Summary
Wir zeigen die Wirkung von scleral Vernetzung mit Riboflavin und UVA auf einer axialen Verlängerung Kaninchenaugen. Axial Dehnung wurde in 13 Tage alte Neuseeland-Kaninchen (männlich und weiblich), induziert durch ihr rechtes Auge Augenlider Vernähen (Tarsorrhaphie).
Abstract
Kurzsichtige Menschen, vor allem diejenigen mit starker Kurzsichtigkeit, sind bei höheren als normalen Risiko von Katarakt, Glaukom, Netzhautablösung und chorioretinale Anomalien. Darüber hinaus ist pathologischen Myopie eine häufige Ursache für irreversible Sehbehinderung und Blindheit 1-3. Unsere Studie zeigt die Wirkung der skleralen Vernetzungs unter Verwendung von Riboflavin und Ultraviolett-A-Strahlung auf die Entwicklung von Achsenmyopie in einem Kaninchenmodell. Die axiale Länge des Augapfels wurde von A-Scan Ultraschall in weißen Neuseeland-Kaninchen gemessen im Alter von 13 Tage (männlich und weiblich). Das Auge unterzog sich dann um 360 ° konjunktivaler Peritomie mit scleral Vernetzung, gefolgt von Tarsorrhaphie. Axial Dehnung wurde in 13 Tage alte Neuseeland-Kaninchen induziert durch ihr rechtes Auge Augenlider Vernähen (Tarsorrhaphie). Die Augen wurden in Quadranten unterteilt, und jeder Quadrant hatte zwei skleralen Bestrahlungszonen, die jeweils mit einer Fläche von 0,2 cm² und einem Radius von 4 mm. Die Vernetzung wurde durch Eintropfen von 0,1% durchgeführtDextran freien Riboflavin-5-phosphat auf die Bestrahlungszonen 20 sec vor Ultraviolett-A-Bestrahlung und alle 20 sec bei 200 sec-Bestrahlungszeit. UVA-Strahlung (370 nm) wurde senkrecht zur Sklera bei 57 mW / cm² (Gesamt UVA-Licht-Dosis, 57 J / cm²) aufgetragen. Tarsorrhaphies wurden am Tag 55 entfernt, durch wiederholte axiale Längenmessungen verfolgt. Diese Studie zeigt, dass skleralen Vernetzung mit Riboflavin und Ultraviolett-A-Strahlung wirksam Okklusion induzierten axialen Dehnung in einem Kaninchenmodell verhindert.
Introduction
Myopie ist die häufigste der Brechungsstörungen. Die Prävalenz der Kurzsichtigkeit in den USA und Europa wird berichtet , um 30% zu sein, und in den asiatischen Ländern wirkt sich dies auf 60% der Gesamtbevölkerung 1,2 auf. Myopic Progression tritt bei bis zu 50% der Kurzsichtigen in der Regel mit einer Rate von rund -0,5 Dioptrien über einen Zwei-Jahres - Intervall 3. Die Gesundheitskosten durch Kurzsichtigkeit auferlegt sind beträchtlich, einschließlich der Kosten für Brillen, Kontaktlinsen und der refraktiven Chirurgie und der erhöhten Gesundheitsrisiken des Glaukoms bezogenen Kosten, Katarakt, Netzhautablösung und Sehstörungen 4-6.
In Tierstudien der Kurzsichtigkeit wird Anblick Reduktion von Augenlid Vernähen 7-10, Platzierung eines Okkluders in einem kurzen Abstand vom Auge und Keratographie 11 induziert. Doch für künstliche Kurzsichtigkeit in diesen Studien zu kommen, muss der Okklusion Prozess, da keine Sicht Deprivation Experimente auf sehr jungen Tieren, zu carried heraus wachsene Exemplare haben sich bewährt.
