Introduction
وقد استفادت البحوث الطبية كثيرا من دراسة كل من خطوط الخلايا البشرية والنماذج الحيوانية. خطوط الخلايا تسمح لتحسين السيطرة على عناصر في النظام، وكذلك استخدام الخلايا من الكائن الحي السليم. العمل مع الخلايا البشرية، في حين أن أكثر تمثيلا، ويعرض لقطة مبسطة بشكل كبير من الآليات التي قد تكون مسؤولة عن الصحة والمرض، وذلك لأن خطوط الخلايا قد لا ألخص تأثير الخلايا الأخرى، مكونات اللحمية، والأجهزة التي قد تؤثر على ردود 1. من ناحية أخرى، النماذج الحيوانية، وإن لم يكن دقيقا تماما في استنساخ الأمراض التي تصيب البشر وعدم التجانس الوراثي، وتقديم مزيد من التبصر من خلال السماح لإدخال نظم الحيوانية كلها في معظم النماذج 2،3.
أوجه القصور جانبا، سواء الطرق لها فوائدها ومتكاملان. ومع ذلك، يبقى الهدف الرئيسي لدراسة الخلايا البشرية والأجهزة، في كامل الجسم، ونظام متعدد الجهاز. وفقا لذلك، والبحوث متعدية ديه تاكأون خطوات كبيرة في تسهيل دراسة بالأعضاء والأنسجة البشرية المستخرجة من المرضى، من أجل فهم أفضل للآليات المرض الأساسي. يقدم البحوث متعدية الاستفادة من دراسة نتيجة العلاجات والأمراض في الجسم بأكمله و في الخلايا المناسبة، وبالتالي توفير أفضل ما في العالمين بين الخلية والحيوان العمل 4.
الأبحاث المترجمة هو أيضا لا يخلو من العيوب. العينات المأخوذة من المرضى من البشر، على إزالة من المضيف، تخضع مباشرة لنقص التروية وغيرها من العوامل الخارجية التي من شأنها أن تكون محمية خلاف ذلك. هذا قد يؤدي إلى التغيرات الجزيئية والجينية الناجمة عن الإجهاد، ويسبب التحيز في دراسات لاحقة. ولذلك، فقد تم وضع الكثير من الجهد في استخراج ومعالجة الأنسجة من خلال وسائل صارمة للحفاظ على أفضل جهاز وسلامة الخلية للدراسات المصب 5. الأهم من ذلك، يجب أن يتم النظر في الطلبات المستقبلية بشكل وثيق عند اختيار أساليب سو تجهيز العينات البشرية، وأساليب معينة قد يكون ضارا المكونات الخلوية ومسارات إشارات في حين أن يجنب الآخرين.
لأي البحوث التي تنطوي على الأنسجة البشرية، يجب أن تعالج القضايا التنظيمية. بعد تقارير توسكيجي وبلمونت، كان هناك قبول متزايد لحقيقة أن ارتبط البحوث الطبية الحيوية مع المخاطر الكامنة يؤدي إلى المعضلات الأخلاقية التي لا مفر منها 6 في كثير من الأحيان. وقد أقر بالحاجة إلى معايير وطنية وإنشاء الحكومة الاتحادية مجالس المراجعة المؤسسية (IRBs) كوسيلة لدعم مبادئ تقرير بلمونت (احترام الأشخاص والاحسان والعدل).
IRB أي مؤسسة هو لجنة من الأطباء والباحثين وأعضاء المجتمع الذين يتحملون المسؤولية عن حماية المشاركين البحوث. ويتطلب ذلك أن الموافقة الطوعية الحصول عليها من جميع المشاركين في الدراسات والأبحاث الطبية، وأن يتم توثيق هذه الموافقة في الموافقة المسبقة FO جمهورية مقدونيا. وتهدف عملية الموافقة عن علم على توفير المعلومات الكافية لأحد المشاركين، بحيث يجوز قرار مستنير بشأن ما إذا كان أو لم يكن على الانخراط في دراسة، أو لمواصلة المشاركة. وفي هذا الصدد، يجب أن يكون وثيقة الموافقة المسبقة عن قراءة جيدة ويجب أن تكون مكتوبة في اللغة التي يمكن فهمها بسهولة (6 عشر إلى 8 مستوى القراءة الصف) على عدد السكان المستهدفين. يجب التقليل من احتمال الإكراه أو نفوذ لا مبرر له، ويجب أن يعطى موضوع متسع من الوقت للنظر في المشاركة. يجب أيضا أن يسمح للمشارك أن ممارسة حقهم في سحب الموافقة في أي مرحلة أثناء الدراسة دون عقوبة. الموافقة المستنيرة الطوعية هي شرط مسبق إلزامي للمشاركة موضوعا في مجال البحوث وكما أنها فعالة من الناحية القانونية 7.
