Summary
Nós demonstramos o efeito de reticulação escleral com riboflavina e UVA em um olho alongamento coelho axial. alongamento axial foi induzida em coelhos 13 dias de idade Nova Zelândia (masculino e feminino) suturando as pálpebras do olho direito (tarsorrafia).
Abstract
indivíduos míopes, especialmente aqueles com miopia severa, apresentam risco mais elevado do que o normal de catarata, glaucoma, descolamento de retina e alterações coriorretinianas. Além disso, miopia patológica é uma causa irreversível comum de deficiência visual e cegueira 1-3. O nosso estudo demonstra o efeito de reticulação escleral utilizando riboflavina e ultravioleta A radiação sobre o desenvolvimento da miopia axial num modelo de coelho. O comprimento axial do globo ocular foi medida por A-scan de ultra-sons em coelhos brancos New Zealand com idade de 13 dias (macho e fêmea). O olho, em seguida, foram submetidos a 360 ° peritomia conjuntival com reticulação escleral, seguido por tarsorrafia. alongamento axial foi induzida em 13 dias de idade coelhos Nova Zelândia por sutura as pálpebras do olho direito (tarsorrafia). Os olhos foram divididos em quadrantes e cada quadrante tinha duas zonas de irradiação esclerais, cada um com uma área de 0,2 cm² e um raio de 4 mm. A ligação cruzada foi realizada pela queda de 0,1%riboflavina-5-fosfato para a zonas de irradiação de 20 segundos antes de ultravioleta-A irradiação e a cada 20 segundos durante o tempo de irradiação de 200 seg-dextrano livre. A radiação UVA (370 nm) foi aplicado perpendicularmente à esclerótica a 57 mW / cm² (dose total de luz UVA, 57 J / cm). Tarsorrhaphies foram removidos no dia 55, seguida de medições repetidas comprimento axial. Este estudo demonstra que a reticulação escleral com ultravioleta e riboflavina-A radiação impede eficazmente induzida por oclusão alongamento axial em um modelo de coelho.
Introduction
Miopia é a mais comum das desordens de refracção. A prevalência de miopia nos EUA e na Europa é relatado para ser em torno de 30%, e em países asiáticos que afeta até 60% da população em geral 1,2. Progressão da miopia ocorre em até 50% dos míopes, geralmente a uma taxa de cerca de -0,5 dioptrias ao longo de um intervalo de dois anos 3. Os custos de saúde impostas por miopia são consideráveis, incluindo as despesas para óculos, lentes de contato e cirurgia refrativa e custos relacionados com o aumento dos riscos para a saúde de glaucoma, catarata, descolamento de retina e deficiência visual 4-6.
Em estudos com animais de miopia, a redução da visão é induzida por sutura pálpebra 7-10, a colocação de um oclusor a uma curta distância a partir do olho e tatuagem da córnea 11. No entanto, para a miopia artificial para ocorrer nestes estudos, o processo de oclusão tem de ser realizado em animais muito jovens, como não há experiências de privação de vista carrIED para fora em espécimes adultos têm tido êxito.
Uma das características importantes da miopia grave é uma alteração patológica da esclerótica com adelgaçamento progressivo da esclera, provavelmente devido a um mecanismo de feedback perturbado de emetropiza�o após privação visuais 12 ou devido a alguma perturbação metabólica da esclerótica, tal como em Ehlers Danlos 13. Em última análise, ambos os mecanismos levam ao estiramento e afinamento da esclera, retina e coróide devido a anomalias estruturais da esclera míope como a diminuição do colágeno diâmetro da fibra 14,15 e os distúrbios fibrilogênese 16.
Vários estudos têm mostrado que prejudicada reticulação do colagénio é um factor importante para o processo de enfraquecimento da esclera míope 17-18. Wollensak et ai. 19-21 induzida colagénio de ligação cruzada através da aplicação do fotossensibilizador riboflavina e irradiação ultravioleta-A (UVA) (370 nm)e observou um aumento significativo de 157%, na rigidez de porcino e humano in vitro esclera 19, e um aumento de 465% em rigidez escleral coelho in vivo (módulo de Young) 20. A reticulação também teve um efeito a longo prazo sobre esclera coelho in vivo: rigidez aumentada em 320,4% após 3 dias, 277,6% depois de 4 meses, e 502% após 8 meses (módulo de Young) 22.
