Summary
Spine dendritiche di neuroni piramidali sono i siti di maggior sinapsi eccitatorie in mammiferi corteccia cerebrale. Il metodo descrive un'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale nei neuroni piramidali glutamatergici corticali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.
Abstract
Spine dendritiche sono piccole sporgenze che corrispondono ai compartimenti post-sinaptici di sinapsi eccitatorie nel sistema nervoso centrale. Essi sono distribuiti lungo i dendriti. La loro morfologia dipende in gran parte l'attività neuronale, e sono dinamici. Spine dendritiche esprimono i recettori glutamatergici (recettori AMPA e NMDA) sulla loro superficie e ai livelli di densità postsinaptiche. Ogni colonna vertebrale permette al neurone di controllare la propria attività statali e locali in modo indipendente. Morfologie della colonna vertebrale sono stati ampiamente studiati in cellule piramidali glutammatergici della corteccia cerebrale, utilizzando entrambi gli approcci in vivo e colture neuronali ottenute da tessuti di roditori. Condizioni neuropatologiche possono essere associate all'induzione colonna vertebrale alterata e maturazione, come mostrato in roditori neuroni in coltura e analisi quantitativa unidimensionale 1. Il presente studio descrive un protocollo per l'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale utilizzando cortic umanoAl neuroni derivati da cellule staminali neurali (progenitrici fine corticali). Queste cellule sono state inizialmente ottenute da cellule staminali pluripotenti indotte. Questo protocollo permette l'analisi di morfologie della colonna vertebrale in periodi diversi della cultura, e con possibilità di confronto tra le cellule staminali pluripotenti indotte ottenuti da individui di controllo con quelli ottenuti da pazienti con malattie psichiatriche.
Introduction
Spine dendritiche di neuroni piramidali corticali sono piccoli e sottili protuberanze che sono distribuiti lungo i dendriti basali e apicali di questi sottotipi neuronali in roditori, primati, e il cervello umano. Sono i luoghi di maggior sinapsi eccitatorie e visualizzare funzioni chiave nell'apprendimento e processi cognitivi. Le strutture dettagliate delle spine dendritiche umani sono stati tecnicamente studiati da microscopia elettronica 2. Tuttavia, tale approccio è che richiede tempo e rappresenta pesante carico di lavoro. Più recentemente, un tridimensionale (3D) ricostruzione della morfologia delle spine dendritiche è stata riportata nella corteccia cerebrale umana usando software specifico combinato a grandi analisi colonna 3 manuale.
Tecnologia verde proteina fluorescente (GFP) accoppiato ad immunofluorescenza rappresenta uno strumento preciso per l'identificazione della colonna vertebrale e la misurazione forma al microscopio a fluorescenza. Questo approccio può essere facilmente applicato a colture neuronali. However, i dati non sono stati riportati sull'analisi di maturazione della colonna vertebrale e della morfologia dei neuroni umani derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC).
L'obiettivo di questo studio è stato quello di descrivere un protocollo, che permette di spine dendritiche di imaging da colture di neuroni umani in vitro. Etichettatura GFP, microscopia confocale e analisi 3D con il modulo Filament Tracer di software Imaris sono stati utilizzati nel presente protocollo. Cultura passi che sono necessari per ottenere i neuroni glutamatergici corticali degli strati II-IV da cellule staminali neurali (NSC) sono anche brevemente descritto qui. L'intero protocollo per la produzione NSC umano è già stato pubblicato altrove 4.
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Protocol
1. Cultura neuronale
Nota: riprogrammazione dei fibroblasti in cellule staminali pluripotenti, l'impegno per il lignaggio telencefalo dorsale, derivazione, amplificazione, e delle banche dei progenitori tardivi corticali (LCP) sono state descritte in Boissart et al 4. La differenziazione neuronale di cellule LCP-simile è stato effettuato anche secondo Boissart et al 4 con lievi modifiche. Sono state sviluppate altre procedure per la riprogrammazione diretta dei fibroblasti in cellule staminali pluripotenti indotte seguita dalla loro differenziazione in neuroni. Questo protocollo è stato mantenuto poiché consente la produzione selettiva di neuroni glutamatergici piramidali.
- Trattare 6 pozzetti piastre di coltura con vetrini con poli-ornitina (diluito a 1/6 in DPBS, concentrazione della 0,01%) O / N, seguita da tre lavaggi in DPBS. Quindi aggiungere laminina (concentrazione magazzino 1 mg / ml, diluito 500 volte in DPBS) per almeno 10 ore sotto cappa a flusso .