وفقا للوائح لحماية حقوق الإنسان يخضع 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8)، ويجب إبلاغ المشاركين في الدراسة من غرض البحث والإجراءات يشارك في البحث، والبدائل في المشاركة، جميع المخاطر المتوقعة والمضايقات (بما في ذلك الضرر ليس فقط المادية ولكن أيضا الضرر النفسي والاجتماعي، أو الاقتصادي المحتمل، وعدم الراحة، أو إزعاج)، فوائد البحوث في المجتمع وربما للفرد، وطول الوقت ومن المتوقع أن يشارك في الموضوع، شخص الاتصال للحصول على إجابات على الأسئلة أو في حال وقوع الإصابات المرتبطة البحوث أو في حالات الطوارئ، البيان مشيرا إلى أن المشاركة طوعية، وسوف أن رفضها المشاركة لم تسفر عن أي نتائج أو أي خسارة من الفوائد مثل حلا وسطا في مجال الرعاية السريرية العادية أن المشاركين يحق لهم الحصول على نتيجة له / لها التشخيص، وأخيرا بيانا بشأن حق هذا الموضوع في السرية والحق في الانسحاب منالدراسة في أي وقت دون أي عواقب. لا ينبغي أن راهن عينات الأنسجة من المشاركين الذين سحب الموافقة أثناء الدراسة وجوب استنفاد فورا. التنازل عن واحد أو أكثر من عناصر الموافقة المسبقة يمكن الحصول عليها من IRB لبعض المشاريع البحثية التي لا يمكن عمليا أن يتم دون تغيير في العناصر المطلوبة أو للدراسات حيث العناصر المطلوبة غير قابلة للتطبيق. يجب توخي الحذر الشديد لضمان سرية البيانات. نقل التأمين الصحي وقانون محاسبة (HIPAA) هو القانون الاتحادي الذي يمنع استخدام أو الكشف عن "حماية المعلومات الصحية" (PHI) بدون موافقة كتابية من المشاركين. يشمل PHI لكن لا يقتصر على المعلومات الصحية المرسلة أو الاحتفاظ بها في أي شكل أو متوسطة، وتشمل المجالات التي يمكن أن تستخدم لتحديد هوية الأفراد 9.
من خلال هذا العمل، ونحن نهدف إلى الخطوط العريضة للبروتوكول التي يجب اتباعها خلال TISSUتجهيز ه - بما في ذلك المشتريات، والتخزين، والتأكيد على أهمية اتباع هذه المبادئ التوجيهية الصارمة وذلك للحد من التحيز التي قد تنجم بسبب ضغوط تتعرض الأنسجة لبناء الاستخراج. ونحن نسعى أيضا إلى تقديم لمحة موجزة عن فحوصات أو تحاليل (الشكل 1) التي يمكن أن يؤديها على هذه العينات المصب ذلك أن القراء قد جعل الحكم المؤهلين على ما مقايسة (ق) يناسب احتياجاتهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل جامعة تكساس مركز أندرسون للسرطان.
1. عينة المشتريات
- جمع عينات الأنسجة البحوث من فائض الورم وما يتصل بها من الأنسجة الطبيعية 10-12. مخزن العينات على الجليد الرطب لتجنب انحلال ذاتي.
- إرسال جميع الأنسجة والأجهزة الطبية والهيئات الأجنبية إزالة أثناء إجراء العمليات الجراحية لقسم علم الأمراض لفحصها ضروري من أجل تسهيل تشخيص مرضي.
- التعامل مع الأنسجة المخصصة للبحوث وفقا للبحوث المعمول بها والسياسات المصرفية النسيج والإجراءات.
ملاحظة: جمع Biospecimen ينطوي على تنسيق الأطباء، الأطباء 'المساعدين، histotechnologists والمتخصصين المشتريات الأنسجة.
2. أمراض ضمان الجودة (QA)
- استكمال والتحقق من سجلات المرضى كإجراء QA المبكر واستشارة الطبيب الشرعي لمراجعة سنويا التشخيصسجلات tient (تقارير علم الأمراض، والشرائح الأنسجة، الخ) وعينات الأنسجة. الأنسجة عينات القاضي على الخصائص المورفولوجية من الاهتمام مثل نسبة الورم، نخر، واجهة الأنسجة السرطانية، وما إلى ذلك وهذا وفقا لأفضل الممارسات biorepository 10-12.
