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Developmental Biology

Quantification tridimensionnelle d'épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

doi: 10.3791/53197 Published: October 10, 2015

Summary

Épines dendritiques des neurones pyramidaux sont les sites de la plupart des synapses excitatrices de cortex cérébral de mammifère. Cette méthode décrit une analyse quantitative 3D de la morphologie de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux du cortex glutamatergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites.

Abstract

Épines dendritiques sont des petites saillies qui correspondent aux compartiments post-synaptiques excitateurs de synapses du système nerveux central. Ils sont répartis le long des dendrites. Leur morphologie est largement tributaire de l'activité neuronale, et ils sont dynamiques. Épines dendritiques expriment des récepteurs glutamatergiques (NMDA et AMPA récepteurs) sur leur surface et au niveau de la densité post-synaptique. Chaque colonne permet le neurone de contrôler son activité étatique et local indépendamment. Morphologies de la colonne vertébrale ont été largement étudiées dans les cellules pyramidales du cortex glutamatergiques du cerveau, en utilisant deux approches in vivo et des cultures de neurones obtenus à partir de tissus de rongeurs. Neuropathologiques conditions peuvent être associées à l'induction de l'altération de la colonne vertébrale et maturation, comme représenté sur les rongeurs neurones en culture et l'analyse quantitative unidimensionnelle 1. La présente étude décrit un protocole pour l'analyse quantitative des morphologies 3D de la colonne vertébrale en utilisant cortic humaineal neurones dérivés de cellules souches neuronales corticales (progéniteurs tardifs). Ces cellules ont été initialement obtenues à partir de cellules souches pluripotentes induites. Ce protocole permet l'analyse des morphologies de la colonne vertébrale pendant les périodes de culture différents, et avec possibilité de comparaison entre des cellules souches pluripotentes induites obtenues à partir d'individus témoins avec ceux obtenus à partir de patients atteints de maladies psychiatriques.

Introduction

Épines dendritiques des neurones corticaux pyramidales sont de petites protubérances minces et qui sont distribués le long des dendrites basales et apicales de ces sous-types de neurones dans des rongeurs, des primates, et de cerveau humain. Ils sont les sites de la plupart des synapses excitateurs et afficher les fonctions clés de l'apprentissage et les processus cognitifs. Les structures détaillées des épines dendritiques humaines ont été techniquement étudié par microscopie électronique 2. Cependant, une telle approche est de temps et représente lourde charge de travail. Plus récemment, un à trois dimensions (3D) de reconstruction de la morphologie des épines dendritiques a été rapporté dans le cortex du cerveau humain en utilisant un logiciel spécifique combiné à large analyse de la colonne vertébrale manuel 3.

La protéine de fluorescence verte (GFP) couplé à la technologie immunofluorescence représente un outil précis pour l'identification de la colonne vertébrale et la mesure de la forme de microscopie de fluorescence. Cette approche peut être facilement appliquée à des neurones en culture. However, aucune donnée n'a été signalé sur l'analyse de la colonne vertébrale la maturation et la morphologie sur les neurones humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC).

L'objectif de cette étude était de décrire un protocole, qui permet l'imagerie de la colonne vertébrale dendritique de neurones humains cultivés in vitro. L'étiquetage de la GFP, microscopie confocale et analyse 3D avec le module filament Tracer de logiciels Imaris ont été utilisés dans le présent protocole. Étapes de culture qui sont nécessaires pour obtenir des neurones glutamatergiques corticaux de couches II à IV à partir de cellules souches neurales (NSC) sont également brièvement décrit ici. L'ensemble du protocole pour la production NSC humaine a déjà été publié ailleurs 4.