Tentativas terapêuticas para deter a progressão da miopia foram publicados 23-26 mas o sucesso destes métodos é controversa. Não há meios eficazes de prevenir a miopia progressiva foi encontrado até o momento.
A etiologia da miopia ainda é controversa, e seu tratamento representa um desafio. Com base nestes resultados, é a hipótese de que a reticulação da esclerótica pode servir como um meio para o tratamento à base de esclerótica de progressão da miopia. O objetivo deste estudo é examinar a crosslinki colágeno escleralng efeito sobre o desenvolvimento da miopia axial induzida por oclusão visual.
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Protocol
Os animais foram tratados de acordo com a resolução da ARVO sobre o uso de animais em pesquisa. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê institucional para o Animal Research Laboratory (aprovação sem 022-4598-2;. 021.211).
1. Preparação para a cirurgia # 1
- Pesar e anestesiar um coelho branco da Nova Zelândia 13 dias de idade, com uma injecção intramuscular de cloridrato de cetamina 100 mg / ml (100 mg / kg) e cloridrato de xilazina 25 mg / ml (12,5 mg / kg). Essas doses são utilizados devido à duração do processo cirúrgico. Assegurar nível adequado de anestesia com a falta de um reflexo dor.
- Usando uma mecha de algodão estéril, aplicar uma pequena quantidade de pomada oftálmica para o olho não operado para impedir que a córnea de secar. Aplicar 0,9% de solução salina normal de gotas sobre a córnea do olho operado durante a operação para evitar que as córneas de secar.
- Realizar três medições de comprimento axial em cada olho, após anestesia tópica (oxybuprocaine cloridrato de 0,4%) usando um ultra-som Um scanner e, em seguida, calcular a média das medições. Aplicar a sonda perpendicularmente à córnea central.
2. Cirurgia # 1 - Pré Cruz Passo Linking
- Utilizando uma pinça oftálmicos cirúrgicos e tesouras sob um microscópio cirúrgico oftálmico, fazer uma peritomia 360 ° conjuntival com uma pinça oftálmicos cirúrgicos e tesouras.
- Usando uma pinça em ângulo ou um gancho muscular identificar os quatro músculos retos extra-oculares e isolá-los com um 2-0 trançado de seda suturas não agulhados.
NOTA: As suturas de seda vai ajudar com mover o mundo em direção desejada. O globo ocular é dividido em quadrantes entre os quatro músculos retos (quatro quadrantes).- Mark pele com um marcador de duas zonas, em cada quadrante, um na esclera equatorial e um na esclera posterior. Estas são as zonas de irradiação.
- Prepare de 3 ml a seringa de 5 ml contendo 0,1% de riboflavina-5-Phosphat livre de dextranoe. Ligar a seringa a uma cânula lacrimal 26 G ou 25 G hydrodelineator cônico.
- Prepara-se o dispositivo de irradiação que inclui uma fonte de luz UV A (370 nm) ligado a um chanfrada para baixo feito por medida de fibra óptica. Após a medição da potência de energia e de calibração (ver nota abaixo), configurar o dispositivo para 57 mW / cm².
NOTA: A calibração foi realizada comercialmente pelo fabricante. Este método fornece uma dose total de luz UVA de 57 J / cm². (57 mW / cm 2 em 0,2 cm 2 é de 11,4 mW / 0,2 cm 2 utilizando 11,4 mW / 0,2 cm 2 para 200 segundos é uma carga acumulada de 2,2 J por 0,2 cm 2 spot)
3. Cirurgia # 1 - Cross Linking
- Mover o globo ocular, puxando as suturas de seda no sentido oposto do quadrante escolhido para ser tratada (por exemplo, Pull-se e quando o tratamento nasal quadrante temporal inferior). Realize o movimento do globo ocular usando uma sutura de seda 2-0 trançado não-needled que isolates cada músculo reto.
- Aplicar a solução fotossensibilizador contendo 0,1% de riboflavina-5-fosfato livre de dextrano para a zona de irradiação de 20 segundos antes de iniciar a irradiação.
- Irradiar o zona de irradiação usando um chanfrado para baixo feita sob encomenda da fibra óptica por um período de irradiação de 200 seg. Medir a área de cada uma das zonas de 0,2 cm com um raio de 4 mm.