- وبعد المراجعة الأولية، وإجراء مراجعات دورية البيانات biorepository وعينات البحث خلال كامل مدة بقاء biospecimen.
- نتائج الارتباط وشروحه من التحقيقات التشريحية المرضية وغيرها من العينات وتوفر هذه البيانات للباحثين من خلال نظام البرمجيات biorepository الملكية.
ملاحظة: عمليات QA ضمان سلامة كل الجوانب السريرية والتقنية لعمليات biorepository. - أداء الاختبارات الجينية والجزيئية للتحقق من وتوصيف العينات للاستخدام السريري.
- جمع وتحليل البيانات على أساس التغذية المرتدة من الباحثين الذين تم استخدام العينات لإجراء التجارب المعملية. مسارالعينات باستخدام تكنولوجيا الباركود. ودعا هذا النظام التتبع الإلكتروني أيضا في أفضل الممارسات biorespository 10-12.
3. عينة / معالجة الأنسجة
- دائما تخزين عينات أنسجة جديدة على الجليد الرطب، والعملية في أسرع وقت ممكن، من أجل الحد من التغيرات الناجمة عن استخراج عينة من نسيج بيئتها الطبيعية. عملية الطبيعي الورم المتطابقة وعينات أنسجة الورم بشكل منفصل لتجنب التلوث المتبادل.
ملاحظة: بناء على بروتوكولات الأبحاث، ويمكن معالجة biospecimen تنطوي على جمع العينات في واحد أو أكثر من أنواع وسائل الإعلام. - قبل البدء في عملية، وإعداد طبق بتري معقمة الثقافة، مشرط، فضلا عن إبرة أو ملقط لمعالجة الأنسجة. التأكد من أن أنابيب تم إعداد، وصفت، والتي وضعت من أجل الحد من وقت تجهيز العينات (الشكل 2).
- جميع المعلومات الأنسجة ذات الصلة، مثل اسم المريض ورقم والعلاج وتاريخعملية جراحية، وغيرها من المعلومات ذات الصلة التي قد تكون ملائمة للدراسة، وينبغي بذل الوصول إليها بسهولة في قاعدة بيانات الأنسجة المؤسسية. ينبغي أن تعقد معلومات محدودة المريض في المختبر في شكل ورقي أو جدول البيانات.
ملاحظة: جمع المعلومات ذات الصلة biospecimen لطبيعة أي بحث فقط، والبحوث الطبية الحيوية الأساسية والبحوث السريرية والبحوث متعدية، وما إلى ذلك للحصول على معلومات بأمراض محددة، ينبغي للموظفين biorepository جمع البيانات تعتبر ضرورية من قبل الأدب الحالي والمنظمات التي تنظم ل ضمان التشخيص السليم والبحوث ذات مغزى. وهذا يشمل لكن لا يقتصر على الدرجات ورم وسرطان المعلومات التدريج. - تخطط كل التجارب اللاحقة المطلوبة في وقت مبكر، لاتخاذ قرار بشأن حجم أقسام الأنسجة المطلوبة لكل نوع من التحليل، فضلا عن موقع الختان. من الناحية المثالية، على الرغم من المستحيل، ينبغي أن تكون جميع التحليلات ممثل قسم الأنسجة بأكمله من أجل حساب heterogenei الأنسجةتاي والحد من التحيز التحليلات المصب. وضع جميع العناصر المطلوبة مقدما كما هو مبين في الشكل (2).
- ضع عينة الأنسجة في طبق بتري ثقافة مفتوحة، مسطحة ضد السطح.
ملاحظة: السماح يؤذن إلا الموظفين biorepository للتعامل مع العينات التي تم تحديدها واستعراض البيانات الصحية التي تم تحديدها. ينبغي للمحققين فقط الوصول إلى تلك المعرفات المريض كما هو مسموح به وافق على علم قعت وعلى النحو الذي ينظمه الاتحاد الدولي للرجبي. جميع العينات يجب أن يكون المسمى كاف وينبغي أن تشمل على الأقل، فريدة من نوعها رقم التعريف الأنسجة والأنسجة النوع. لا تشمل أي PHI في التسميات، وفقا للوائح HIPAA. - تفقد عينة من جميع الزوايا، للحصول على فهم أفضل لهيكل وأبعادها. دبوس العينة إلى أسفل الطبق مع الإبرة، والشروع في شطر الأنسجة على طول أكبر وأفضل تمثيلا محورها.