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Protocol

1. neuronale Culture

Remarque: la reprogrammation des fibroblastes en cellules souches pluripotentes, l'engagement à la lignée dorsale de télencéphale, dérivation, l'amplification, et la banque de progéniteurs corticaux fin (LCP) ont été décrits dans Boissart et al 4. La différenciation neuronale des cellules de LCP-like a également été effectuée selon Boissart et al 4 avec de légères modifications. D'autres procédés ont été développés pour la reprogrammation directe de fibroblastes dans des cellules souches pluripotentes induites suivie de leur différenciation en neurones. Ce protocole a été retenue car elle permet la production sélective des neurones glutamatergiques pyramidaux.

  1. Traiter 6 puits des plaques de culture avec des lamelles de verre avec de la poly-ornithine (dilué au 1/6 dans du DPBS, concentration stock 0,01%) O / N, suivie de trois lavages dans DPBS. Puis ajouter la laminine (concentration de stock 1 mg / ml, dilué 500 fois dans du DPBS) pendant au moins 10 heures sous la hotte à flux .
  2. Plate et envoyé NSC à basse densité (50.000 cellules / cm 2) dans 6 puits des plaques de culture avec des lamelles de verre dans 3 ml de milieu de culture constitué de DMEM / F12 (500 ml), 2 flacons (5 ml chacun) de supplément N2, 2 flacons (10 ml chacun) de supplément B27, 10 ml de Pen-streptomycine (Penicillin = 10.000 unités / ml et de la streptomycine = 10.000 unités / ml), 1 ml de 2-mercaptoéthanol (Solution mère: 50 mM) et de la laminine (1 / 500), sans facteurs de croissance. Étape critique: Effectuer cette étape avec soin en ajoutant des cellules avec des mouvements rotatifs lents afin de réduire le regroupement de cellules.
  3. Retirez le milieu de culture. Ajouter moyen de N2B27 frais contenant 2 pg / ml de solution de laminine frais pour garder le neurone fixé sur les lamelles de verre et d'éviter l'agglutination. Changer le milieu tous les 3 jours. Garder une partie du milieu restant (200 ul) avant d'ajouter du milieu frais afin d'éviter le séchage de la cellule. Sinon, procéder rapidement et de changer le volume total (3 ml).
e_title "> 2. Lentiviral transduction

Remarque: vecteurs lentiviraux GFP ont été aimablement fournies par le Dr Uwe Maskos laboratoire à l'Institut Pasteur (Paris) et préparés selon le protocole publié 5. Expression de la GFP est entraîné par le promoteur de phosphoglycérate kinase de souris (PGK). Pour cette étude, titre viral était de 400 ng / ul (solution mère dans du PBS 1x).

  1. Transduction de neurones humains iPSC dérivés, à quelque étape de maturation par des particules virales en ajoutant 1 pl de la solution de réserve contenant 40 ng de la GFP vecteur lentiviral par puits de culture (plaques de 6 puits) et incuber pendant 48 heures dans un milieu de culture frais. Remarque: Pour ce protocole, la durée d'incubation permet un bon étiquetage des structures de la colonne vertébrale.

3. immunofluorescence

Remarque: Afin d'améliorer l'étiquetage de l'ensemble morphologie du rachis, l'étiquetage d'immunofluorescence a été effectuée en utilisant un anticorps anti-GFP dans des conditions perméabilisées.

  • Retirer milieu de culture et de fixer les cellules transduites sur des lamelles dans du paraformaldéhyde 4% pendant 10 min à température ambiante, puis laver 3 fois dans du PBS 1X (10 minutes chacun).
  • Des lamelles de immerger dans PBS additionné de 0,05% de Triton (100x) et 10% de sérum de cheval pour 1 heure à température ambiante, puis laver 3 fois en PBS 1x.
  • Ajouter 100 ul de 1 x PBS additionné de 4% de sérum de cheval et l'anticorps primaire (1/1000) dirigé contre la GFP et dilué par un facteur de 1000 sur chaque lamelle. Incuber dans une boîte sombre O / N à 4 ° C, puis laver 3 fois avec PBS 1x.
  • Diluer Alexa Fluor 488 conjugué anticorps (1/200) dans du PBS supplémenté avec 0,5% de Tween 20 et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Puis laver 3 fois en PBS 1x et monter des lamelles sur des lames de verre avec un milieu de montage pour la microscopie de fluorescence.
  • 4. épines dendritiques Imaging