- Aplicar a solução fotossensibilizador contendo 0,1% de riboflavina-5-fosfato livre de dextrano para a zona de irradiação cada 20 seg durante o período de irradiação de 200 seg.
NOTA: Executar a irradiação e o lançamento de riboflavina simultaneamente por dois cirurgiões. - Repita os passos de 3,1-3,4 para cada um dos quatro quadrantes do globo ocular.
4. Cirurgia # 1 - Post Cruz Passo Linking
- Raspar a pele ao redor dos olhos. Aparar as margens da pálpebra com uma tesoura oftálmicos cirúrgicos e em seguida, delicadamente suturar a parte superior e as pálpebras inferiores usando 4-0 trançado cor marfim de seda - 3/8 círculo recomprimento 13 milímetros verso cutting- C-3 de agulha (tarsorrafia). Aplicar uma pequena quantidade de pomada oftálmica na margem da pálpebra, no final do procedimento (cloranfenicol 5%).
5. Cirurgia # 1 - Cuidados pós-operativo
- Mantenha os animais sob uma lâmpada de aquecimento durante a recuperação. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
- Colocar o animal em uma gaiola limpa com novas roupas até que esteja totalmente recuperado. Após a recuperação, o animal será devolvido para a sala de animal. Devolver o animal para sua mãe apenas quando acordado.
- Durante as primeiras 48 horas, examinar os animais relativas ao estado geral e sinais de doença ou infecções. Administrar analgesia conforme a secção 1. analgesia Administrar conforme necessário, se uma mudança no comportamento do coelho é observado. (Metamisole cai 50 mg / kg a cada 6 horas).
6. Cirurgia # 2
- Cinquenta e cinco dias após surgery # 1, pesar e anestesiar o coelho com uma injecção intramuscular de cloridrato de cetamina 100 mg / ml (100 mg / kg) e cloridrato de xilazina 25 mg / ml (12,5 mg / kg).
- Com uma tesoura oftalmológicas cirúrgicas sob um microscópio cirúrgico oftálmico, remover a tarsorrafia. Realizar três medições de comprimento axial em cada olho após anestesia tópica (cloridrato oxibuprocaína 0,4%) usando um ultra-som A-scanner e, em seguida, calcular a média das medições. Aplicar a sonda perpendicularmente à córnea central.
- Eutanásia dos coelhos com fenobarbital de sódio intraperitoneal (200 mg / 1,5 kg de peso corporal).
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Representative Results
As Figuras 1 e 2 mostram graficamente as medições de comprimento axial de dois grupos. Grupo 1 coelhos foram submetidos a ligação cruzada de esclerótica e tarsorrafia no olho direito, enquanto o olho esquerdo não foi operado (Figura 1). Grupo 2 coelhos foram submetidos somente peritomia e tarsorrafia no olho direito, enquanto o olho esquerdo não foi operado (Figura 2).
No grupo 1, que sofreu reticulação escleral e tarsorrafia, o comprimento axial significa no olho direito medido 10,68 ± 0,74 mm, antes da sutura da pálpebra e 14,29 ± 0,3 milímetro 55 dias mais tarde, por uma diferença média de 3,61 ± 0,76 mm. Valores correspondentes no olho não operado / suturar esquerda foram 10,70 ± 0,79 mm e 15,14 ± 0,32 mm, uma diferença média de 4,44 ± 0,81 mm (Figura 1). A comparação dos comprimentos axiais da suturadae olhos por suturar no final da fase de oclusão revelaram um aumento líquido menor nos olhos suturados.
No grupo 2, que foram submetidos somente peritomia e tarsorrhaphies, significa comprimento axial do olho direito medido 10,50 ± 0,67 mm, antes da sutura da pálpebra e 15,69 ± 0,39 milímetros 55 dias mais tarde, por uma diferença média de 5,19 ± 0,85 mm. Valores correspondentes no olho não operado / suturar esquerda foram 10,54 ± 0,71 mm e 14,74 ± 0,38 mm, uma diferença média de 4,20 ± 0,67 mm (Figura 2). A comparação dos comprimentos axiais dos olhos suturados e suturar no final da fase de oclusão revelaram um aumento líquido maior nos olhos suturados.