- قطع قطعة صغيرة من الأنسجة ووضعه في العقيمة 1.5 مل ميكرأنبوب ocentrifuge تحتوي على 1ml من حل استقرار RNA. يمكن وضع هذه العينة على الجليد للفترة المتبقية من عملية وتخزينها في 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها.
ملاحظة: عند العمل مع RNA، ينبغي دائما أن ترتديه والقفازات، ويجب استخدام نصائح مرشح ريبونوكلياز خالية للحد من فرص تدهور وتلوث RNA. - وضع كاسيت خزعة مفتوحة وصفت قبل في غطاء الطبق الثقافة بيتري. قطع قطعة من الأنسجة لا أكثر سمكا من 3-5 ملم وتحويلها إلى الكاسيت. وضع الكاسيت في 10٪ محايد مخزنة الفورمالين (NBF) مدة لا تقل عن 72 ساعة. نقل الكاسيت في 70٪ من الإيثانول للتخزين طويل الأجل قبل البارافين التضمين.
يجب أن يتم وصفها من أشرطة في قلم رصاص أو مع علامات على النحو الموصى به استخدام زيلين أثناء المعالجة سوف يمحو إلا التسميات: ملاحظة. - قطع قطعة من النسيج ووضعه في قالب الأنسجة. تغطية قسم الأنسجة في درجة الحرارة المثلى القطع (أكتوبر) المركب، وتجميده مباشرةعند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة cryosectioning. يمكن تخزين هذا القسم الأنسجة في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للcryosectioning.
- قطع واحد أو العديد من القطع من الأنسجة ونقلها إلى أنبوب 50 مل تحتوي على MACS العازلة (1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، و 0.5٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 حامض ملي Ethylenediaminetetraacetic (EDTA)) للتدفق لاحقة تحليل الخلوي . لالتدفق الخلوي، قد تكون عينات أكبر من الأفضل كما قد تفقد الخلايا خلال تبرؤ الورم، وتثبيت الخلية وpermeabilization عند الاقتضاء. عموما، يمكن أن تؤخذ هذه المادة في النهاية، وقد تم تجهيزها مرة واحدة كل قطعة أخرى. بقايا يمكن استخدام عينة الورم تمثيلية للالتدفق الخلوي. اختياريا، يمكن تخزين هذا الأنبوب في 4 درجات CO / N أو استخدامها لتدفق cytometric تلطيخ الهضم التالية فورا الى تعليق خلية (راجع الخطوة 4 - تدفق Cytometric تلطيخ).
- قطع ما تبقى من النسيج الى قطع لا يزيد حجمها على حجم الحد الأقصى 0.5 مم × 0.5 مم ونقلها إلى التجميدقارورة لتجميد فوري في النيتروجين السائل. ويمكن استخدام هذه العينات المفاجئة المجمدة ليحلل وأغراض تعاونية المستقبل.
ملاحظة: عناية إضافية ينبغي أن تؤخذ عند العمل مع النيتروجين السائل عن الاتصال المباشر يمكن أن يسبب إصابة شديدة. ينبغي حماية العينين مع نظارات السلامة مع الجانب الدروع أو مع درع الوجه. كما ينبغي ارتداء القفازات المبردة للحماية من حروق النيتروجين السائل الناجم عن الرش والاتصال المباشر. يجب قفازات تناسب بشكل صحيح ولكن تكون فضفاضة بما يكفي لإزالتها بسرعة يجب أن ينفق النيتروجين السائل فيها.
4. تدفق Cytometric تلطيخ
- الأنسجة التجانس
- إعداد الهضم المتوسطة مع DMEM (40 مل)، الدناز I (50 U / مل)، وكولاجيناز I (2 ملغ / مل). مكان الورم الطازجة أو O / N المخزنة في المخزن MACS في غطاء طبق بتري، ويغرق في الهضم المتوسطة.
ملاحظة: أساليب الهضم مختلفة موجودة، ولكل منها مزايا (أي سطح الخلية البروتين السابقالضغط و، والسلامة). ضمان لديك الطريقة الصحيحة لتطبيق المصب المطلوب. - دبوس الورم إلى أسفل الطبق مع إبرة، وقطع من الخارج إلى المركز مع مشرط، حتى الورم لديه نسيج يشبه عجينة. نقل مزيج الورم إلى 50 مل أنبوب، وختم وضعها في كيس من البلاستيك لتجنب التسريبات. نقل أنبوب للحاضنة، وتناوب على 225 دورة في الدقيقة، 37 ° C، 1 ساعة.