Eine der wichtigen Funktionen von schwerer Myopie ist eine krankhafte Veränderung der Sklera mit progressiver Verdünnung der Sklera, wahrscheinlich aufgrund einer gestörten Rückkopplungsmechanismus von emmetropization nach visueller deprivation 12 oder aufgrund eines Stoffwechselstörung der Sklera, wie in Ehlers Danlos - Syndrom 13. Letztlich führen beide Mechanismen zur Dehnung und Ausdünnung der Lederhaut, Netzhaut und Aderhaut aufgrund von strukturellen Anomalien des kurzsichtigen Lederhaut wie eine verringerte Kollagenfaserdurchmesser 14,15 und Störungen in Fibrillogenese 16.
Mehrere Studien haben gezeigt , dass eine beeinträchtigte Kollagenvernetzung ein wichtiger Faktor in der Schwächungsprozess des myopischen Sklera 17-18 ist. Wollensak et al. 19-21 induzierten Kollagenvernetzung durch den Photosensibilisator Anwendung Riboflavin und ultraviolett-A (UVA) Bestrahlung (370 nm)und stellten eine signifikante, 157% Erhöhung der Steifigkeit von Schwein und Mensch Sklera in vitro 19 und eine 465% ige Steigerung in Kaninchen Sklerarigidität in vivo (Young-Modul) 20. Crosslinking hatte auch eine langfristige Wirkung auf Kaninchen Sklera in vivo: Steifigkeit von 320,4% erhöht nach 3 Tagen, 277,6% nach 4 Monaten und 502% nach 8 Monaten (Young-Modul) 22.
Therapeutische Versuche kurzsichtig Progression zu verhaften wurden 23-26 veröffentlicht , aber der Erfolg dieser Methoden ist umstritten. Keine effiziente Mittel zur Verhinderung von progressiver Myopie wurde bisher gefunden.
Die Ätiologie der Kurzsichtigkeit ist nach wie vor umstritten, und seine Behandlung stellt eine Herausforderung dar. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird angenommen, dass skleralen Vernetzung als Mittel zur Sklera-basierten Behandlung von myopischen Progression dienen kann. Das Ziel dieser Studie ist es, die scleral Kollagen crosslinki zu untersuchenng Wirkung auf die Entwicklung der Achsenmyopie durch Sehachse Okklusion induziert.
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Protocol
Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit der ARVO Resolution über die Verwendung von Tieren in der Forschung behandelt. Das Studienprotokoll wurde von den institutionellen Ausschuss für Labortierforschung (Zulassung Nr 022-4598-2. 021.211) zugelassen.
1. Vorbereitung für Chirurgie # 1
- Wiegen und betäuben einen 13 Tage alten weißen Neuseeland-Kaninchen mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin-Hydrochlorid 100 mg / ml (100 mg / kg) und Xylazinhydrochlorid 25 mg / ml (12,5 mg / kg). Diese Dosen werden wegen der Länge des chirurgischen Eingriffs verwendet. Assure angemessene Höhe der Anästhesie durch den Mangel an Schmerzreflex.
- Mit einem sterilen Baumwolltupfer, eine kleine Menge von ophthalmischen Salbe auf die nicht-operierten Auge um die Hornhaut zu verhindern, vor dem Austrocknen. Anwenden 0,9% normale Kochsalzlösung fällt auf das operierte Auge Hornhaut während des Betriebs der Cornea zu verhindern das Austrocknen.
- Führen Sie drei axiale Längenmessungen in jedem Auge nach topischer Anästhesie (Oxybuprocaine-Hydrochlorid 0,4%) unter Verwendung eines Ultraschall-A-Scanner und im Durchschnitt dann die Messungen. Tragen Sie die Sonde senkrecht zur zentralen Hornhaut.
2. Chirurgie # 1 - Pre Vernetzung Schritt
- Mit chirurgischen Augen Pinzette und Schere unter einer Augenoperationsmikroskop, machen Sie eine 360 ° konjunktivaler Peritomie mit chirurgischen Augen Pinzette und Schere.
- Mit einem abgewinkelten Zange oder einen Muskel Haken die vier extraocular Rektusmuskeln identifizieren und zu isolieren, um sie mit einem 2-0 geflochtenen Seide nicht genadelt Nähten.