    1. Effectuer imagerie confocale à travers un microscope confocal à balayage laser microscope.
    2. Sélectionner neurones sains avec une morphologie pyramidaletrouver une arborisation dendritique complet, et de quantifier au moins 10 neurones par l'état à partir d'expériences distinctes. Quantifier 60 - 100 um par Dendrite.
    3. Acquérir des images à l'aide d'une huile 40X NA = 1,3 objective et une ligne laser de 488 nm pour la GFP excitation, avec une puissance de crête typique au niveau de l'échantillon environ 20 uW. Définir la taille du pixel autour de 80 nm à échantillonner convenablement épines dendritiques.
      Remarque: L'appel de l'analyse subséquente pour une image dans laquelle le bruit ne compromet pas la bonne segmentation des dendrites et des épines. Avec les réglages d'échantillonnage et de puissance spatiales mentionnés ci-dessus, nous avons observé que un pixel temps de séjour de 3,15 ms est suffisante pour collecter suffisamment de photons pour construire une telle image. Pour les échantillons sombres, la qualité d'image peut être améliorée en moyenne de 2 à 4 scans. L'acquisition de plusieurs tuiles XY peut être nécessaire pour couvrir la région d'intérêt, qui doit ensuite être cousus ensemble avant le traitement.
    4. Pour goûter à la totalité du volume de neurone, acquérir un Z-stack, avecZ un espacement allant de 150 nm à 300 nm, ce qui donne 20 à 30 Z tranches.
      Remarque: La résolution spatiale latérale atteint avec ces paramètres est de 234 nm et la résolution axiale est de 591 nm. L'échantillonnage est ici choisie suffisante, mais que la résolution axiale est plus grande que la plus petite taille des épines à imager, l'analyse favorise les épines qui se prolongent latéralement à partir des dendrites.

    5. 3D Quantification des épines dendritiques

    Remarque: Les sections suivantes décrivent spécifiquement l'utilisation du logiciel Imaris pour analyse. Implémentations alternatives existent, y compris NeuronStudio 15 ou Metamorph 8, qui peut fournir des résultats similaires.

    Utilisez les paramètres clés suivants:

    1. Comme une étape de pré-traitement, utiliser le filtrage gaussien à travers les installations de traitement d'image offertes par le logiciel. Effectuer un filtrage gaussien par le traitement d'image> Smoochose> filtre gaussien. Régler la largeur de filtre pour être égale à la taille des pixels en XY.
    2. Effectuer un tracé semi-automatique de dendrites, en utilisant le module filament Tracer du logiciel.
      1. Tout d'abord, estimer le diamètre Dendrite, en utilisant l'outil de la distance dans l'onglet tranche du logiciel.
      2. Dans l'onglet Surpass, cliquez sur l'outil de filaments. Pour une meilleure robustesse, ce protocole repose sur le suivi semi-automatique; cliquer sur la création automatique Ignorer. L'interface du module montre maintenant l'onglet Draw. Ici, sélectionnez AutoPath comme une méthode, Dendrite comme un type, et l'entrée du diamètre de dendrites estimé.
      3. Utilisez le mode de sélection du pointeur, tournant le curseur dans une boîte. Maj-clic-droit sur le point de départ de dendrites. Remarque: le logiciel effectue les calculs initiaux.
      4. Déplacez le pointeur le long de la dendrites. Du point de départ (représentered comme une sphère bleue), une ligne jaune représentant le chemin de dendrites plus probable est indiquée. Maj-clic gauche sur le point de terminaison de dendrites.
    3. Effectuez la épines segmentation automatique. Remarque: Les épines sur la dendrite tracé se trouvent automatiquement par l'interface du module.
      1. Dans l'interface du module, cliquez sur l'onglet Création. Dans la liste déroulante Reconstruire, choisissez Reconstruire Dendrite Diamètre et cochez la case de données Conserver. Puis cliquez sur Reconstruire.
      2. Régler le seuil de sorte que le volume segmenté correspond au volume réel de dendrites. Comme un algorithme, sélectionnez Distance la plus courte de Carte Distance. Cliquez sur le bouton Suivant.
      3. Déterminer le plus petit diamètre de la tête de la colonne vertébrale et la longueur maximale, à nouveau en utilisant l'outil de la distance dans l'onglet tranche du logiciel, puis de revenir à l'onglet dépasser et entrer les paramètres. Fou ce protocole, les valeurs autour de 200 - 300 nm pour le diamètre minimal et 4 um pour la longueur maximale sont de bons points de départ. Ne cochez pas la case Autoriser Direction épines. Cliquez sur le bouton Suivant.
      4. Réglez le Seuil Points de semences afin que les points bleus représentant épines localisent aux chefs de la colonne vertébrale réels. Cliquez sur le bouton Suivant. Note: Le calcul de base est fait maintenant et peut être long.
    4. Classer les épines en allant à l'onglet Outils de l'interface du module. Cliquez sur Classer épines. Dans l'interface utilisateur invité, assurez-vous qu'il ya quatre catégories définies par leur morphologie comme suit: Stubby: longueur <1 pm; Champignon: Longueur (colonne vertébrale)> 3 et la largeur maximum (de la tête)> largeur moyenne (cou) x 2; Long et mince: Largeur moyenne (tête) ≥ Largeur moyenne (cou); Filopodia comme: Longueur ≤ 4 pm (sans tête).
      Remarque: La moInterface Dule génère quatre nouveaux objets à incandescence contenant les résultats de la classification.
    5. Exporter des données statistiques: sur l'un de ces quatre interfaces d'objets, cliquez sur l'onglet Statistiques.
      Cliquez sur l'exportation toutes les statistiques to File.
      Remarque: D'autres valeurs statistiques peuvent être exportés pour dendrites (. Par exemple, longueur, surface, diamètre moyen, la profondeur de la branche, la ramification angle, volume, etc.), Et pour les épines (par exemple, la rectitude, zone de fixation, la longueur et le volume des distincte parties de la colonne vertébrale, diamètre de la colonne vertébrale, les densités, etc.)

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    Representative Results

    La présente étude décrit un protocole normalisé pour la colonne vertébrale quantification des dendrites culture de neurones pyramidaux dérivés de iPSC. Ce protocole permet l'analyse de la colonne vertébrale maturation sur les neurones humains et sa possible par rapport à la maturation des épines dans des cultures neuronales de rongeurs standard ainsi que in vivo dans des modèles animaux.

    La figure 1A représente un schéma des différentes étapes de culture qui permettent la production de neurones pyramidaux du cortex. Cette représentation schématique est fourni afin de mieux comprendre la mise à l'échelle de temps global de la production de neurones pyramidaux dotés de différentes catégories d'épines. Étapes de reprogrammation, cependant, ne sont pas dans le cadre de cette étude et ont été décrits ailleurs 4. Neurones sains peuvent être maintenues en culture jusqu'à 65 -. 70 jours Figure 1B montre le flux de travail de l'imagerie 3D et la quantification des épines.

    ove_content "> Figure 2A illustre la culture de neurones humains marqués par un anticorps de la tubuline anti-bêta-III. Cette figure montre également la tendance de regroupement de cellules. Figure 2B montre un neurone pyramidal de la GFP marqué des couches corticales superficielles à la différenciation de poste de 40 jours progéniteurs corticaux de fin (LCP).

    Figure 2C et 3A illustrent Figure reconstruction 3D des segments des épines dendritiques à différents stades de maturation. L'analyse quantitative des deux paramètres sélectionnés (densités de la colonne vertébrale et le volume de la tête de la colonne vertébrale) est représenté dans la figure 3B. Nos résultats indiquent que ces deux paramètres augmentent au cours de la période de culture comme prévu.

