Introduction
מחקר רפואי נהנה מאוד מהמחקר של שני שורות תאים אנושיות ומודלים של בעלי חיים. שורות תאים מאפשרות שליטה טובה יותר של רכיבים במערכת, כמו גם שימוש בתאים מאורגניזם הנכון. עבודה עם תאים אנושיים, ואילו יותר נציג, מציג תמונת מצב פשוטה באופן דרסטי של מנגנונים שעשויות להיות אחראי לבריאות ומחלה, משום ששורות תאים עשויות שלא לשחזר את ההשפעה של תאים אחרים, רכיבי סטרומה, ואיברים אשר עשוי להשפיע 1 תגובות. מצד השני, מודלים של בעלי החיים, אם כי לא לגמרי מדויק בשחזור מחלה אנושית וההטרוגניות גנטית, להציע תובנה נוספת על ידי מתן אפשרות להזנה של מערכות חיות שלמות ברוב הדגמים 2,3.
חסרונות בצד, יש לי שתי השיטות היתרונות שלהם והם משלימים. עם זאת, המטרה העיקרית נשארה ללמוד בתאים אנושיים ואיברים, בגוף מלא, מערכת רב-איבר. בהתאם לכך, יש מחקר translational taken צעדים גדולים בקידום המחקר של איברים ורקמות שחולצו מחולים אנושיים, על מנת להבין טוב יותר את מנגנוני מחלה בסיסית. מחקר translational מציע את היתרון של לימוד התוצאה מטיפולים ומחלות בכל הגוף ובתאים מתאימים, ובכך לספק את המיטב משני העולמות בין תא ובעלי חי עבודה 4.
מחקר translational הוא גם לא בלי פגמים. דגימות שנקטפו מחולים אנושיים, עם ההסרה מהמארח, חשופות באופן מיידי לאיסכמיה וגורמים חיצוניים אחרים שממנו הם יהיו מוגנים אחרים. זה עלול לגרום לשינויים מולקולריים וגנטיים שנגרם עקב מתח, ולגרום להטיה במחקרים שלאחר מכן. לכן, הרבה מאמץ כבר הכניס לתוך חילוץ ועיבוד רקמות באמצעות שיטות קפדניות לשמירה הטובה ביותר איבר ושלמות תא ללימודים במורד הזרם 5. חשוב לציין, יישומים עתידיים יש לקחת בחשבון בעת בחירה מקרוב שיטות oו עיבוד דגימות אנושיות, כמו שיטות מסוימות עלולות לפגוע במרכיבים תאיים ומסלולי איתות תוך חוסך אחרים.
לכל מחקר מעורב רקמות אנושיות, נושאי רגולטורים יש לטפל. לאחר דיווחי Tuskegee ולמונט, היה הולכים וגדל בעובדה שהמחקר ביו-רפואי היה קשור בסיכונים הגלומים לעתים קרובות וכתוצאה מכך דילמות אתיות בלתי נמנעות 6. הצורך בסטנדרטים לאומיים הוכר והממשלה הפדרלית יצרה לוחות סקירה מוסדיים (IRBs) כאמצעי לשמירה על עקרונות הדו"ח בלמונט (כבוד לאנשים, חסד, המשפטים).
IRB כל מוסד הוא ועדה של רופאים, חוקרים וחברי קהילה שהם אחראים להגנת משתתפי מחקר. זה דורש כי הסכמה מרצון לקבל מכל משתתפי מחקרים ביו-רפואיים, וכי הסכמה זו תתועד בהסכמה מהדעת FO rm. תהליך ההסכמה מהדעת שמטרתו לספק מידע הולם למשתתף, כך שהחלטה מושכלת עשויה להיות על האם או לא להירשם ללימודים, או להמשיך השתתפות. בהקשר זה, מסמך ההסכמה מהדעת חייב להיות קריאה טובה וצריך להיות כתוב בשפה שיכול להיות מובנת בקלות (רמת קריאת הכיתה ה -6 עד 8 ה) על ידי אוכלוסיית היעד. האפשרות של כפייה או השפעה בלתי הוגנת חייבת להיות ממוזערת, והנושא יש לתת מספיק זמן לשקול השתתפות. המשתתף חייב להיות גם תוכל לממש את זכותם ללבטל את ההסכמה בכל שלב במהלך המחקר ללא קנס. הסכמה מדעת מרצון היא תנאי מוקדם הכרחי להשתתפותו של נושא במחקר והוא גם יעיל 7 באופן חוקי.