- Piatto e inviare NSC a bassa densità (50.000 cellule / cm 2) a 6 pozzetti piastre di coltura con vetrini in 3 ml di terreno di coltura costituito da DMEM / F12 (500 ml), 2 flaconi (5 ml) di N2 supplemento, 2 flaconi (10 ml ciascuna) di supplemento B27, 10 ml di Pen-streptomicina (Penicillina = 10.000 unità / ml e streptomicina = 10.000 unità / ml), 1 ml di 2-mercaptoetanolo (Soluzione madre: 50 mm) e laminina (1 / 500), senza fattori di crescita. PUNTO CRITICO: Eseguire questo passo con attenzione con l'aggiunta di cellule con movimenti lenti rotanti al fine di ridurre il clustering delle cellule.
- Rimuovere il terreno di coltura. Aggiungere mezzo N2B27 fresco contenente 2 mg / ml di soluzione laminina fresco per mantenere il neurone attaccato sui vetrini ed evitare grumi. Cambia il mezzo ogni 3 giorni. Mantenere un po 'del fluido rimanente (200 ml) prima di aggiungere mezzo fresco per evitare la cella da essiccazione. In alternativa, procedere rapidamente e modificare il volume totale (3 ml).
Nota: vettori lentivirali GFP sono stati gentilmente forniti dal Dr. Uwe Maskos laboratorio presso l'Istituto Pasteur (Parigi) e preparati secondo il protocollo pubblicato 5. GFP è guidata dal promotore del mouse fosfoglicerato chinasi (PGK). Per questo studio, titolo virale è stato pari a 400 ng / ml (soluzione madre in PBS 1x).
- Trasdurre umane neuroni IPSC-derivati in ogni fase di maturazione da particelle virali con l'aggiunta di 1 ml di soluzione madre contenente 40 ng di GFP vettori lentivirali per la cultura (ben 6 pozzetti) e incubare per 48 ore in terreno di coltura fresco. Nota: per questo protocollo, la durata dell'incubazione permette una buona etichettatura delle strutture della colonna vertebrale.
3. immunofluorescenza
Nota: Al fine di migliorare l'etichettatura di tutta la morfologia della colonna vertebrale, etichettatura immunofluorescenza è stata effettuata utilizzando un anticorpo anti-GFP in condizioni permeabilizzate.
4. spine dendritiche Imaging
- Eseguire confocale Imaging attraverso un microscopio confocale a scansione laser.
- Selezionare neuroni sani con una morfologia piramidaletrovare una dendritica pieno, e quantificare almeno 10 neuroni per condizione da esperimenti separati. Quantificare 60-100 micron per dendriti.
- Acquisire le immagini utilizzando un olio 40X NA = 1.3 obiettivo e una linea laser 488 nm per GFP di eccitazione, con una potenza di picco tipica a livello di campione di circa 20? W. Imposta la dimensione dei pixel circa 80 nm per assaggiare correttamente spine dendritiche.
Nota: La successiva chiamata analisi per un'immagine in cui il rumore non compromette la corretta segmentazione dei dendriti e spine. Con le impostazioni di campionamento e di potenza spaziale di cui sopra, abbiamo osservato che un pixel di sosta a tempo di 3.15 ms è sufficiente per raccogliere abbastanza fotoni per costruire una tale immagine. Per campioni dim, la qualità dell'immagine può essere migliorata facendo la media da 2 a 4 scansioni. L'acquisizione di diverse piastrelle XY può essere necessario per coprire la regione di interesse, che poi deve essere cucita insieme prima della trasformazione. - Per campionare l'intero volume neurone, acquisire un Z-stack, conZ spaziatura da 150 nm a 300 nm, producendo 20 a 30 fette Z.
Nota: La risoluzione spaziale laterale realizzato con queste impostazioni è 234 nm e la risoluzione assiale è 591 nm. Il campionamento prescelto qui è adeguata, ma la risoluzione assiale è maggiore della dimensione minima delle spine da acquisire, l'analisi favorisce le spine che si estendono lateralmente da dendriti.
5. 3D Quantificazione di spine dendritiche
Nota: Le seguenti sezioni specificamente descrivono l'uso del software Imaris per l'analisi. Esistono implementazioni alternative, tra cui NeuronStudio 15 o Metamorph 8, che può fornire risultati simili.