- تصفية ورم الخلايا تعليق من خلال مصفاة الخلية 70μm. تعليق خلية الطرد المركزي في 250 x ج، 4 ° C، 5 دقائق. بيليه resuspend خلية في 1 مل FACS العازلة (500 مل PBS، 1 مل 0.5 M الأسهم EDTA، 10 مل FCS أو FBS).
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وإعادة تعليق بتركيز 1X10 7 خلية / مل. نقل 100 ميكرولتر لكل بئر (10 6 خلايا) في 96 جولة جيدا لوحة أسفل لتلطيخ.
- إعداد الهضم المتوسطة مع DMEM (40 مل)، الدناز I (50 U / مل)، وكولاجيناز I (2 ملغ / مل). مكان الورم الطازجة أو O / N المخزنة في المخزن MACS في غطاء طبق بتري، ويغرق في الهضم المتوسطة.
- الجدوى وتلوين الأجسام المضادة
- إضافة 200 ميكرولتر من محلول الجدوى وصمة عار على كل بئر وتخلط. Incuباتي لمدة 30 دقيقة، في 4 درجات مئوية، في الظلام. تدور باستمرار الخلايا في 250 x ج، 4 ° C، 5 دقائق، ونضح طاف.
- إضافة مزيج الأجسام المضادة في أوصت / تركيز معاير (حسب الشركة المصنعة) لمستضدات السطحية في 200 ميكرولتر من العازلة FACS. احتضان الخلايا عند 4 درجات مئوية، 30 دقيقة، في الظلام. تدور باستمرار الخلايا في 250 x ج، 4 ° C، 5 دقائق، ونضح طاف.
- يغسل مع 200 ميكرولتر من العازلة FACS، وتدور أسفل الخلايا في 250 x ج، 4 ° C، 5 دقائق، ونضح طاف. الخلايا resuspend في 200 ميكرولتر من العازلة FACS، والشروع في قياس التدفق الخلوي لاقتناء والتحليل.
ملاحظة: إذا كان أداء الخلايا التدفق الخلوي تلطيخ، نفذ التثبيت والخطوات permeabilization وتلطيخ الخلايا بين الخطوات 4.2.2 و4.2.3. إذا كان أداء خلوى تلطيخ، وينبغي أن تكون خلايا تلطيخ السابق تفعيلها مسبقا على النحو الموصى به، وينبغي أن تستخدم مانع من النقل البروتين داخل الخلايا وإفراز مثل مونينسين خلال تفعيل لضمان الإبقاء على العوامل القابلة للذوبان. قد يتم تخزين خلايا ثابتة على المدى القصير (أسبوع واحد) في 4 درجات مئوية في الظلام قبل الاستحواذ على تدفق عداد الكريات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النتائج المعروضة أدناه تصور تدفق استراتيجية الخلوي النابضة لphenotyping المناعة واسع على الورم القتامي معالجتها. يوم تلطيخ، وهضمها عينة الأنسجة والمتجانس مع كولاجيناز الأول والدناز I الحضانة لمدة 60 دقيقة، عند 37 درجة مئوية تحت 225 دورة في الدقيقة دوران. بعد الهضم، وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرون لإزالة الأنقاض وكانت ملطخة الخلايا مع تدفق المسمى مضان الخلوي الأجسام المضادة لphenotyping الخلايا المناعية. هو مبين أدناه (الشكل 3) هو استراتيجية النابضة وتلطيخ لعلامات متعددة على الأنسجة المخزنة O / N عند 4 درجات مئوية في المخزن MACS. كما هو مبين، الأصناف المدرجة معالجتها كما هو موضح وتخزينها O / N في المخزن MACS في 4 ° C تظهر وفيات محدودة للغاية. وعلاوة على ذلك، يوضح هذا الرقم أن الأنسجة المعالجة كما هو موضح أعلاه يسمح متعددة الألوان phenotyping واسعة من مجموعات فرعية الخلايا المناعية في أورام سرطان الجلد.