בהתאם לתקנות להגנה על האדם מכפיף 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), יש ליידע משתתפי מחקר של מטרת המחקר, נהלים מעורבים במחקר, חלופות להשתתפות, כל סיכונים הנראה לעין ואי נוחות (כולל פגיעה לא רק פיזית אלא גם נזק פסיכולוגי, חברתי, כלכלי או אפשרי, אי נוחות, או אי נוחות), יתרונות של המחקר לחברה ואולי לאדם, משך זמן הנושא צפוי להשתתף, האדם ליצור קשר לקבלת תשובות לשאלות או במקרה של פגיעה הקשורות למחקר או לשעת חירום, הודעה, כי ההשתתפות היא בהתנדבות והסירוב שלהשתתף לא יגרום לכל השלכות או כל אובדן של הטבות כגון פשרה בטיפול קליני רגיל כי המשתתף זכאי אחר לקבל כתוצאה מ/ אבחנותיו, ובסופו הצהרה בדבר זכותו של הכפופים לסודיות וזכות לסגת מהמחקר בכל עת ללא כל השלכות. דגימות רקמה ממשתתפים שלבטל את ההסכמה במהלך המחקר לא צריכים להיות הפקידה ויש למצות באופן מיידי. ויתור של אחד או יותר אלמנטים של הסכמה מדעת ניתן לקבל מIRB לכמה פרויקטי מחקר שלא יכל כמעט להיעשות ללא שינוי לאלמנטים הנדרשים או ללימודים שבו אלמנטים הנדרשים אינם ישימים. יש לנקוט בזהירות רבה על מנת להבטיח סודיות הנתונים. ביטוח בריאות הטלטלות הדין והחשבון Act (HIPAA) הוא חוק פדרלי שמונע את שימוש באו גילוי "מידע מוגן בריאות" (PHI) ללא הסכמה בכתב מהמשתתפים. אובדן כושר עבודה כוללת אך לא מוגבל למידע המועבר בבריאות או נשמר בכל צורה או בינוני וכולל תחומים שיכולים לשמש לזיהוי 9 בודדים.
דרך עבודה זו, אנו שואפים להתוות את הפרוטוקול שיש אחריו במהלך tissuעיבוד דואר - כוללים רכש, ואחסון ומדגישים את החשיבות של ביצוע הנחיות הקפדניות אלה כדי למזער את ההטיות שעלולות לגרום בשל לחצי רקמת נתונה על חילוץ. גם אנחנו נשתדל לספק סקירה קצרה של מבחני או ניתוחים (איור 1) שיכול להתבצע על דגימות כאלה במורד הזרם, כך שקוראים יכולים לעשות שיפוט מוסמך על מה assay (ים) המתאימים ביותר לצרכיהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: פרוטוקול זה אושר על ידי אוניברסיטת טקסס מרכז סרטן MD Anderson.
1. רכש דגימה
- לאסוף דגימות רקמה מגידול עודף מחקר ורקמות נורמליות קשורות 10-12. דגימות חנות על קרח רטוב כדי למנוע autolysis.
- שלח את כל הרקמות, מכשירים רפואיים וגופים זרים הוסרו במהלך ניתוח למחלקה לפתולוגיה לבדיקה הכרחית על מנת להקל על אבחנה פתולוגית.
- ידית רקמה שהוקצתה למחקר בהתאם למחקר רלוונטי ומדיניות בנקאות רקמות ונהלים.
הערה: אוסף Biospecimen כרוך בתיאום של הפתולוגים, 'פתולוגים עוזרים, histotechnologists ומומחי רכש רקמות.
2. פתולוגיה אבטחת איכות (QA)
- השלם ולאמת רשומות מטופל כאמצעי QA מוקדם ולהתייעץ פתולוג לסקור רשות אבחוןרשומות tient (דוחות פתולוגיה, שקופיות רקמה, וכו ') ודגימות רקמה. דגימות רקמת שופט על מאפיינים מורפולוגיים של עניין, כגון אחוז הגידול, נמק, ממשק רקמת גידול, וכו 'זה הוא בהתאם לשיטות עבודה מומלצות biorepository 10-12.