    Figure 1
    Figure 1. (A) Vue d'ensemble de l'échelle de temps diff neuronale érentiation. Cette représentation schématique décrit les trois étapes de la différenciation neuronale. Le protocole est adapté de Boissart et al. 4. A l'étape 1, iPSC humaine sont dérivés dans les progéniteurs précoces corticales (ie., Les cellules neuro-épithéliales précoces du télencéphale dorsal), suivie par la transformation de progéniteurs tardifs corticales (LCP). LCP sont ensuite amplifiés pour les banques de cellules dans l'azote liquide. Dans l'étape 2, la différenciation neuronale est réalisée dans les deux semaines. Étape 3 correspond au maintien des neurones en culture pendant de longues périodes, afin de suivre la colonne vertébrale de croissance et maturation progressive. Dans les conditions de culture, les neurones sains peuvent être conservés jusqu'à 65 -. 70 jours (B) Flux de travail des différentes étapes pour l'imagerie 3D et la quantification des épines. (SI: immunofluorescence). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    ove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figure 2
    Cellules positives à la Figure 2. (A) Bêta III tubuline révélé par immunofluorescence en utilisant le même protocole que décrit, et un anti-bêta anticorps III de la tubuline polyclonaux utilisés à une dilution de 1 / 1.000. (B) de la ramification dendritique primaire et secondaire d'une GFP marqué au neurone pyramidal cultivé 40 jours après l'étape de LCP. Dans l'encart, le même neurone est représenté avec un grossissement inférieur avec le corps de cellule apparent. Reconstruction (C) en 3D de deux catégories d'épines sur un segment d'une dendrite secondaire. Les barres d'échelle:. 250 um (A), 100 um (b), 40 um (B médaillon), 1,5 um (C) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


    Figure reconstruction 3. (A) 3D des épines dendritiques (de couleur bleue) avec des segments illustrés de dendrites secondaires (en gris), à deux stades différents de la culture (25 et 45 jours post-différenciation de LCP). (B) L'analyse quantitative de la colonne vertébrale densités et des morphologies avec deux paramètres sélectionnés tels que la densité de la colonne vertébrale et la tête le long des dendrites de la colonne vertébrale et au volume de deux périodes de culture. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM d'au moins 10 segments distincts de neurones obtenus à partir de dendrites secondaires imagées par microscopie à foyer commun. L'analyse statistique a été effectuée en utilisant un test de Mann-Whitney (* p <0,05). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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    Discussion

    La quantification des caractéristiques morphologiques de neurones pyramidaux appuyé sur le logiciel. L'interface filament traceur a été utilisé pour la segmentation des neurones et des épines, et le module de XT a été utilisé pour leur analyse.

    Pour analyser l'exactitude de notre technique, nous avons d'abord comparé les paramètres mesurés morphologiques (longueur, surface et volume total de la colonne vertébrale le cas échéant), avec ceux publiés en utilisant rat neurones pyramidaux matures dans la culture 6, 7 et tissus cérébraux humains 3. Densités étaient comparables dans tous les cas. Aucune donnée de volume ont été décrits dans les neurones de rat (une analyse 2D a été rapportée avec les logiciels utilisés par les auteurs), tandis que le volume de la colonne vertébrale totale a été légèrement réduite par rapport à des données, dans l'étude de Benavides-Piccione 3 en utilisant leur propre protocole pour la reconstruction du volume sur des épines sélectionnés. De telles différences pourraient aussi être expliquées par l'origine régionale des cellules et le colorant fluorescent utilisé pour leurl'étiquetage.

