Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Трехмерная Количественное дендритных шипиков пирамидальных нейронов из производных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

doi: 10.3791/53197 Published: October 10, 2015

Summary

Дендритных шипиков пирамидальных нейронов сайты большинства возбуждающих синапсов в коре головного мозга млекопитающих. Этот метод описан 3D количественный анализ позвоночника морфологии в корковых нейронов пирамидальной глутаматэргических человека, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

Abstract

Дендритные шипы небольшие выступы, соответствующие постсинаптических отсеков возбуждающих синапсов в центральной нервной системе. Они распределены по дендритов. Их морфология во многом зависит от активности нейронов, и они являются динамическими. Дендритных шипиков выразить глутаматергические рецепторы (АМРА и NMDA рецепторы) на их поверхности и на уровне постсинаптической плотности. Каждый позвоночника позволяет нейрон контролировать его состояние и местного деятельность самостоятельно. Позвоночник морфологии были тщательно изучены в глутаматергических пирамидальных клеток коры головного мозга, с помощью обоих подходов в естественных условиях и нейронные культуры, полученные из тканей грызунов. Нейропатологическое условия могут быть связаны с измененной позвоночника индукции и созревания, как показано на грызунах, культивируемых нейронов и одномерная количественного анализа 1. Настоящее исследование описывает протокол для 3D количественного анализа морфологии позвоночника с использованием человеческой corticаль нейроны, полученные из нервных стволовых клеток (в конце корковых клеток-предшественников). Эти клетки были первоначально получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Этот протокол позволяет проводить анализ позвоночника морфологии в разные периоды культуры, и с возможностью сравнения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из контрольных лиц с данными, полученными от пациентов с психиатрических заболеваний.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Дендритных шипиков корковых пирамидных нейронов являются малые и тонкие выступы, которые распределены вдоль базальных и апикальных дендритов этих нейронов подтипов грызунов, приматов и человека мозг. Они сайты большинства возбуждающих синапсов и отображать ключевые функции в обучении и когнитивных процессов. Подробные структуры дендритных шипиков человека были технически изучал с помощью электронного микроскопа 2. Тем не менее, такой подход требует много времени и представляет большую нагрузку. Совсем недавно, трехмерное (3D) реконструкция морфологии дендритных шипов было сообщено в человеческой коры головного мозга с помощью специального программного обеспечения в сочетании с большой ручной анализ позвоночника 3.

Зеленый флуоресцентный белок (GFP), технологии в сочетании с иммунофлуоресценции представляет собой точный инструмент для идентификации позвоночника и измерения формы флуоресцентной микроскопией. Этот подход может быть легко наносится на культивируемых нейронах. Хоувер, никакие данные не были зарегистрированы на анализе позвоночника созревания и морфологии на человека нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).

Целью данного исследования было описать протокол, который позволяет дендритных позвоночника изображений из культивированных человеческих нейронов в пробирке. GFP маркировки, конфокальной микроскопии и 3D анализ с помощью модуля нити Tracer программного обеспечения Imaris были использованы в настоящем протоколе. Культура шаги, которые необходимы для получения корковых нейронов глутаматергические слоев II к IV от нервных стволовых клеток (НСК), также кратко описаны здесь. Вся протокол для производства человеческого НСК уже были опубликованы ранее 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. нейронов Культура

Примечание: фибробластов Перепрограммирование плюрипотентных стволовых клеток, приверженность спинной конечного мозга родословной, выводе, усиления и банковской поздних предшественников корковых (LCP) были описаны в Boissart др 4. Нейронов дифференциация LCP-подобных клеток также была проведена в соответствии с Boissart др 4 с незначительными изменениями. Другие процедуры были разработаны для прямого перепрограммирования фибробластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с последующим их дифференцировки в нейроны. Этот протокол был сохранен, так как он позволяет селективное образование пирамидальных нейронов глутаматэргических.