HINWEIS: Die Seidenfäden mit Bewegung der Kugel in die gewünschte Richtung zu helfen. Der Augapfel ist unterteilt in Quadranten zwischen den vier Rektusmuskeln (vier Quadranten).- Mark mit einer Hautmarkierungs zwei Zonen in jedem Quadranten, einer an der äquatorialen Sklera und eine an der posterioren Sklera. Dies sind die Bestrahlungszonen.
- Bereiten Sie eine 3 ml bis 5 ml Spritze mit 0,1% Dextran freien Riboflavin-5-phosphate. Verbinden Sie die Spritze mit einer 26 G Kanüle Tränen- oder 25 G verjüngte hydrodelineator.
- Bereiten Sie die Bestrahlungsvorrichtung, die eine UV-A (370 nm) Lichtquelle auf einen abgeschrägten unten maßgeschneiderte Faseroptik verbunden ist. Im Anschluss an die Messung des Energieleistung und Kalibrierung (siehe Anmerkung unten), stellen Sie das Gerät auf 57 mW / cm².
HINWEIS: Die Kalibrierung wurde vom Hersteller im Handel durchgeführt. Dieses Verfahren stellt eine Gesamt UVA Lichtdosis von 57 J / cm². (57 mW / cm 2 auf 0,2 cm 2 beträgt 11,4 mW / 0,2 cm 2 unter Verwendung von 11,4 mW / 0,2 cm 2 für 200 sec ist eine kumulative Belastung von 2,2 J pro 0,2 cm 2 spot)
3. Chirurgie # 1 - Cross Linking
- Den Augapfel bewegen , indem sie die Seidenfäden in die entgegengesetzte Richtung des gewählten Quadranten ziehen behandelt werden (zB nach oben ziehen und nasal , wenn die unteren temporalen Quadranten der Behandlung). Führen Sie die Augapfelbewegung 2-0 geflochtenen Seide nicht fädelten Nahtmaterials unter Verwendung der isolates jeden Rektusmuskel.
- Anwenden Photosensibilisator Lösung 0,1% Dextran freien Riboflavin-5-phosphat auf die Bestrahlungszone 20 sec vor der Bestrahlung beginnt, enthält.
- Bestrahlen, um die Bestrahlungszone eine abgeschrägte unten nach Maß Faseroptik für eine Bestrahlungszeit von 200 s verwendet wird. Messen der Fläche jeder Zone als 0,2 cm² mit einem Radius von 4 mm.
- Anwenden Photosensibilisator Lösung 0,1% Dextran freien Riboflavin-5-phosphat auf die Bestrahlungszone alle 20 sec während der 200 sec Bestrahlungsperiode enthält.
HINWEIS: Führen Sie die Bestrahlung und den Abwurf von zwei Chirurgen gleichzeitig Riboflavin. - Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,4 für jeden der vier Quadranten Augapfel.
4. Chirurgie # 1 - Post-Cross Verknüpfung Schritt
- Rasieren Sie das Fell rund um das Auge. Schneiden Sie die Lidrändern mit chirurgischen Augen Schere und dann Naht vorsichtig die oberen und die unteren Augenlider mit 4-0 geflochtener Seide Elfenbeinfarbe - 3/8 Kreis reVers Schneide- 13 mm Länge C-3-Nadel (Tarsorrhaphie). Eine kleine Menge von Augensalbe auf dem Lidrand am Ende des Verfahrens (Chloramphenicol 5%).
5. Chirurgie # 1 - Postoperative Pflege
- Halten Sie die Tiere unter einer Wärmelampe während der Wiederherstellung. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat.
- Legen Sie das Tier in einem sauberen Käfig mit neuen Betten, bis es vollständig zurückgewonnen wird. Nach der Wiederherstellung wird das Tier zum Tierraum zurückgeführt werden. Bringen Sie das Tier zu seiner Mutter nur wach, als.
- Während der ersten 48 Stunden, untersucht die Tiere den allgemeinen Zustand und Anzeichen von Krankheit oder Infektionen betreffen. Verwalte Analgesie gemäß Abschnitt 1. administrieren Analgesie nach Bedarf, wenn eine Änderung in dem Kaninchen Verhalten beobachtet wird. (Metamizol Tropfen 50 mg / kg alle 6 h).