    Certains points critiques doivent être soulignés dans notre protocole, qui se réfèrent principalement aux définitions de seuil pour la qualité confocale d'images et de quantifications ultérieures. Le couplage de la transduction d'un vecteur lentiviral GFP-immunofluorescence avec anti-GFP assure une bonne visualisation de l'étiquetage et les structures de la colonne vertébrale entière. Nous ne sommes pas en mesure d'étiqueter l'arborisation dendritique complète par transfection de cellules reprogrammées avec des vecteurs de la GFP et par des protocoles classiques. Typiquement, 70 - 80% sont transduites dans nos conditions expérimentales. Ce pourcentage est beaucoup plus grande que ce que nous avons observé en utilisant des protocoles de transfection avec des plasmides GFP (15% des neurones transfectées dans nos tests).

    Selon l'efficacité et la spécificité de l'étiquetage, le filtrage de Gauss ou déconvolution peuvent être utiles comme une étape de pré-traitement pour diminuer le bruit. Nous avons également testé la reconstruction de l'image 3D et la quantification après déconvolution. Cette procéss a été prévu pour être utile parce que, même avec l'imagerie confocale, déconvolution améliore considérablement la qualité d'image et les limites de flou causé par la diffraction. Toutefois, Déconvolution met une pression considérable sur l'étape d'imagerie, imposant échantillonnage spatial sévère dans les trois directions. Avec une configuration optique utilisé dans ce protocole, la taille de pixel souhaitée pour déconvolution est d'environ 40 nm, alors que nous avons mis environ 80 nm pour les images présentées ici. Le passage à 40 nm serait quadrupler le temps d'acquisition, et abaisser le pixel de rendement photonique. En outre, dans les conditions expérimentales, aucune amélioration significative dans les résultats de segmentation a été observée par rapport aux résultats qui auraient été obtenus avec filtrage gaussien. Le protocole repose donc sur cette étape simple post-traitement et assoupli les contraintes Z d'échantillonnage lors de l'imagerie. Cela diminue le temps d'acquisition et de blanchiment échantillon.

    Le module filament Tracer offre une entièrement automsegmentation ATIC. Cependant, dans ce type de culture, les neurones sont souvent dense, se croisent et sont imagées à partir d'une solide expérience. Cela affecte négativement la précision de segmentation automatique. La segmentation semi-automatique a conduit à des résultats plus robustes et un traitement efficace. Il consiste en un suivi guidé de dendrites du corps de base du neurone, suivie par une segmentation 3D le long d'épines automatique dendrites sélectionnés.

    Notre méthode pourrait être utilisée pour effectuer l'imagerie time-lapse et enregistrer directement la colonne vertébrale maturation dans les neurones de rat primaires neurones corticaux vivant, comme décrit précédemment 8.

    Neurones iPSC humaines dérivées ont attiré l'attention des scientifiques et il ya eu des tentatives récentes de modélisation des troubles neurologiques du développement, y compris les troubles du spectre autistique 9-14. Dans les circuits corticaux, épines dendritiques jouent un rôle majeur dans la mise en place des synapses excitateurs, mais leurl'analyse quantitative a été mal documentée chez l'homme souffrant de troubles du développement neurologique. Au cours du développement et tout au long de la durée de vie, les densités d'épines et leurs morphologies sont essentiels pour la connectivité des circuits neuronaux. Dans les pathologies avec des causes génétiques, l'utilisation de neurones iPSC dérivées de biopsies de patients (par exemple., Des fibroblastes) permet l'analyse du développement des circuits entre les neurones exprimant le gène (s) mutée qui pourrait être responsable pour les états pathologiques. Ce protocole est une approche puissante pour l'analyse in vitro en très étendue de spinogenèse sein d'une population de neurones mutés et la comparaison des phénotypes avec des neurones reprogrammées provenant d'individus témoins.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
    Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
    Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
    N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
    B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) Gibco/ Life Technologies 12587010
    DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
    Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
    2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
    Penicillin-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
    GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
    Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
    Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
    Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody Millipore AB9354
    Coverglass 13 mm VWR 631-0150
    Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
    Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
    Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
    Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
    Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
    Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
    Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

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    References

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    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).More

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).

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