- לאחר סקירה ראשונית, לערוך בדיקות תקופתיות של נתונים biorepository ודגימות מחקר במהלך כל משך שהות של biospecimen.
- תוצאות קישור וביאורים מההיסטופתולוגיים ואחרות חקירות לדגימות ולספק את הנתונים לחוקרים באמצעות מערכת תוכנת קניינית biorepository.
הערה: תהליכי QA להבטיח את השלמות של שני היבטים הקליניים וטכניים של פעולות biorepository. - לבצע בדיקות גנטיות ומולקולריות כדי לאמת ולאפיין את הדגימות לשימוש קליני.
- לאסוף ולנתח נתונים המבוססים על משוב מחוקרים שכבר משתמשים דוגמאות לניסויי מעבדה. מַסלוּלדגימות באמצעות טכנולוגית הברקוד. מערכת מעקב אלקטרונית זה גם דגלה בשיטות עבודה המומלצות biorespository 10-12.
3. דגימה / עיבוד רקמות
- תמיד לאחסן דגימות רקמה טריות על קרח רטוב, ותהליך מהר ככל האפשר, על מנת להגביל את השינויים הנגרמים על ידי מיצוי של דגימת הרקמה מסביבתו הטבעית. נורמלי תהליך גידול בהתאמה ודגימות רקמת גידול בנפרד, כדי למנוע זיהום צולב.
הערה: מבוסס על פרוטוקולי מחקר, עיבוד biospecimen יכול לערב אוסף של הדגימות בסוג אחד או יותר של תקשורת. - לפני תחילת התהליך, להכין צלחת פטרי סטרילית תרבות, אזמל, כמו גם מחט או מלקחיים לעיבוד רקמות. ודא שצינורות ערוכים, שכותרתו, והניחו את כדי להגביל את הזמן של עיבוד מדגם (איור 2).
- כל המידע רלוונטי הרקמה, כגון שם החולה, מספר, טיפול, תאריךניתוח, ומידע רלוונטי אחר כפי שיהיה מתאים למחקר, צריך להיעשות נגישים בבסיס נתוני רקמות מוסדיים. מידע על חולה מוגבל צריך להתקיים במעבדה בנייר או בצורת גיליון אלקטרוני.
הערה:. לאסוף מידע biospecimen רלוונטי לאופי של דהינו המחקר רק, מחקר בסיסי ביו-רפואי, מחקר קליני, מחקר translational, וכו 'לקבלת מידע ספציפית למחלה, צוות biorepository צריך לאסוף נתונים ההכרחיים בספרות הנוכחית וארגונים המסדירים ל להבטיח אבחון נכון ומחקר משמעותי. זה כולל אך אינו מוגבל לציוני גידול ומידע בימוי סרטן. - לתכנן את כל הניסויים הבאים הרצויים מראש, כדי להחליט על הגודל של חלקי רקמות הנדרשים לכל סוג של ניתוח, כמו גם את המיקום של חתכים. באופן אידיאלי, אם כי בלתי אפשרי, כל הניתוחים צריכים להיות נציג של סעיף הרקמה כל כדי להסביר heterogenei הרקמהטאי והטית מגבלה של ניתוחים במורד הזרם. הנח את כל פריטים הנדרשים מראש כמתואר באיור 2.
- מניחים את דגימת הרקמה בצלחת פטרי התרבות הפתוחה, שטוחה על המשטח.
הערה: אפשר מורשה בלבד צוות biorepository לטפל דגימות מזוהות ולסקור נתונים בריאות זיהו. חוקרים צריכים לגשת רק מי מזהה מטופל כפי שמתיר נחתמו ההסכמות הודיעו וכפי שמוסדר על ידי IRB. כל הדגימות חייבת להיות מסומנות כראוי וצריכה לכלול במינימום, סוג מספר זיהוי רקמות ורקמות ייחודי. אינו כולל כל אובדן כושר עבודה בתוויות, בהתאם לתקנות HIPAA. - בדוק מדגם מכל הזוויות, כדי להשיג הבנה טובה יותר של המבנה וממדיו. הצמד את המדגם לתחתית הצלחת עם המחט, ולהמשיך לחצות את הרקמות לאורך הציר הגדול ונציג הטוב ביותר שלה.