6. Chirurgie # 2
- Fünfundfünfzig Tage nach surgery # 1, wiegen und das Kaninchen mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin-Hydrochlorid 100 mg / ml (100 mg / kg) und Xylazinhydrochlorid 25 mg / ml (12,5 mg / kg) anästhesiert.
- Mit chirurgischen Augen Schere unter einer Augenoperationsmikroskop, entfernen Sie die Tarsorrhaphie. Führen Sie drei axiale Längenmessungen an jedem Auge nach topischer Anästhesie (Oxybuprocainhydrochlorid 0,4%) unter Verwendung eines Ultraschall-A-Scanner und im Durchschnitt dann die Messungen. Tragen Sie die Sonde senkrecht zur zentralen Hornhaut.
- Euthanize die Kaninchen mit intraperitoneal Phenobarbital-Natrium (200 mg / 1,5 kg Körpergewicht).
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Representative Results
Figuren 1 und 2 graphisch die axiale Längenmessungen von zwei Gruppen zu demonstrieren. Gruppe 1 Kaninchen unterzog skleralen Vernetzungs- und Tarsorrhaphie auf das rechte Auge , während das linke Auge nicht auf (Abbildung 1) betrieben wurde. Gruppe 2 Kaninchen unterzog sich nur Peritomie und Tarsorrhaphie auf dem rechten Auge , während das linke Auge nicht auf (Abbildung 2) betrieben wurde.
In der Gruppe 1, die scleral Vernetzung und Tarsorrhaphie unterzog gemessene mittlere axiale Länge im rechten Auge 10,68 ± 0,74 mm vor Augenlid Naht und 14.29 ± 0,3 mm 55 Tage später für eine mittlere Differenz von 3,61 ± 0,76 mm. Entsprechende Werte in den nicht operierten / unsutured linke Auge waren 10.70 ± 0,79 mm und 15,14 ± 0,32 mm, bei einer mittleren Differenz von 4,44 ± 0,81 mm (Abbildung 1). Vergleich der axialen Längen der vernähtund unsutured Augen am Ende der Okklusion Phase ergab eine geringere Nettoanstieg in dem genähten Augen.
In der Gruppe 2, die nur Peritomie und tarsorrhaphies unterzog, mittlere axiale Länge im rechten Auge gemessen 10.50 ± 0,67 mm vor Augenlid Naht und 15,69 ± 0,39 mm 55 Tage später für eine mittlere Differenz von 5,19 ± 0,85 mm. Entsprechende Werte in den nicht operierten / unsutured linke Auge waren 10,54 ± 0,71 mm und 14,74 ± 0,38 mm, für eine mittlere Differenz von 4,20 ± 0,67 mm (Abbildung 2). Vergleich der axialen Längen der vernäht und unsutured Augen am Ende der Okklusion Phase ergab eine größere Nettoanstieg in dem genähten Augen.
Vergleich der mittleren Änderung der axialen Länge der rechten Augen zwischen Gruppe 2 (5,19 ± 0,85 mm) und der Gruppe 1 (3,61 ± 0,76 mm) ergab einen deutlich niedrigeren Wert am Ende der Okklusion phase (55 Tage) in den Augen, die das Vernetzungsverfahren (p <0,001, Mann-Whitney nicht-parametrischen Test) unterzogen. Der Unterschied zwischen den Gruppen in der mittleren axialen Länge in das linke Auge (4,20 ± 0,67 mm vs. 4,44 ± 0,81 mm) war statistisch nicht signifikant (p = 0,39, Mann-Whitney nicht-parametrischer Test).