Utilizzare le seguenti impostazioni chiave:
- Come una fase di pre-processing, utilizzare il filtraggio gaussiana attraverso i servizi di elaborazione delle immagini offerte dal software. Eseguire il filtraggio gaussiano via Elaborazione immagini> Smoocosa> Filtro gaussiana. Impostare la larghezza del filtro di essere uguale alla dimensione dei pixel in XY.
- Eseguire un tracciato semi-automatica dei dendriti, utilizzando il modulo Filament Tracer del software.
- Innanzitutto, stimare il diametro dendrite, utilizzando lo strumento distanza nella scheda Fetta del software.
- Nella scheda Surpass, fare clic sullo strumento filamenti. Per una migliore robustezza, questo protocollo si basa su di tracking semi-automatico; clicca su Skip creazione automatica. L'interfaccia del modulo ora sta mostrando la scheda Draw. Qui, seleziona AutoPath come metodo, Dendrite come tipo, e il diametro di ingresso dendrite stimato.
- Utilizzare la Selezionare la modalità del puntatore, trasformando il cursore in una scatola. Shift-pulsante destro del mouse sul punto di partenza dendriti. Nota: il software esegue calcoli iniziali.
- Spostare il puntatore lungo dendrite. Dal punto di partenza (rappresentareDE come una sfera blu), è mostrata una linea gialla che rappresenta il percorso dendrite più probabile. Shift-sinistra del mouse sul punto finale dendriti.
- Eseguire la spine di segmentazione automatica. Nota: Le spine sul dendrite tracciato si trovano automaticamente l'interfaccia del modulo.
- Nell'interfaccia del modulo, fare clic sulla scheda Creazione. Nel Ricostruisci casella di riepilogo, scegliere Rebuild Dendrite Diametro e selezionare la casella di dati Mastio. Quindi fare clic su Ricostruisci.
- Impostare la soglia in modo che il volume segmentato corrispondente al volume effettivo dendrite. Come un algoritmo, selezionare più breve distanza dal Mappa distanza. Fare clic sul pulsante Avanti.
- Determinare il più piccolo diametro della testa della colonna vertebrale e la lunghezza massima, sempre utilizzando lo strumento distanza nella scheda Fetta di software, per poi tornare alla scheda Surpass e immettere i parametri. Fo questo protocollo, i valori intorno a 200-300 nm per il diametro minimo e 4 micron per la lunghezza massima sono buoni punti di partenza. Non selezionare la casella Consenti Branch Spine. Fare clic sul pulsante Avanti.
- Regolare la soglia Punti di semi in modo che i punti blu rappresentano spine localizzano alle teste della colonna vertebrale reali. Fare clic sul pulsante Avanti. Nota: Il calcolo nucleo è fatto ora e può essere lungo.
- Classificare spine andando alla scheda Strumenti dell'interfaccia modulo. Clicca su Classifica Spine. Nell'interfaccia utente viene richiesto, assicurarsi che non vi sono quattro classi, definite dalla loro morfologia come segue: tozza: lunghezza <1 micron; Funghi: Lunghezza (colonna vertebrale)> 3 e la larghezza massima (testa)> significano larghezza (collo) x 2; Lungo e sottile: Media larghezza (testa) ≥ media larghezza (collo); Filopodia simile: Lunghezza ≤ 4 micron (senza testa).
Nota: il moInterfaccia Dule genera quattro nuovi oggetti ad incandescenza contenenti i risultati della classificazione. - Esportazione Dati statistici: su uno di questi quattro interfacce degli oggetti, vai alla scheda Statistiche.
Clicca sui Esporta tutte le statistiche su File.
Nota: Altri valori statistici possono essere esportati per dendriti (es., Lunghezza, area, diametro, profondità ramo, diramazione angolo, volume, ecc media.), E per spine (per esempio, rettilineità, zona di attacco, la lunghezza e il volume di distinta parti della colonna vertebrale, del diametro della colonna vertebrale, densità, ecc.)
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Representative Results
Il presente studio descrive un protocollo standardizzato per la quantificazione della colonna vertebrale dei dendriti coltura di neuroni piramidali derivati da IPSC. Questo protocollo permette l'analisi della colonna maturazione sui neuroni umani e la sua possibile confronto con la maturazione delle spine in colture neuronali roditore standard così come in vivo in modelli animali.