- לגזור פיסה קטנה של רקמה ולמקם אותו בMICR 1.5 מיליליטר סטריליצינור ocentrifuge מכיל 1ml של פתרון הייצוב-רנ"א. מדגם זה יכול להיות ממוקם על קרח למשך שארית התהליך ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד צורך.
הערה: כאשר עובד עם RNA, תמיד צריכה להיות משוחק כפפות, ויש להשתמש בי טיפים מסנן RNAse ללא להגביל את הסיכויים של השפלה וזיהום RNA. - הנח את קלטת ביופסיה פתוחה ושכותרתו מראש במכסה של צלחת פטרי התרבות. לגזור פרוסה של רקמה לא עבה יותר 3 עד 5 מ"מ ולהעביר אותו לקלטת. מניחים את הקלטת ב 10% שנאגרו פורמלין ניטרלי (NBF) למינימום של 72 שעות. העבר את קלטת אתנול 70% לאחסון לטווח ארוך לפני פרפין-הטבעה.
הערה: תיוג של קלטות צריכה להתבצע בעיפרון או עם סמנים מומלצים כשימוש בקסילן במהלך העיבוד יהיה אחרת למחוק תוויות. - לגזור פיסת הרקמה ולמקם אותו בתבנית רקמה. מכסה את קטע הרקמה בטמפרטורה אופטימלית חיתוך מתחם (אוקטובר), ולהקפיא אותו באופן מיידיב -20 ° C לcryosectioning. סעיף רקמה זו עשויה להיות מאוחסן ב -20 ° C עד מוכן לcryosectioning.
- לגזור אחד או חלקים רבים של רקמות ולהעביר אותם לצינור 50 מיליליטר מכיל מאגר MACS (1x ופר פוספט (PBS), 0.5% בסרום שור עוברי (FBS), 2 מ"מ חומצת Ethylenediaminetetraacetic (EDTA)) לזרימה לאחר ניתוח cytometry . לcytometry זרימה, דגימות גדולות יותר עשויות להיות עדיפות כתאים עלולים ללכת לאיבוד בהתנערות גידול, קיבוע התא וpermeabilization בעת צורך. בדרך כלל, סעיף זה עשוי להילקח בסוף, לאחר שכל החלקים האחרים כבר מעובד. שאריות מדגם גידול נציג עשוי לשמש לcytometry זרימה. לחלופין, צינור זה ניתן לאחסן על 4 מעלות CO / N או המשמש לעיכול מייד לאחר צביעת הזרימה cytometric להשעית תא (ראה שלב 4 - זרימת Cytometric מכתים).
- חותך שארית הרקמה לחתיכות לא גדולות יותר מגודל מרבי של 0.5 מ"מ x 0.5 מ"מ ולהעביר אותם לקירורבקבוקונים להקפאה מיידית בחנקן נוזלי. דגימות Snap-קפוא אלה עשויות לשמש לעתיד ניתוחים ומטרות משותפות.
הערה: טיפול נוסף יש לנקוט בעת עבודה עם חנקן נוזלי כקשר ישיר יכול לגרום לפציעה חמורה. עיניים צריכה להיות מוגנות עם משקפיים בטיחות עם מגיני צד או עם מגן פנים. צריכים גם להיות משוחק כפפות קריוגני כדי להגן מפני כוויות חנקן נוזליים הנגרמות על ידי תזה ומגע ישיר. כפפות צריכים להתאים כראוי אבל להיות משוחרר מספיק כדי להסיר במהירות צריך להתיז חנקן הנוזלי לתוכם.
4. זרימה Cytometric מכתים
- Homogenization רקמה
- הכן בינוני עיכול עם DMEM (40 מיליליטר), DNase אני (50 U / ml) וCollagenase אני (2 מ"ג / מיליליטר). מניחים גידול טרי או O / מאוחסן-N במאגר MACS במכסה של צלחת פטרי, ולצלול עם מדיום עיכול.
הערה:. שיטות עיכול שונות קיימות, כל אחד עם יתרונות כלומר, לשעבר חלבון פני תא (pression, כדאיות). ודא שיש לך את השיטה המתאימה ליישום במורד הזרם הרצוי. - גידול צמד לתחתית הצלחת עם מחט, ולחתוך ממחוץ למרכז עם אזמל, עד הגידול בעל מרקם כמו דבק. העבר את תערובת גידול לשפופרת 50 מיליליטר, חותם ומקום בשקית פלסטיק, כדי למנוע הדלפות. העבר את הצינור לחממה, ולסובב ב 225 סל"ד, 37 ° C, 1 שעה.
