करों और प्रोटीन के विश्लेषण के साथ ही विस्तृत लक्षण वर्णन अनुमति देता है। हालांकि, फ्लो ऊतक homogenization और ऊतक वास्तुकला के नुकसान की आवश्यकता है और सेल phenotype में परिवर्तन को कम करने के लिए नए सिरे से ऊतक पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए। कुछ सेल सबसेट ischemia के लिए और अधिक असुरक्षित हो सकता है के रूप में महत्वपूर्ण, सेल सामग्री को प्रभावित कर सकता फ्लो के लिए इरादा ऊतक के भंडारण में देरी की। Phosphoproteins भी खराब प्रसंस्करण कैनेटीक्स 15 उपअनुकूलित हैं cytometry यदि प्रवाह से पता लगाया जा सकता है।
Formalin-निर्धारण और ऊतक वर्गों के आयल एम्बेडिंग (FFPE) के मामले में सबसे अच्छा विकल्प हो सकता हैयह प्रदर्शन किया जा सकता है जो assays के प्रकार में उच्च लचीलापन देता है क्योंकि भविष्य के बारे में अनिश्चितता का विश्लेषण करती है। परंपरागत रूप से, FFPE वर्गों इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री (आईएचसी) या इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) धुंधला के लिए 5 माइक्रोन वर्गों में एक microtome पर sectioned हैं। हालांकि, FFPE ऊतकों अच्छी तरह से संरक्षित कर रहे हैं, और इसलिए कई उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वास्तव में, FFPE ब्लॉक से मोटा वर्गों को काटने के डीएनए और आरएनए निष्कर्षण वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध किट के साथ, साथ ही रिवर्स चरण प्रोटीन सरणी (RPPA) विश्लेषण 16-18 दोनों की अनुमति देता है। तदनुसार, FFPE में प्रसंस्करण के ऊतकों के नमूनों जोड़ा लचीलेपन का लाभ, साथ ही immunostaining के लिए ऊतक संरचना को बनाए रखने और इसलिए ऊतक संरचनाओं और सेल आबादी के चित्रण की तरह विवो में एक और अधिक सटीक प्रदान करने का लाभ प्रदान कर सकता है। ऊतक वर्गों समय की लंबी अवधि के लिए संरक्षित करने के लिए FFPE अनुमति देता है। इस तकनीक, हालांकि, कुछ नुकसान है। FFPE के लिए इस्तेमाल किया पतली वर्गों करनाअनुक्रमिक कटौती और ऊतक वर्गों से ऊतक विविधता के लिए खाते में नहीं है, जिससे आरएनए और डीएनए गुणवत्ता आई एक बार परिवेशी वायु के संपर्क में oxidize करने लगते हैं। अंत में, कारण तिर्यक करने के लिए, FFPE वर्गों पर आईएचसी द्वारा कई प्रोटीन के सह-धुंधला अनुकूलन की आवश्यकता है।
आईएचसी या माध्यम से अगर माइक्रोस्कोपी वांछित है, जब एक अक्टूबर यौगिक के उपयोग के लिए बेहतर है। अक्टूबर-संग्रहीत वर्गों आईएचसी और के लिए अगर स्लाइड पर रखा गया है और इस्तेमाल किया जा रहा से पहले एक cryotome साथ कटौती की जानी चाहिए। अक्टूबर प्रतिजनकता को बरकरार रखता है और यह माइक्रोस्कोपी के लिए इष्टतम तकनीक बनाने पृष्ठभूमि को कम करता है। अक्तूबर भी NBF में कई दिनों की आवश्यकता है जो FFPE की तुलना में तत्काल ठंड और काटने की अनुमति देता है। इन लाभों के बावजूद अक्टूबर आम तौर पर कम स्थिर और केवल आईएचसी और यदि अक्तूबर-एम्बेडेड ऊतक वर्गों से प्रदर्शन किया जा सकता है, क्योंकि FFPE से कम लचीला है।
शाही सेना के विश्लेषण के साथ संबंध है, नमूने बेहतर आरएनए ई अनुमति देता है, समय के साथ कड़ा शाही सेना को स्थिर समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीतदूसरों के बीच में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध निकासी किट और TRIzol, के माध्यम से xtraction। आरएनए निष्कर्षण परमिट बहाव के लिखित जीन, आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण की अभिव्यक्ति यों की रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी पीसीआर), और माइक्रोएरे द्वारा संग्राहक जीन की व्यापक स्पेक्ट्रम विश्लेषण, या nanoString विश्लेषण के रूप में इस तरह के विश्लेषण करती है। तदनुसार, ऊतकों से शाही सेना अलगाव जीन अभिव्यक्ति और चिकित्सा और रोगों से प्रभावित रास्ते पर विस्तृत जानकारी प्रदान करके अत्यंत उच्च उपज, हो सकता है। महत्वपूर्ण बात है, हालांकि, आरएनए अभिव्यक्ति काफी ऊतक संरचना और नमूना आकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, इसलिए अतिरिक्त देखभाल biasing से बचने के लिए नमूना स्थान के कारण विश्लेषण किया जाना चाहिए। इसके अलावा, शाही सेना की प्रकृति अभिव्यक्ति के स्तर में गतिशील