ق / ftp_upload / 53189 / 53189fig1.jpg "/>
الشكل 1. التحليلات التي يمكن القيام بها من عينات الدم والأنسجة البشرية لمحة عامة عن المقايسات التي يمكن أداؤها المعالجة التالية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. البنود المطلوبة لمعالجة الأنسجة السليم والتخزين. مثال على الإعداد لمعالجة الأنسجة. يمكن تشريح الأنسجة في طبق بتري الثقافة (A) مع الإبرة ومشرط. وينبغي بعد ذلك يتم نقل قطع تمثيلية من الأنسجة إلى الكاسيت خزعة (B) التي ينبغي بعد ذلك نقلها إلى حاوية NBF (C) لمدة ثلاث تثبيت اليوم في RT. يجب وضع قطعة أخرى من الأنسجة في cryomold (D) وغطت في حل أكتوبر قبل بeing المجمدة في -20 ° C. يجب نقل قطعة كبيرة من الأنسجة لأنبوب 50 مل (E) لتلطيخ التدفق الخلوي ويمكن تخزينها في 4 ° C في المخزن MACS O / N. يجب نقل قطعة صغيرة من الأنسجة لأنبوب 1.5 مل مع حل استقرار RNA (F) وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي. وأخيرا، يجب أن تقطع الأنسجة المتبقية إلى قطع ونقل إلى cryotubes (G) لالمفاجئة للتجمد في النيتروجين السائل وطويلة الأجل التخزين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تدفق استراتيجية النابضة cytometric لphenotyping المناعة واسع. مثال المناعة استراتيجية واسعة النطاق phenotyping النابضة التدفق الخلوي على O الورم القتامي المخزنة / N عند 4 درجات؛ C في MACS العازلة 13 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في نهاية المطاف، ويجب أن تكون طرق المعالجة من قبل فرضية المطلوب والمتوقع المقايسات الفنية التي يتعين القيام بها (الشكل 1). يقدم القسم التالي لمحة عامة لوصف المقايسات المحتملة التي يمكن القيام بها في مثل هذه المقاطع الأنسجة. فمن بأي حال من الأحوال وجهة نظر شاملة ولكن الغرض للمساعدة في توجيه طرق تجهيز العينات واختيار المقايسات المصب بوصف التقنيات وسرد نقاط القوة والضعف فيها.
التدفق الخلوي تلطيخ يمكن أداؤها على أقسام الأنسجة تشريح طازجة، أو شظايا تخزين O / N في المخزن MACS في 4 درجات مئوية. التدفق الخلوي يسهل phenotyping وتحليل للسكان الخلية المستخرج من عينات الأنسجة محددة للغاية، ويسمح تلطيخ علامات ما يصل الى 17 خلية سطح البروتينات داخل الخلايا و، السيتوكينات والبروتياز في خلية واحدة. وعلاوة على ذلك، فإن بعض cytometers تسمح التكبير خلية واحدة، من أجل تحديد localizatأيون من البروتينات داخل الخلية وليس فقط الإيجابية وكثافة الإشارات. وأخيرا، كتلة يسمح الخلوي لتقدير أكثر من 35 البروتينات في نفس العينة، مع الهبوط الراهن أن الخلايا هي lysed يجب، وبالتالي قد لا يكون كذلك المثقف وفرزها، أو تحليل ككل 14. هذا الأسلوب يسمح تحليل العديد من علامات والبروتينات وكذلك توصيف تفصيلي على مستوى خلية واحدة. ومع ذلك، تدفق يتطلب الخلوي تجانس الأنسجة وفقدان الأنسجة العمارة ويجب أن يؤديها على أنسجة جديدة للحد من التغيرات في النمط الظاهري الخلية. الأهم من ذلك، تأخر تخزين الأنسجة المعدة للالتدفق الخلوي قد تؤثر على محتوى الخلية، حيث أن بعض مجموعات فرعية الخلايا قد تكون أكثر عرضة لنقص التروية. ويمكن أيضا Phosphoproteins يتم الكشف سيئة من قبل التدفق الخلوي إذا حركية المعالجة هي دون المستوى الأمثل 15.