Figura 1A rappresenta uno schema delle varie fasi di coltura che permettono la produzione di neuroni piramidali corticali. Tale rappresentazione schematica viene fornita al fine di comprendere meglio la scala tempo globale della produzione di neuroni piramidali dotati di diverse categorie di spine. Passi riprogrammazione, tuttavia, sono fuori del campo di applicazione di questo studio e sono state descritte altrove 4. Neuroni sani possono essere tenuti in coltura fino a 65 -. 70 giorni Figura 1B mostrano il flusso di lavoro di imaging e 3D quantificazione delle spine.
ove_content "> Figura 2A illustra la cultura di neuroni umani marcati con un anticorpo anti-beta III tubulina. Questa figura mostra anche la tendenza del clustering cellule. La Figura 2B mostra una neuroni piramidali GFP-etichettata degli strati corticali superficiali a 40 giorni dopo la differenziazione progenitori corticali di tardiva (LCP).Figura 2C e Figura 3A illustrano ricostruzione 3D di segmenti di spine dendritiche a diversi stadi di maturazione. L'analisi quantitativa dei due parametri selezionati (densità della colonna vertebrale e della colonna vertebrale volume di testa) è rappresentata in figura 3B. I nostri risultati indicano che questi due parametri aumentano nel periodo di coltura come previsto.
Figura 1. (A) Panoramica del calendario di diff neuronale erenziazione. Questa rappresentazione schematica descrive le tre fasi del differenziamento neuronale. Il protocollo è adattato da Boissart et al. 4. Al punto 1, IPSC umano sono derivati nei primi progenitori corticali (es., Le cellule neuro-epiteliali primi del telencefalo dorsale) seguita da trasformazione di progenitori corticali in ritardo (LCP). LCP è poi amplificato per le banche di cellule in azoto liquido. Al punto 2, la differenziazione neuronale viene raggiunto entro due settimane. Fase 3 corrisponde a mantenere i neuroni in coltura per periodi più lunghi, per seguire colonna crescente e progressiva maturazione. Sotto le condizioni di coltura, neuroni sani possono essere conservati fino a 65 -. 70 giorni (B) del flusso di lavoro delle diverse fasi per l'imaging e 3D quantificazione delle spine. (IF: immunofluorescenza). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Cellule positive Figura 2. (A) Beta III tubulina rivelati mediante immunofluorescenza utilizzando lo stesso protocollo come descritto, e un anti-beta anticorpi III tubulina policlonale usati a diluizioni di 1 / 1.000. (B) ramificazione dendritica primaria e secondaria di un GFP -labeled neuroni piramidali coltivato 40 giorni dopo fase LCP. Nel riquadro, lo stesso neurone è rappresentato con un ingrandimento inferiore con corpo cellulare apparente. Ricostruzione (C) 3D di due categorie di spine su un segmento di un dendrite secondaria. Bar Scala:. 250 micron (A), 100 micron (B), 40 micron (B riquadro), a 1,5 micron (C) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Ricostruzione (A) 3D di spine dendritiche (colore blu) con segmenti illustrate di dendriti secondarie (colore grigio), in due diverse fasi della cultura (25 e 45 giorni dopo la differenziazione da LCP). (B) Analisi quantitativa della colonna vertebrale densità e morfologie con due parametri selezionati come la densità delle spine lungo dendriti e la testa della colonna vertebrale volume e in due periodi di cultura. I risultati sono presentati come media ± SEM di almeno 10 segmenti neuronali distinti ottenuti da dendriti secondarie ripresi dal microscopia confocale. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando un test di Mann-Whitney (* p <0,05). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La quantificazione delle caratteristiche morfologiche di neuroni piramidali invocato il software. L'interfaccia Filament Tracer è stato utilizzato per la segmentazione dei neuroni e spine, e il modulo XT è stato utilizzato per l'analisi.
Per analizzare la precisione della nostra tecnica, in primo luogo abbiamo confrontato i parametri morfologici misurati (lunghezza, area e volume totale della colonna vertebrale se applicabile), con quelli pubblicati utilizzando ratto neuroni piramidali maturi nella cultura 6, 7 e tessuti cerebrali umani 3. Densità erano comparabili in tutti i casi. Nessun dati del volume sono stati descritti nei neuroni di ratto (un'analisi 2D è stato riportato con il software utilizzato dagli autori), mentre il volume totale della colonna vertebrale è stato leggermente ridotto rispetto ai nostri dati, nello studio di Benavides-Piccione 3 usando un proprio protocollo per la ricostruzione del volume su spine selezionati. Tali differenze potrebbero anche essere spiegati con la provenienza regionale di cellule e il colorante fluorescente utilizzati per la loroetichettatura.