परिवर्तन, इसलिए अतिरिक्त देखभाल भी जीन और ब्याज 19,20 के रास्ते का अध्ययन करने के बाद कर रहे हैं उचित कैनेटीक्स सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए कि हो सकता है पता चलता है; प्रसंस्करण शाही सेना को स्थिर s से निकासी के बाद ही सीमित होना चाहिएस्थिरता सुनिश्चित करने के लिए olution। तदनुसार, पूरक डीएनए के भंडारण वृद्धि की स्थिरता की (सीडीएनए) शाही सेना को पसंद किया जाता है (यदि बहाव के विश्लेषण के साथ लाइन में) 21। आरएनए अक्सर बहाव के विश्लेषण में परिलक्षित किया जा सकता है, क्योंकि अंत में, दूषित कोशिकाओं के मिनट अंशों प्राप्त परिणामों में बड़े पूर्वाग्रहों में हो सकता है।
डीएनए विश्लेषण में पहले स्नैप-जमे हुए ऊतकों के नमूनों पर किए गए, या FFPE ऊतक वर्गों पर हो सकता है। इन विधियों बाद में पूरे exome या पूरे जीनोम अनुक्रमण, कई रोग संदर्भों में रोगी की प्रतिक्रिया और रोग का निदान करने के लिए जोड़ा म्यूटेशन और बहुरूपता की पहचान के माध्यम से विशाल वादा दिखाया है, जो दो तकनीकों अनुमति देते हैं। डीएनए निष्कर्षण आगे एंटीजन और चिकित्सा और रोग 20,21 में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से संबंधित ज्ञान प्राप्त करने के क्रम में, टी सेल और बी सेल रिसेप्टर (TCR और बीसीआर) नमूनों में मौजूद दृश्यों की पहचान की अनुमति हो सकती है। आरएनए की तुलना में, डीएनए हालांकि, अत्यधिक स्थिर एक बार निकाला जाता हैयह खाते ट्रांसक्रिप्शनल और जीन के translational विनियमन के साथ ही बाद translational संशोधनों और विनियमन 22 में रखना होता है।
प्रोटीन पश्चिमी धब्बा प्रदर्शन करने के क्रम में ऊतक वर्गों, या FFPE नमूनों से तस्वीर जमी से सीधे निकाला जा सकता है, प्रोटीन बातचीत और नेटवर्क की पहचान करने के लिए सह immunoprecipitation, साथ ही RPPA, सैकड़ों के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव की अनुमति के एक उच्च उपज तकनीक का विश्लेषण करती है एक भी नमूना 23 में प्रोटीन। हालांकि, इस तकनीक केवल विशिष्ट एंटीबॉडी की अपनी आवश्यकता के माध्यम से जाना जाता प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात है, आगे बाद translational संशोधन विश्लेषण, ऐसे प्रोटीन फास्फोरिलीकरण के रूप में अस्थिरता से 15 की वजह से ऊतक के तेजी से प्रसंस्करण की आवश्यकता है।
नमूनों की स्नैप ठंड सरल है और सीमित संसाधनों की आवश्यकता है। बहाव के विश्लेषण अभी तक परिभाषित नहीं किया गया है जब यह भी में छोड़कर नमूनों की लंबी अवधि के भंडारण की अनुमति देता हैताजा नमूनों पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए जो फ्लो के मामले। स्नैप जमे हुए नमूने भी आसानी से सहयोगात्मक प्रयोजनों के लिए साझा किया जा सकता है।
अंत में, ऊतक का एक टुकड़ा से निकाला जा सकता है, जो डेटा की मात्रा अंतहीन है। Assays के किसी भी अध्ययन में किया जाना चाहिए, जो करने के लिए कोई सार्वभौमिक सही जवाब है। प्रत्येक अन्वेषक इसलिए यह नाटकीय रूप से पढ़ाई की डिजाइन और प्राप्त कर रहे हैं, जो जवाब प्रभावित कर सकता है के रूप में वह / वह, मरीजों की भर्ती और ऊतक प्रक्रिया से पहले खाते में सभी परिकल्पनाओं, वांछित प्रयोगों के साथ ही उपलब्ध संसाधनों लेता है कि यह सुनिश्चित करना चाहिए।
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Acknowledgments
इस काम के जॉन जी और मैरी स्टेला Kenedy मेमोरियल फाउंडेशन (अनुदान # 0,727,033) और मेलेनोमा रिसर्च एलायंस की परोपकारी योगदान द्वारा समर्थित किया गया। लेखकों डॉ इग्नेसियो Wistuba, डॉ विक्टर Prieto के एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर विभाग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, ऊतक वितरण और संग्रह समन्वय और शोधों को सुविधाजनक बनाने के लिए टेक्सास एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर संस्थागत ऊतक बैंक (आईटीबी) विश्वविद्यालय का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं पैथोलॉजी और मेलेनोमा चाँद शॉट कार्यक्रम। अंत में, लेखकों मेलेनोमा से प्रभावित सभी रोगियों और उनके परिवारों को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
References
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