- סנן השעיה תא סרטנית דרך מסננת תא 70μm. השעיה תא צנטריפוגה ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות. גלולה תא גלולה במאגר 1 מיליליטר FACS (500 מיליליטר PBS, 1 מיליליטר 0.5 M המניה EDTA, FCS 10 מיליליטר או FBS).
- ספירת תאים באמצעות hemocytometer מחדש להשעות בריכוז של 1x10 מיליליטר / 7 תאים. העברה לכל גם 100 μl (10 6 תאים) בצלחת תחתונה גם עגולה 96 לצביעה.
- הכן בינוני עיכול עם DMEM (40 מיליליטר), DNase אני (50 U / ml) וCollagenase אני (2 מ"ג / מיליליטר). מניחים גידול טרי או O / מאוחסן-N במאגר MACS במכסה של צלחת פטרי, ולצלול עם מדיום עיכול.
- כדאיות ונוגדן מכתים
- הוסף 200 μl של פתרון כתם כדאיות היטב כל אחד ולערבב. Incuבייט במשך 30 דקות, בשעת 4 מעלות צלזיוס, בחושך. ספין למטה תאים ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות, ולשאוב supernatant.
- להוסיף תערובת נוגדנים בריכוז מומלץ / טיטרציה (לפי יצרן) לאנטיגנים משטח ב200 μl של חיץ FACS. דגירה תאים ב 4 מעלות צלזיוס, 30 דקות, בחושך. ספין למטה תאים ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות, ולשאוב supernatant.
- לשטוף עם 200 μl של חיץ FACS, ספין למטה תאים ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות, ולשאוב supernatant. Resuspend תאים ב200 μl של חיץ FACS ולהמשיך לזרום cytometer לרכישה וניתוח.
הערה: אם ביצוע צביעת cytometry זרימה תאית, לבצע קיבוע וצעדי permeabilization וצביעה תאית בין צעדי 4.2.2 ו4.2.3. אם ביצוע מכתים ציטוקינים, תאים צריכים להיות הכתמה קודמת הופעל מראש מומלצים, ומעכב של תחבורה תאית חלבון והפרשה כגון monensin יש להשתמש בעת הפעלה ללהבטיח שמירה על גורמים מסיסים. תאים קבועים ניתן לאחסן לטווח קצר (שבוע) על 4 מעלות צלזיוס בלפני הרכישה הכהה על cytometer זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות מוצגות להלן מתארות אסטרטגית gating cytometry זרימה לphenotyping חיסוני רחב על גידול מלנומה מעובד. היום של צביעה, דגימת רקמה הייתה מתעכל והומוגני עם אני collagenase וDNase אני דגירה של 60 דקות, על 37 מעלות צלזיוס מתחת 225 סל"ד סיבוב. בעקבות עיכול, השעיה תא הייתה מסוננת דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לחסל פסולת ותאים היו מוכתמים זרימת כותרת הקרינה cytometry נוגדנים לphenotyping תא חיסון. מוצגים להלן (איור 3) הוא אסטרטגית gating וצביעה לסמנים מרובים על O רקמה מאוחסנת / N ב 4 ° C במאגר MACS. כפי שניתן לראות, דגימות מעובד כמתואר O ומאוחסן / N במאגר MACS על 4 מעלות צלזיוס להראות תמותה מוגבלת מאוד. יתר על כן, נתון זה מוכיח כי רקמת העיבוד כפי שתואר לעיל מאפשר phenotyping הרחב צבע רב של תת תא חיסון בגידולים מלנומה.