Alcuni punti critici devono essere sottolineati nel nostro protocollo, che si riferiscono principalmente alle definizioni delle soglie per la qualità confocale di immagini e quantificazioni successive. L'accoppiamento della trasduzione di un vettore lentivirale-GFP con immunofluorescenza anti-GFP assicura una buona etichettatura e visualizzazione delle intere strutture della colonna vertebrale. Non siamo stati in grado di etichettare il dendritica completo transfettando cellule riprogrammate con vettori GFP e dai protocolli convenzionali. In genere, il 70 - 80% sono trasduzione nelle nostre condizioni sperimentali. Tale percentuale è molto più grande di quello che abbiamo osservato utilizzando i protocolli di trasfezione con plasmidi GFP (il 15% dei neuroni trasfettati nei nostri test).
A seconda della efficienza e la specificità di etichettatura, filtraggio gaussiano o deconvoluzione può essere utile come una fase di pre-elaborazione per diminuire il rumore. Abbiamo anche testato la ricostruzione di immagini 3D e la quantificazione dopo deconvoluzione. Questo process si aspettava di essere utile perché, anche con l'imaging confocale, deconvoluzione migliora sensibilmente la qualità delle immagini e dei limiti sfocatura causata dalla diffrazione. Deconvoluzione tuttavia, mette a dura prova importante sul gradino di imaging, imponendo dure campionamento spaziale in tutte e tre le direzioni. Con l'installazione ottico utilizzato in questo protocollo, la dimensione in pixel desiderata per deconvoluzione è di circa 40 nm, mentre abbiamo fissato per circa 80 nm per le immagini qui presentate. Trasferirsi in 40 nm potrebbe quadruplicare il tempo di acquisizione, e abbassare il pixel resa fotone. Inoltre, nelle condizioni sperimentali, alcun miglioramento significativo nei risultati di segmentazione è stato osservato rispetto ai risultati, che possono essere stati ottenuti con filtro gaussiano. Il protocollo si basa pertanto su questo semplice passo post-elaborazione e rilassò i vincoli Z campionamento durante l'imaging. Questo a sua volta diminuisce il tempo di acquisizione e candeggio campione.
Il modulo Filament Tracer offre una completamente automsegmentazione atic. Tuttavia in questo tipo di coltura, i neuroni sono spesso dense, si incrociano tra loro, e vengono esposte da un forte background. Ciò influenza negativamente la precisione di segmentazione automatica. La segmentazione semiautomatica ha portato a risultati più robusti ed elaborazione efficiente. Questo consiste in un tracciato guidata dendriti dal corpo basale del neurone, seguita da una segmentazione automatica 3D di spine lungo dendriti selezionati.
Il nostro metodo può essere utilizzato per eseguire l'imaging time-lapse e registrare direttamente colonna vertebrale maturazione in neuroni da ratto primario neuroni corticali viventi, come descritto in precedenza 8.
Umani neuroni IPSC-derivati hanno attirato l'attenzione degli scienziati e ci sono stati i recenti tentativi di modellare disturbi dello sviluppo neurologico, tra cui disturbi dello spettro autistico 9-14. Nei circuiti corticali, spine dendritiche svolgono un ruolo importante nella creazione di sinapsi eccitatorie, ma la loroanalisi quantitativa è stata scarsamente documentato negli esseri umani con disturbi dello sviluppo neurologico. Durante lo sviluppo e per tutta la durata della vita, la densità delle spine e delle loro morfologie sono fondamentali per la connettività dei circuiti neuronali. In patologie con cause genetiche, l'uso di neuroni COPSI derivati da biopsie paziente (ad es., Fibroblasti) consente l'analisi dello sviluppo circuiti tra i neuroni che esprime il gene mutato (s) che potrebbe essere responsabile di stati di malattia. Questo protocollo rappresenta un approccio potente per esteso in vitro analisi di spinogenesis all'interno di una popolazione di neuroni mutati e confronto di fenotipi con neuroni riprogrammati da individui di controllo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Penicillin-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
References
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