الفورمالين-تثبيت والبارافين التضمين (FFPE) من أقسام الأنسجة قد يكون الخيار الأفضل في حالةعدم اليقين بشأن المستقبل ويحلل، لأنه يتيح مرونة عالية في أنواع المقايسات التي يمكن القيام بها. تقليديا، يتم مقطوع أقسام FFPE على مشراح إلى 5 ميكرون أقسام لالمناعية (IHC) أو المناعي (IF) تلطيخ. ومع ذلك، الأنسجة FFPE يتم حفظها جيدا، وبالتالي يمكن أن تستخدم لأغراض متعددة. في الواقع، وقطع الأجزاء سمكا من كتل FFPE يسمح كل من الحمض النووي واستخراج الحمض النووي الريبي مع مجموعات المتاحة تجاريا، فضلا عن عكس المرحلة مجموعة البروتين (RPPA) تحليل 16-18. وفقا لذلك، وعينات الأنسجة المعالجة في FFPE قد تقدم ميزة مرونة إضافية، فضلا عن الاستفادة من الحفاظ على بنية الأنسجة لالمناعية، وبالتالي توفير أكثر دقة في الجسم الحي تشبه تصوير هياكل الأنسجة والسكان الخلية. FFPE يسمح لأقسام الأنسجة ليتم حفظها لفترات طويلة من الزمن. هذا الأسلوب لا، ومع ذلك، لديها بعض العيوب. أقسام رقيقة تستخدم لFFPE تفعللا حساب لعدم تجانس الأنسجة من تخفيضات متتابعة وأقسام الأنسجة تبدأ لأكسدة مرة واحدة تعرضها للهواء المحيط وبالتالي إضعاف الحمض النووي الريبي DNA والجودة. أخيرا، بسبب يشابك، وشارك في تلطيخ للبروتينات متعددة IHC على أقسام FFPE يتطلب التحسين.
عند الرغبة المجهر من خلال IHC أو IF، استخدام مركب أكتوبر هو الأفضل. يجب أن تقطع أقسام أكتوبر المخزنة مع مبضع بردي قبل وضعها على الشرائح وتستخدم لIHC وIF. أكتوبر يحفظ استضداد ويقلل الخلفية مما يجعلها تقنية المثلى للفحص المجهري. أكتوبر كما يسمح بتجميد فوري والقطع مقارنة مع FFPE الذي يتطلب عدة أيام في NBF. وعلى الرغم من هذه الفوائد، أكتوبر عموما أقل استقرارا وأقل مرونة من FFPE فقط لأن IHC وIF يمكن أداؤها من أقسام الأنسجة أكتوبر جزءا لا يتجزأ.
فيما يتعلق تحليل الحمض النووي الريبي، والعينات المخزنة في 4 درجات مئوية في حل استقرار RNA تتصلب مع مرور الوقت، مما يتيح أفضل RNA هxtraction من خلال مجموعات استخراج المتاحة تجاريا وTRIzol، وغيرها. تصاريح استخراج الحمض النووي الريبي يحلل المصب مثل سلسلة العكسية النسخ تفاعل البلمرة (RT-PCR) لتحديد التعبير عن الجينات كتب، تحليل RNA تسلسل، وتحليل طيف واسع من الجينات عن طريق التضمين ميكروأري، أو تحليل nanoString. وفقا لذلك، عزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة يمكن أن يكون غاية ذات العائد المرتفع، من خلال توفير معلومات وافية عن التعبير الجيني ومسارات المتضررة من العلاجات والأمراض. الأهم من ذلك، ومع ذلك، التعبير RNA قد تختلف بناء جذريا في بنية النسيج وحجم العينة، ينبغي اتخاذ المزيد من الحيطة وذلك لتجنب يتحامل تحليلات نظرا لموقعها أخذ العينات. وعلاوة على ذلك، فإن طبيعة RNA تشير إلى أن التغيرات الدينامية في مستويات التعبير قد يحدث، لذلك يجب أن يؤخذ الحذر لضمان حركية سليمة يتم اتباعها لدراسة الجينات والممرات التي تهم 19،20. تجهيز ينبغي أن يقتصر التالية استخراج من S-استقرار RNAolution لضمان الاستقرار. وفقا لذلك، ويفضل تخزين DNA التكميلي (كدنا]) زيادة الاستقرار في الحمض النووي الريبي (إذا تمشيا مع تحليل المصب) 21. وأخيرا، لأن RNA كثير من الأحيان قد يكون تضخيم في التحليلات المصب، والكسور ضئيلة من الخلايا الملوثة قد يؤدي إلى تحيزات كبيرة في النتائج المتحصل عليها.