  1. Лечить культуры пластины 6-а с покровные стекла с поли-орнитин (разбавленной до 1/6 в DPBS, фондовые концентрации 0,01%) О / N, с последующим тремя промывками в DPBS. Затем добавить ламинин (концентрация акций 1 мг / мл, разбавленный в 500 раз в DPBS), по крайней мере 10 часов под капотом потока ,
  2. Плиты и направить NSC при низкой плотности (50000 клеток / см 2) в культуральных планшетах 6-луночных с покровные стекла в 3 мл культуральной среды, состоящей из DMEM / F12 (500 мл), 2 флакона (5 мл каждого) из N2 добавки, 2 флакона (10 мл каждая) B27 добавки 10 мл Pen-стрептомицина (пенициллин = 10000 единиц / мл и стрептомицин = 10000 единиц / мл) 1 мл 2-меркаптоэтанола (Исходный раствор: 50 мМ) и ламинин (1 / 500), без ростовых факторов. Важным шагом: Выполните этот шаг тщательно, добавив клетки с медленными движениями, вращающиеся в целях сокращения клеток кластеризации.
  3. Удалить культуральной среды. Добавить свежую среду, содержащую N2B27 2 мкг / мл свежего раствора ламинин, чтобы нейрон, прикрепленный на покровные стекла и избежать образования комков. Изменение среды каждые 3 дня. Сохранить некоторые из оставшихся среде (200 мкл) перед добавлением свежей среды для того, чтобы предотвратить клетки от высыхания. Кроме того, протекают быстро и изменить общий объем (3 мл).
e_title "> 2. Лентивирусов Трансдукция

Примечание: GFP лентивирусов векторов были любезно предоставлены доктором Уве Maskos лаборатории в Институте Пастера (Париж) и подготовлены в соответствии с опубликованным протоколом 5. Выражение GFP движет мышь фосфоглицераткиназы (PGK) промотора. Для этого исследования, титра вируса в 400 нг / мкл (маточного раствора в PBS 1X).

  1. Трансдукции человека Ipsc-производные нейроны на любой стадии созревания по вирусных частиц добавлением 1 мкл исходного раствора, содержащего 40 нг GFP лентивирусов вектор в культуре также (6-луночных планшетах) и инкубируют в течение 48 ч в свежей культуральной средой. Примечание: для этого протокола, продолжительность инкубации позволяет хорошо маркировки позвоночника структур.

3. Иммунофлуоресценции

Примечание: Для того чтобы улучшить маркировку всего позвоночника морфологии, иммунофлюоресценции маркировки проводили с использованием антитела против GFP в проницаемыми условиях.

  • Удалить культуральную среду и исправить трансдуцированных клеток на покровных стеклах в 4% параформальдегид в течение 10 мин при комнатной температуре, затем промывают 3 раза в PBS 1x (10 мин каждый).
  • Immerge покровные в ФСБ с добавлением 0,05% Тритона (100x) и 10% лошадиной сывороткой в ​​течение 1 часа при комнатной температуре, затем промывают 3 раза в PBS 1x.
  • Добавить 100 мкл 1x ФБР с добавкой 4% лошадиной сыворотки и антитела (первичного 1/1000), выработанном против GFP и разбавленного в 1000 раз на каждой покровное. Инкубируют в темноте коробки O / N при 4 ° С, затем промыть 3 раза 1x PBS.
  • Развести Alexa Fluor 488-конъюгированного антитела (1/200) в ФБР с добавкой 0,5% Tween 20 и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем промыть 3 раза в 1x PBS и смонтировать покровные на стеклах с монтажной среду для флуоресцентной микроскопии.
  • 4. дендритных позвоночника изображений

    1. Выполните конфокальной микроскопии через конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
    2. Выберите здоровые нейроны с пирамидальной морфологии ай полный дендритных разветвление, и количественно, по крайней мере 10 нейронов за состоянием из отдельных экспериментов. Количественно 60 - 100 мкм за дендритов.
    3. Получение изображений с помощью масла 40X NA = 1.3 Цель и 488 нм лазерный луч для возбуждения GFP, с типичной пиковой мощности на уровне образца около 20 мкВт. Набор размер пикселя около 80 нм правильно отведать дендритных шипиков.
      Примечание: последующий вызов для анализа изображения, в котором шум не скомпрометировать надлежащее сегментации дендритов и шипами. С пространственных отбора проб и силовых установок, упомянутых выше, мы обнаружили, что пиксель выдержки времени 3,15 мкс из достаточно, чтобы собрать достаточное количество фотонов, чтобы построить такой образ. Для тусклых образцов, качество изображения может быть улучшена путем усреднения от 2 до 4 сканирования. Приобретение нескольких XY плитки могут быть необходимы, чтобы покрыть область интереса, который затем должен быть нашит вместе перед обработкой.
    4. Для выборки весь объем нейронов, приобретают Z-Stack, сАг расстояние между диапазоне от 150 нм до 300 нм, получая от 20 до 30 Z ломтики.
      Примечание: Боковая пространственное разрешение достигается с этими настройками составляет 234 нм, а осевое разрешение 591 нм. Выборка выбраны здесь достаточен, но, как осевое разрешение больше, чем наименьший размер шипов для включения в образ, анализ способствует шипы, которые простираются в поперечном направлении от дендритов.