Abbildung 1. Rechtes Auge axiale Messungen vor und nach scleral Vernetzung und Tarsorrhaphie gegen das linke Auge axiale Messungen. Die mittlere axiale Länge des rechten Auges vor scleral Vernetzung und Tarsorrhaphie (RE - Start) und nach dem Entfernen der Tarsorrhaphie 55 Tage später (RE Ende). Die mittlere axiale Länge des linken Auges zu Beginn der Studie (LE starten) und 55 Tage später (LE Ende). Das linke Auge wurde nicht operiert und wurde offen gelassen. Die Fehlerbalken zeigt an Standardfehler des Mittelwerts. (Neu gedruckt mit Permission von Referenz 27). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Rechtes Auge axiale Messungen vor und nach Tarsorrhaphie vs. linken Auge axiale Messungen. Die mittlere axiale Länge des rechten Auges vor Tarsorrhaphie (RE - Start) und nach dem Entfernen der Tarsorrhaphie 55 Tage später (RE Ende). Die mittlere axiale Länge des linken Auges zu Beginn der Studie (LE starten) und 55 Tage später (LE Ende) .Der linke Auge wurde nicht operiert und wurde offen gelassen. Die Fehlerbalken zeigt an Standardfehler des Mittelwerts. (Neu gedruckt mit Genehmigung aus Lit. 27). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir stellen die ersten in vivo Untersuchung der Verhinderung von axialen Myopie in einem Kaninchenmodell verwendet Vernetzungstechnik mit Riboflavin und UVA - Bestrahlung. Obwohl verschiedene Versuchstiere in dieser Art von Studie verwendet werden kann, wählten wir Kaninchen vor allem aufgrund der Größe der Augen und der Notwendigkeit Vernetzung auf der Skleraoberfläche auszuführen.
Wir fanden, dass das Kaninchen Lederhaut Belichtungs- und Vernähen der oberen und unteren Augenlider Maßnahmen anzuwenden sein. Wir empfehlen, die Lidrändern Trimmen und unter Verwendung der in unserem Protokoll genannten Nähte, um sicherzustellen, dass die Augenlider für Korrekturen für den angegebenen Zeitraum ohne Notwendigkeit fest geschlossen sind.
Eine wichtige Sache zu prüfen, ist die Notwendigkeit, die Bestrahlungseinrichtung und die Faseroptik für die erforderliche Energie und Leistung zu kalibrieren.
H & E zeigte, histologischen Schnitten keine toxischen Veränderungen an der Netzhaut auf die Augen, die das Vernetzungsverfahren unterzog. Weitere Untersuchungen sollten die potentielle Toxizität von Riboflavin und UVA-Bestrahlung auf der Netzhaut, Aderhaut und der Lederhaut, mit einem Fokus auf Position, Menge an Energie und Belichtungszeit zu adressieren durchgeführt werden.
Mehrere Einschränkungen dieser Studie Warrant Betracht. Nur prä- und postoperativen axialen Längen wurden gemessen. Die axiale Länge des Augapfels wurde durch eine Ultraschall-Scan gemessen. Wir nicht beurteilen biometrischen Eigenschaften, Brechungsanalyse oder biomechanischen Eigenschaften der Sklera.
Insgesamt glauben wir, dass die Wirkung von scleral Vernetzung mit Riboflavin und UVA auf der axialen Verlängerung des Kaninchenauge einen positiven Einfluss auf Kurzsichtigkeit Forschung haben wird.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren sind dankbar, dass Frau Dalia Sela und Herr Emi Sharon für ihre professionelle und ausgezeichnete technische Arbeit im Labor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 braided silk non-needled sutures | ETHICON | W193 | |
| 4-0 braided silk ivory color | ETHICON | W816 | |
| 0.1% dextran-free riboflavin-5-phosphate 1 mg:1 ml | Concept for Pharmacy Ltd | D2-5025 | |
| UV A (370 nm) light source | O/E LAND Inc | NCSU033B | |
| Beveled down custom made fiber optic | Prizmatix Ltd | ||
| 26 G lacrimal cannula | Beaver-visitec International Ltd. | REF581276 | |
| 25 G tapered hydrodelineator [Blumenthal] | Beaver-visitec International Ltd. | REF585107 | |
| 13 days old rabbits | Harlan | 1NZWR40 | |
| Ultrasonic biometer | Allergan-Humphrey | 820-519 | |
| Skin marker | Devon | 4237101664X |
References
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