s / ftp_upload / 53189 / 53189fig1.jpg "/>
איור 1. ניתוח אשר עשויה להתבצע מדגימות דם ורקמה אנושיות. סקירה של מבחני שניתן לבצע העיבוד הבא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. פריטים הנדרשים לעיבוד רקמות ואחסון נכונים. דוגמא להתקנה לעיבוד רקמות. רקמה עשויה להיות גזור בצלחת פטרי התרבות () עם המחט ואזמל. חתיכות נציג של רקמה אמורות להיות מועברות לקלטת הביופסיה (ב ') אשר לאחר מכן יש להעביר למכל NBF (ג) לקיבוע יום שלושה ב RT. פיסת רקמה נוספת צריכה להיות ממוקמת בcryomold (D) ומכוסות בפתרון אוקטובר לפני בeing קפוא ב -20 ° C. פיסת הרקמה גדולה יש להעביר לצינור 50 מיליליטר (ה) לcytometry זרימה מכתים ועשויה להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בO חיץ MACS / N. פיסה קטנה של רקמה צריכה להיות מועברת לצינור 1.5 מיליליטר עם פתרון הייצוב-רנ"א (F) ומאוחסנות על 4 מעלות צלזיוס עד מיצוי RNA. לבסוף, רקמת שאריות יש לחתוך לחתיכות והועברה לcryotubes (G) לצמד-הקפאה בחנקן נוזלי ואחסון לטווח ארוך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. אסטרטגית זרימת cytometric gating לphenotyping חיסוני רחב. דוגמא לאסטרטגית gating phenotyping החיסונית רחבה על ידי cytometry זרימה על O גידול מלנומה מאוחסן / N ב 4 °;. C בMACS חיץ 13 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סופו של דבר, שיטות העיבוד חייבים להיות מוכתבות על ידי ההשערה הרצויה וצפויות מבחני טכניים שיש לבצע (איור 1). הסעיף הבא משמש כסקירה לתאר מבחני פוטנציאליים שעלולות להתבצע על סעיפי רקמות כזה. זה בשום פנים וסקירה ממצה, אבל הוא נועד לסייע לשיטות עיבוד מדגם מדריך ובחירה של מבחני במורד הזרם בתיאור טכניקות ורישום נקודות החוזק והחולשה שלהם.
Cytometry זרימה מכתים עשויה להתבצע על סעיפי רקמות טריות-גזור, או שברים מאוחסנים O / N במאגר MACS ב 4 מעלות צלזיוס. Cytometry זרימה מאפשר phenotyping וניתוח של אוכלוסיות תאים שחולצו מן דגימות רקמה ספציפיים מאוד, ומאפשר צביעה של סמנים עד 17 תאי שטח וחלבונים תאיים, ציטוקינים ופרוטאזות בתא בודד. יתר על כן, cytometers מסוים יאפשר הגדלה תא בודדת, על מנת לקבוע localizatיון של חלבונים בתוך התא ולא אך ורק חיובי ועוצמת אותות. לבסוף, מסה מאפשרת cytometry לכימות של יותר מ -35 חלבונים במדגם זהה, עם החסרון הוא שתאים חייבים להיות lysed ולכן לא יכול להיות מתורבת נוסף, מסודרים, או ניתחו בכללותו 14. טכניקה זו מאפשרת ניתוח של סמנים וחלבונים רבים, כמו גם אפיון מפורט ברמת תא בודדת. עם זאת, cytometry זרימה דורשת הומוגניזציה ואובדן ארכיטקטורת רקמת רקמה וחייבת להתבצע על רקמה טרי כדי למזער שינויים בפנוטיפ תא. חשוב לציין, עיכב אחסון של הרקמה המיועדת לcytometry זרימה עשוי להשפיע תוכן סלולארי, כמו כמה תת תא עשוי להיות פגיעים יותר לאיסכמיה. Phosphoproteins גם עשוי להתגלות בצורה גרועה על ידי cytometry זרימה אם קינטיקה העיבוד היא הכי מוצלח 15.