    5. 3D Количественное дендритных шипиков

    Примечание: В следующих разделах специально описывают использование программного обеспечения Imaris для анализа. Существуют альтернативные реализации, в том числе NeuronStudio 15 или Metamorph 8, который может обеспечить аналогичные результаты.

    Используйте следующие основные параметры:

    1. В стадии предварительной обработки, используйте Gaussian фильтрации через терминалы обработки изображений, предлагаемых программным обеспечением. Выполните Gaussian фильтрацию с помощью обработки изображения> Smooвещь> Gaussian фильтр. Установите ширину фильтра будет равен размеру пикселя в XY.
    2. Выполните Полу-автоматическое отслеживание дендритов, с помощью модуля накаливания Tracer программного обеспечения.
      1. Во-первых, оценить дендритов диаметр, с помощью дистанционного инструмента в закладке кусок программного обеспечения.
      2. На вкладке превзойти, щелкните на инструменте нитей. Для лучшего надежности, этот протокол основывается на полу-автоматического отслеживания; нажмите на автоматическое создание Skip. Интерфейсный модуль теперь показывает вкладку Draw. Здесь выбора AutoPath как метод, Dendrite как тип и вход расчетное диаметра дендритов.
      3. Используйте режим выбора указателя, поворотом курсор в окне. Shift-правой кнопкой мыши на дендрит отправной точки. Примечание: программное обеспечение выполняет начальные расчеты.
      4. Наведите указатель вдоль дендритов. От начальной точки (представлятьред как голубой шар), желтая линия, представляющая наиболее вероятный путь дендритов показано. Shift-щелкните левой кнопкой мыши на дендритов конечной точки.
    3. Выполните автоматическую шипами сегментации. Примечание: шипы на трассируемого дендритов находятся автоматически с помощью интерфейса модуля.
      1. В интерфейсе модуля, нажмите на вкладке Создание. В Перестроить выпадающего списка, выберите Rebuild дендритов диаметр и установите флажок сохранить данные. Затем нажмите Rebuild.
      2. Установите порог таким образом, чтобы сегментированный объем соответствует фактическому объему дендритов. Как алгоритм, выберите наименьшее расстояние от Расстояние карту. Нажмите кнопку Далее.
      3. Определить наименьший диаметр позвоночника и головы максимальную длину, опять с помощью дистанционного инструмента в закладке кусок программного обеспечения, а затем вернуться на вкладку превзойти и введите параметры. Fили этот протокол, значения около 200 - 300 нм для минимального диаметра и 4 мкм для максимальной длины хорошие отправные точки. Не проверять Разрешить Отрасль шипами окно. Нажмите кнопку Далее.
      4. Отрегулируйте порог семян Очки так, что синие точки, представляющие колючки локализуются в фактических руководителей позвоночника. Нажмите кнопку Далее. Примечание: Расчет ядро ​​делается сейчас и может быть длительным.
    4. Оцените колючки, перейдя на вкладку Tools интерфейса модуля. Нажмите на Classify Шипы. В посещение пользовательского интерфейса, убедитесь, что существует четыре класса, определяемые их морфологии следующим образом: Stubby: длина <1 мкм; Гриб: Длина (позвоночника)> 3 и Максимальная ширина (головка)> означает, ширина (шея) х 2; Длинные тонкие: Среднее ширина (головка) ≥ Среднее ширина (шея); Филоподий, как: длина ≤ 4 мкм (без головы).
      Примечание: МОИнтерфейс Dule генерирует четыре новых объектов накаливания, содержащие результаты классификации.
    5. Экспорт Статистические данные: на любом из этих четырех интерфейсов объектов, перейдите на вкладку Статистика.
      Нажмите на экспорт всех статистике кнопку в файл.
      Примечание: Другие статистические значения могут быть экспортированы для дендритов (. Например, длина, площадь, средний диаметр, глубина филиал, угол ветвления, громкость, и т.д..), А для шипов (например, прямолинейность, площадь крепления, длины и объема отличаются позвоночник части, диаметр позвоночника, плотность и т.д.).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Настоящее исследование описывает стандартный протокол для позвоночника количественного культивируемых дендритов пирамидальных нейронов, полученных из IPSC. Этот протокол позволяет проводить анализ позвоночника созревания на человека нейронов и его возможного сравнению с созреванием шипов в стандартных культурах грызунов нейронных а также в естественных условиях в животных моделях.