A comparação da alteração média do comprimento axial do olho direito entre o grupo 2 (5,19 ± 0,85 mm) e o grupo 1 (3,61 ± 0,76 milímetros), produziu um valor significativamente mais baixo no final da oclusão pHase (55 dias) nos olhos que se submeteram ao procedimento de reticulação (p <0,001, teste não paramétrico de Mann-Whitney). A diferença entre os grupos no comprimento axial significativo nos olhos do lado esquerdo (4,20 ± 4,44 vs 0,67 milímetros ± 0,81 milímetros) não foi estatisticamente significativa (p = 0,39, teste de Mann-Whitney não-paramétrico).
Figura 1. Olho medições axiais certas antes e depois de reticulação escleral e tarsorrafia vs. medições axiais olho esquerdo. A média do comprimento axial do olho direito antes de reticulação escleral e tarsorrafia (início RE) e após a remoção do tarsorrafia 55 dias mais tarde (fim RE). O comprimento axial média do olho esquerdo na linha de base (LE iniciar) e 55 dias depois (no final LE). O olho esquerdo não foi operado e foi deixada em aberto. As barras de erro indicam o erro padrão da média. (Re-impresso com Permission da referência 27). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Olho medições axiais certas antes e depois tarsorrafia vs. medições axiais olho esquerdo. A média do comprimento axial do olho direito antes da tarsorrafia (início RE) e após a remoção do tarsorrafia 55 dias mais tarde (fim RE). O comprimento axial do olho esquerdo na linha de base média (LE começar) e 55 dias mais tarde (fim LE) .A olho esquerdo não foi operado e foi deixada em aberto. As barras de erro indicam o erro padrão da média. (Re-impresso com a permissão da referência 27). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apresenta-se o primeiro estudo in vivo da prevenção da miopia axial num modelo de coelho utilizando a tecnologia de ligação cruzada com riboflavina e irradiação UVA. Embora diferentes animais de laboratório pode ser usado neste tipo de estudo, escolhemos coelhos principalmente devido ao tamanho dos olhos e a necessidade de realizar a reticulação na superfície escleral.
Descobrimos que a exposição da esclera de coelhos e suturando as pálpebras superior e inferior para ser processos de interpelação. Recomendamos aparar as margens da pálpebra e usar as suturas mencionados no nosso protocolo para garantir que as pálpebras são bem fechada para o período determinado, sem necessidade de correções.
Um ponto importante a considerar é a necessidade de calibrar o dispositivo de irradiação e a fibra óptica para a energia de alimentação necessária.
H & E lâminas histológicas não revelaram alterações tóxicas para a retina em olhos submetidos ao processo de reticulação. Novas investigações devem ser realizadas para tratar a toxicidade potencial de riboflavina e irradiação UVA na retina, coróide e esclera, com foco na posição, a quantidade de energia e tempo de exposição.
Várias limitações deste estudo consideração mandado. Apenas pré-operatório e pós-operatório comprimentos axiais foram medidos. O comprimento axial do globo ocular foi medida por A-scan de ultra-sons. Nós não avaliar as propriedades biométricos, análise de refração ou propriedades biomecânicas da esclera.
Tomados em conjunto, pensamos que o efeito da reticulação escleral com riboflavina e UVA no alongamento axial do olho de coelho terá um impacto positivo na pesquisa de miopia.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Sra Dalia Sela eo Sr. Emi Sharon por seu trabalho técnico profissional e excelente no laboratório.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 braided silk non-needled sutures | ETHICON | W193 | |
| 4-0 braided silk ivory color | ETHICON | W816 | |
| 0.1% dextran-free riboflavin-5-phosphate 1 mg:1 ml | Concept for Pharmacy Ltd | D2-5025 | |
| UV A (370 nm) light source | O/E LAND Inc | NCSU033B | |
| Beveled down custom made fiber optic | Prizmatix Ltd | ||
| 26 G lacrimal cannula | Beaver-visitec International Ltd. | REF581276 | |
| 25 G tapered hydrodelineator [Blumenthal] | Beaver-visitec International Ltd. | REF585107 | |
| 13 days old rabbits | Harlan | 1NZWR40 | |
| Ultrasonic biometer | Allergan-Humphrey | 820-519 | |
| Skin marker | Devon | 4237101664X |
References
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