ويمكن إجراء تحليل DNA من عينات الأنسجة في وقت سابق الإضافية المجمدة، أو على أقسام الأنسجة FFPE. هذه الأساليب تسمح exome كله لاحقة أو كله تسلسل الجينوم، واثنين من التقنيات التي أظهرت الوعد الهائل من خلال تحديد الطفرات والأشكال المرتبطة استجابة المريض والتشخيص في سياقات متعددة المرض. استخراج الحمض النووي قد يزيد تسمح بتحديد T-الخلية ومستقبلات B-الخلية (TCR وBCR) تسلسل موجودة في العينات، من أجل اكتساب المعرفة المتعلقة المستضدات والاستجابة المناعية في العلاج والمرض 20،21. مقارنة RNA، DNA غير مستقر للغاية بمجرد استخراج، ولكنأنها لا تأخذ في الاعتبار النسخي والتنظيم متعدية الجينات وكذلك التعديلات بعد متعدية وتنظيم 22.
يمكن استخراج البروتين مباشرة من الأداة الإضافية المجمدة أقسام الأنسجة، أو من عينات FFPE من أجل أداء طخة غربية تحليلات، وشارك في مناعي لتحديد تفاعلات البروتين والشبكات، وكذلك RPPA، وهي تقنية ذات العائد المرتفع مما يسمح الكمي النسبي للمئات من البروتينات في عينة واحدة 23. ومع ذلك، هذه التقنية تتيح تحديد البروتينات المعروفة إلا من خلال احتياجاتها من الاجسام المضادة المحددة. الأهم من ذلك، المزيد من التحليل تعديل آخر متعدية، مثل البروتين الفسفرة، يتطلب معالجة سريعة من الأنسجة بسبب عدم الاستقرار 15.
الأداة الإضافية تجميد عينات بسيط ويتطلب موارد محدودة. كما يسمح التخزين على المدى الطويل من عينات عندما لم يتم بعد تحديد التحليلات المصب، إلا فيحالة التدفق الخلوي والتي يجب أن يؤديها على عينات جديدة. ويمكن أيضا بسهولة أن تكون مشتركة عينات مبكرة المجمدة لأغراض التعاونية.
في نهاية المطاف، وكمية البيانات التي يمكن استخراجها من قطعة واحدة من الأنسجة لا نهاية لها. لا توجد إجابة صحيحة العالمية التي يجب أن يتم تنفيذ المقايسات في أي دراسة معينة. لذا يجب على كل محقق ضمان أنه / أنها تأخذ بعين الاعتبار كل الفرضيات والتجارب المطلوبة وكذلك الموارد المتاحة قبل تجنيد المرضى ومعالجة الأنسجة، وهذا قد يؤثر بشكل كبير على تصميم الدراسات والإجابات التي يتم الحصول عليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل التبرعات الخيرية من جون جي ومؤسسة ماري ستيلا كينيدي التذكاري (المنحة # 0727033) والتحالف أبحاث سرطان الجلد. الكتاب أود أن أشكر جامعة الأنسجة تكساس MD اندرسون مركز سرطان المؤسسي البنك (ITB) لتنسيق توزيع الأنسجة وجمع وتسهيل الأبحاث المترجمة، وكذلك الدكتور اجناسيو Wistuba، الدكتور فيكتور برييتو، وإدارة مركز إم دي أندرسون للسرطان من علم الأمراض وبرنامج أطلق عليه الرصاص الميلانوما القمر. وأخيرا، والكتاب نود أن ننوه جميع المرضى والأسر المتضررة من سرطان الجلد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).
- McCabe, P. M., et al.
- Woolf, S. H. The meaning of translational research and why it matters. JAMA. 299, 211-213 (2008).
- Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).
- Bulmer, M. The ethics of social research. Researching social life. Gilbert, N. , Sage. London. 45-57 (2001).
- Penslar, R. L. IRB guidebook. , US Government Printing Office. (1993).
- Protection of human subjects. CFR Title 21 Section 50.25. , Food and Drug Administration. Available from: http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25 (2011).
- HIPAA privacy rule and public health. Guidance from CDC and the US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention. Available from: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm (2003).
- MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, Institutional Tissue Bank. (2009).
- Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research. , 3rd ed., International Society for Biological and Environmental Repositories. Available from: http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf (2011).
- NCI Best Practices for Biospecimen Resources. , 2nd ed., Office of Biorepositories and Biospecimen Research. Available from: http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf (2011).
- Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Baker, A. F., et al. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).
- Jacobs, S. Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).
- Chung, J. -Y., et al. Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).
- Guo, H., et al. An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays. Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).
- Feldman, A. L., et al. Advantages of mRNA amplification for microarray analysis. Biotechniques. 33, 906-914 (2002).
- Francino, O., et al. Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).
- Grunberg-Manago, M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).
- Lesnik, E. A., Freier, S. M. Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure. Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).
- MacBeath, G.