    представляет собой схему различных этапов культуры, которые позволяют производство корковых пирамидных нейронов. Такое схематическое представление предусмотрено для того, чтобы лучше понять глобальное время масштабирование производства пирамидальных нейронов, наделенных различными категориями шипами. Шаги Reprogrammation, однако, выходит за рамки данного исследования и были описаны в другом месте 4. Здоровые нейроны могут быть сохранены в культуре до 65 - 70. Дней показать рабочий процесс визуализации и 3D количественного шипов.

    ove_content "> иллюстрирует культуру человека нейронов помечены тубулина антителами анти-бета-III. На этом же рисунке показана тенденция клеток кластеризации. показывает GFP-меченых пирамидальную нейрон поверхностных слоях коры на 40 дней после дифференциации позднего корковых предшественники (LCP).

    Фиг.2С и показаны 3D реконструкции дендритных сегментов шипов на разных стадиях созревания. Количественный анализ двух выбранных параметров (плотностей позвоночника и объем позвоночника голова) представлена ​​на рис 3B. Наши результаты показывают, что эти два параметра увеличить на период культуры, как ожидалось.

    фигура 1
    Рисунок 1. (А) Обзор сроки нейронов Diff erentiation. Это схематическое представление описывает три стадии дифференцировки нейронов. Протокол приспособлен от Boissart соавт. 4. На стадии 1 человека Ipsc получены в ранних предшественников кортикальных (т.е.., Ранние нервно-эпителиальные клетки из спинного мозге) с последующей трансформацией в конце корковых клеток-предшественников (LCP). LCP затем усиливаются за банка клеток в жидком азоте. На шаге 2, нейронная дифференциация достигается в течение двух недель. Шаг 3 соответствует поддержание нейронов в культуре в течение более длительных периодов, для того, чтобы следовать за позвоночник растущего и прогрессивное созревание. В условиях культуры, здоровые нейроны могут быть до 65 - 70. Дней (Б) Рабочий процесс на различных этапах для визуализации и 3D количественного шипов. (ЕСЛИ: иммунофлюоресценции). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    ove_content "FO: Keep-together.within-странице =" всегда "> Рисунок 2
    Рисунок 2. (А) Бета III тубулина положительных клеток показал с помощью иммунофлуоресценции с использованием того же протокола, как описано, и поликлональное анти-бета-III тубулина антитело, используемое при разведении 1/1000. (Б) Первичная и вторичная дендритных разветвление в GFP меченных пирамидальной нейронов культивировали 40 дней после стадии LCP. На вставке тот же нейрон представлен на низком увеличении с видимой тела клетки. (С) 3D-реконструкция двух категорий шипами на сегменте вторичного дендритов. Масштабные бары:. 250 мкм (а), 100 мкм (B), 40 мкм (б вставка), 1,5 мкм (C) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.


    Рисунок 3. (А) 3D-реконструкция дендритных шипиков (синий цвет) с иллюстрированными сегментов вторичного дендритов (серого цвета), в двух разных стадиях культивирования (25 и 45 дней после дифференцировки из LCP). (Б) Количественный анализ позвоночника плотности и морфологии с двумя выбранными параметрами, таких как плотность позвоночника вдоль дендритов и позвоночника головы объеме и на двух периодов культуры. Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM по меньшей мере 10 различных сегментов, полученных из нейронов вторичных дендритов, отображаемых конфокальной микроскопии. Статистический анализ проводили с использованием критерия Манна-Уитни (* р <0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Количественное определение морфологических особенностей пирамидальных нейронов полагаются на программное обеспечение. Интерфейс нити Tracer был использован для сегментации нейронов и шипов, и модуль XT был использован для их анализа.

    Для анализа точности нашей техники, мы впервые сравнили измеряемые параметры морфологические (длина, площадь, объем и общая позвоночника, когда это применимо), с теми, опубликованные с помощью крыс зрелые нейроны в культуре пирамидальные 6, 7 и тканях мозга человека 3. Удельный были сопоставимы во всех случаях. Нет данных объем не были описаны в крыс нейронов (2D-анализ сообщается с программным обеспечением, используемым авторами), тогда как общий объем позвоночника был немного уменьшен по сравнению с нашими данными, в исследовании Бенавидес-Piccione 3, используя свой ​​собственный протокол для реконструкции объема на отдельных шипами. Такие различия также могут быть объяснены с помощью регионального происхождения клеток и флуоресцентного красителя, используемого для ихмаркировка.