פורמלין-קיבעון ופרפין-הטבעה (FFPE) של חלקי רקמות עשויים להיות הבחירה הטובה ביותר במקרה שלחוסר ודאות לגבי עתיד ניתוחים, משום שהיא מאפשרת גמישות גבוהה בסוגי מבחני שניתן לבצע. באופן מסורתי, חלקי FFPE הם מחולק על microtome לתוך 5 מיקרומטר סעיפים אימונוהיסטוכימיה (IHC) או מכתים immunofluorescence (IF). עם זאת, רקמות FFPE השתמרו היטב, ולכן עשויה לשמש למטרות רבות. למעשה, חיתוך חלקים עבים יותר מלוקי FFPE מאפשר גם DNA והפקת RNA עם ערכות מסחריות-זמינות, כמו גם מערך הפוך שלב חלבון (RPPA) ניתוח 16-18. בהתאם לכך, דגימות רקמת העיבוד לFFPE עשויות להציע את היתרון של גמישות נוספת, כמו גם את היתרון של שמירה על מבנה רקמה לimmunostaining ולכן מתן מדויק יותר in vivo הדמוי תיאור של מבני רקמות ואוכלוסיות תאים. FFPE מאפשר לחלקים רקמות שנשמרו במשך תקופות זמן ארוכות. טכניקה זו אינה, עם זאת, יש כמה חסרונות. חלקים דקים המשמשים לFFPE לעשותלא דין וחשבון על ההטרוגניות רקמה מקיצוצים רציפים וחתכים רקמה מתחיל להתחמצן נחשף פעם אחת לאוויר סביבה ובכך פוגע באיכות RNA ו- DNA. לבסוף, בשל crosslinking, שיתוף צביעה של חלבונים מרובים על ידי IHC בסעיפי FFPE דורשת אופטימיזציה.
כאשר מיקרוסקופ באמצעות IHC או אם הוא רצוי, שימוש במתחם אוקטובר עדיף. חלקים מאוחסנים באוק יש לחתוך עם cryotome לפני שיוצב על גבי שקופיות ומשמשים לIHC ואם. אוקטובר שומר antigenicity וממזער רקע מה שהופך את הטכניקה האופטימלית למיקרוסקופיה. אוקטובר גם מאפשר הקפאה מיידית וחיתוך בהשוואה לFFPE שדורש כמה ימים בNBF. למרות יתרונות אלה, OCT הוא בדרך כלל פחות יציב ופחות גמיש מFFPE כי רק IHC ואם ניתן לבצע מסעיפי רקמות מוטבעים-אוקטובר.
בכל הקשור לניתוח RNA, דגימות מאוחסנות על 4 מעלות צלזיוס בפתרון הייצוב-רנ"א להקשיח לאורך זמן, המאפשר דואר RNA טוב יותרxtraction באמצעות ערכות מסחריות-זמינות חילוץ וTRIzol, בין יתר. היתרי הפקת RNA במורד הזרם ניתוחים כגון תגובת השרשרת של פולימראז ההפוך-השעתוק (RT-PCR) לכמת ביטוי של גנים עיבד, ניתוח רצפי RNA, וניתוח ספקטרום רחב של גנים מווסת על ידי microarray, או ניתוח nanoString. בהתאם לכך, בידוד RNA מרקמות יכול להיות מאוד גבוהה תשואה, על ידי מתן מידע נרחב על ביטוי גנים ומסלולים המושפעים טיפולים ומחלות. חשוב לציין, עם זאת, ביטוי RNA עשוי להשתנות בהתאם לאופן דרסטי במבנה רקמות וגודל דגימה, יש להקפיד כל כך נוסף כדי להימנע מהטיית ניתוחים בשל מיקום דגימה. יתר על כן, טבעו של RNA מצביע על כך ששינויים דינמיים ברמות הביטוי עלולים להתרחש, כך טיפול נוסף צריך גם לנקוט כדי להבטיח קינטיקה הנכונה הם אחריו ללמוד גנים ומסלולים של ריבית 19,20; עיבוד צריך להיות מוגבל הבא חילוץ משל הייצוב-רנ"אolution כדי להבטיח יציבות. בהתאם לכך, האחסון של ה- DNA משלים (cDNA) של יציבות מוגברת העדיף RNA (אם בקנה אחד עם ניתוח במורד הזרם) 21. לבסוף, כי RNA עשוי לעתים קרובות להיות מוגבר בניתוחים במורד הזרם, שברים זעירים של תאי זיהום עלולים לגרום להטיות גדולות בתוצאות שהתקבלו.
ניתוח ה- DNA יכול להתבצע על דגימות רקמה בעבר snap-קפוא, או על חלקי רקמות FFPE. שיטות אלה מאפשרות exome לאחר מכן, כולו או רצף הגנום כולו, שתי טכניקות שהראו הבטחה עצומה באמצעות זיהוי המוטציות ופולימורפיזם קשור לתגובת מטופל ופרוגנוזה בהקשרי מחלה מרובות. מיצוי DNA נוסף עשוי לאפשר זיהוי של תאי T וקולט תאי B (TCR וBCR) רצפי הווה בדגימות, על מנת לרכוש ידע הנוגע לאנטיגנים ותגובה חיסונית בטיפול ומחלה 20,21. בהשוואה ל- RNA, DNA הוא מאוד יציב שחולץ פעם אחת, אולםזה לוקח בחשבון תעתיק ורגולצית translational של גנים, כמו גם לאחר translational שינויים ותקנה 22.
חלבון יכול להיות מופק ישירות מהצמד קפוא סעיפי רקמות, או מדגימות FFPE על מנת לבצע ניתוחי כתם מערבי, שיתוף immunoprecipitation לזהות אינטראקציות חלבון ורשתות, כמו גם RPPA, טכניקת תשואה גבוהה מאפשרת כימות היחסית של מאות חלבונים במדגם יחיד 23. עם זאת, טכניקה זו מאפשרת זיהוי של חלבונים ידועים רק באמצעות דרישתה של נוגדנים ספציפיים. חשוב לציין, ניתוח שינוי לאחר translational נוסף, כגון זרחון חלבון, דורש עיבוד מהיר של רקמה עקב חוסר יציבות 15.
הצמד-הקפאה של דוגמאות היא פשוט ודורשת משאבים מוגבלים. זה גם מאפשר אחסון לטווח הארוך של דוגמאות, כאשר ניתוחים במורד הזרם עדיין לא הוגדרו, למעט במקרה של cytometry זרימה אשר חייבת להתבצע על דגימות טריות. דגימות קפואות-הצמד עשויות גם בקלות להיות משותפות למטרות משותפות.
סופו של דבר, את כמות הנתונים שניתן שחולצה מן פיסת הרקמה יחידה היא אינסופית. אין תשובה נכונה אוניברסלית שיש לבצע מבחני בכל מחקר נתון. כל חוקר ולכן צריך לוודא שהוא / היא לוקחת בחשבון את כל ההשערות, ניסויים רצויים, כמו גם משאבים זמינים לפני גיוס חולים ועיבוד רקמות, מכיוון שהדבר עלול להשפיע באופן דרמטי את העיצוב של מחקרים והתשובות שמתקבלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי התרומות הפילנתרופיות של ג'ון ג 'וקרן מארי סטלה Kenedy זיכרון (גרנט # 0,727,033) והברית המחקר מלנומה. המחברים מבקשים להודות לאוניברסיטה של רקמות טקסס MD Anderson Cancer Center מוסדיות בנק (ITB) על תיאום הפצה וגביית רקמות והקלת מחקר translational, כמו גם ד"ר איגנסיו Wistuba, ד"ר ויקטור פרייטו, מחלקת מרכז סרטן MD Anderson ב פתולוגיה ולנומה ירח Shot התכנית. לבסוף, המחברים מבקשים להודות לכל החולים ומשפחות שנפגעו על ידי מלנומה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).
- McCabe, P. M., et al.
- Woolf, S. H. The meaning of translational research and why it matters. JAMA. 299, 211-213 (2008).
- Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).
- Bulmer, M. The ethics of social research. Researching social life. Gilbert, N. , Sage. London. 45-57 (2001).
- Penslar, R. L. IRB guidebook. , US Government Printing Office. (1993).
- Protection of human subjects. CFR Title 21 Section 50.25. , Food and Drug Administration. Available from: http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25 (2011).
- HIPAA privacy rule and public health. Guidance from CDC and the US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention. Available from: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm (2003).
- MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, Institutional Tissue Bank. (2009).
- Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research. , 3rd ed., International Society for Biological and Environmental Repositories. Available from: http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf (2011).
- NCI Best Practices for Biospecimen Resources. , 2nd ed., Office of Biorepositories and Biospecimen Research. Available from: http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf (2011).
- Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Baker, A. F., et al. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).
- Jacobs, S. Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).
- Chung, J. -Y., et al. Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).
- Guo, H., et al. An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays. Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).
- Feldman, A. L., et al. Advantages of mRNA amplification for microarray analysis. Biotechniques. 33, 906-914 (2002).
- Francino, O., et al. Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).
- Grunberg-Manago, M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).
- Lesnik, E. A., Freier, S. M. Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure. Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).
- MacBeath, G.