    Некоторые критические точки должны быть подчеркнуты в нашем протоколе, который в основном относятся к пороговым определений конфокальной качества изображений и последующие количественными. Сочетание трансдукции в GFP-лентивирусов вектора с анти-GFP иммунофлюоресценции обеспечивает хорошую маркировку и визуализацию всего позвоночника структур. Мы не смогли маркировать полный ветвления дендритов путем трансфекции клеток перепрограммировать с GFP векторов и обычных протоколов. Как правило, 70 - 80% трансдуцируют в наших экспериментальных условиях. Такой процент гораздо больше, чем то, что мы наблюдали с использованием протоколов трансфекции с GFP плазмиды (15% трансфицированных нейронов в наших тестах).

    В зависимости от эффективности и специфичности маркировки, гауссов фильтрования или деконволюции может быть полезным в качестве стадии предварительной обработки уменьшают шум в. Мы также протестировали 3D-реконструкция изображения и количественное после деконволюции. Это процесс, как ожидается, будет полезно, потому что, даже при конфокальной микроскопии, деконволюция значительно улучшает качество изображения и пределы размытости, вызванной дифракции. Разложение однако, ставит главную нагрузку на этапе визуализации, наложение суровых пространственную выборку по всем трем направлениям. С оптической схемы, используемой в этом протоколе, желаемый размер пикселя для деконволюции составляет около 40 нм, в то время как мы установили около 80 нм для изображений, представленных здесь. Грузоперевозки до 40 нм будет в четыре раза время приобретения, и снизить выход фотонов пиксель. Кроме того, в условиях эксперимента, не значительное улучшение результатов сегментации не наблюдалось, по сравнению с результатами, которые могли бы быть получены с гауссовым фильтрации. Протокол поэтому полагается на эту простой шаг пост-обработки и расслабленной ограничения выборки Z во время съемки. Это, в свою очередь уменьшило время приобретения и образец отбеливание.

    Модуль накаливания Tracer предлагает полностью автомATIC сегментации. Однако в этом типе культуры, нейроны часто плотный, пересечь друг друга, и загружаются от сильного фона. Это отрицательно влияет на точность автоматической сегментации. Полуавтоматическая сегментация привело к более надежные результаты и эффективной обработки. Он состоит из управляемой трассировки дендритов из базального тела нейрона, а затем с помощью автоматического 3D сегментации шипами вдоль выбранных дендритов.

    Наш метод может быть использован для выполнения покадровой обработки и непосредственно записывать позвоночника созревание в живых нейронов крысы из первичных корковых нейронов, как описано ранее 8.

    Человека IPSC-производные нейроны обращается внимание ученых и были недавние попытки моделирования развития нервной расстройств, включая расстройствами аутистического спектра 9-14. В корковых схем, дендритных шипиков играют важную роль в создании возбуждающих синапсов, но ихКоличественный анализ был плохо документированы у людей с нарушениями развития нервной. Во время разработки и на протяжении всего срока, плотность шипов и их морфологии имеют решающее значение для подключения нейронных цепей. В патологии с генетическими причинами, использование IPSC, полученных из нейронов биопсии пациентов (например,., Фибробластов) позволяет анализ развития схем между нейронами, выражающее мутантный ген (ы), которые могут быть ответственны за болезненных состояний. Этот протокол представляет собой мощный подход к обширной в пробирке анализа spinogenesis в популяции мутантных нейронов и сравнения фенотипов с перепрограммировать нейронов управления лиц.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
    Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
    Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
    N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
    B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) Gibco/ Life Technologies 12587010
    DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
    Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
    2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
    Penicillin-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
    GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
    Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
    Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
    Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody Millipore AB9354
    Coverglass 13 mm VWR 631-0150
    Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
    Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
    Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
    Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
    Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
    Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
    Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17, (1), 71-84 (2013).
    2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
    3. Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23, (8), 1798-1810 (2013).
    4. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
    5. Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105, (41), 15991-15996 (2008).
    6. Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28, (24), 6079-6091 (2008).
    7. Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287, (43), 35964-35974 (2012).
    8. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
    9. Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5, (1), 26-32 (2012).
    10. Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
    11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33, (5), 409-417 (2014).
    12. Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
    13. Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. (2014).
    14. Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
    15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3, (4), e1997 (2008).
    Трехмерная Количественное дендритных шипиков пирамидальных нейронов из производных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).More

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter