Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

في المختبر جيل من الخلايا الجذعية من الفئران بلازماوية الشكل المشتركة اللمفاوية الأسلاف باستخدام نظام تغذية AC-6

doi: 10.3791/53211 Published: November 23, 2015

Abstract

الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل (pDCs) هي نوع قوي I إنترفيرون (IFN-I) المنتجة للخلايا التي يتم تفعيلها في الاستجابة للعدوى أو أثناء الاستجابات الالتهابية. للأسف، إن ما يعرقل دراسة وظيفة PDC بواسطة التردد المنخفض في الأجهزة اللمفاوية، والأساليب القائمة لفي المختبر الجيل DC يفضلون في الغالب إنتاج جان تنمية المجتمعات المحلية على pDCs. هنا نقدم نهجا فريدا لتوليد بكفاءة pDCs من الأسلاف اللمفاوية المشتركة (CLPs) في المختبر. على وجه التحديد، وصفت البروتوكول تفاصيل كيفية تنقية CLPs من نخاع العظام وتوليد pDCs التي كتبها coculturing مع AC-6 الخلايا المغذية-المشع γ في وجود Flt3 يجند. ومن الخصائص الفريدة لهذا النظام الثقافة هي أن CLPs تهاجر تحت الخلايا AC-6 وتصبح الخلايا المكونة للمنطقة حصوه، خطوة حاسمة لتوسيع pDCs. تم إنشاء البلدان النامية متميزة شكليا، وهي pDCs وجان تنمية المجتمعات المحلية، وبعد ما يقرب من 2 أسابيع مع تكوين 70-90٪ pDCs تحت الظروف المثلى. عادة، وعدد من pDCs التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب هو ما يقرب من 100 أضعاف عدد CLPs المصنفة. لذلك، هذا هو نظام الرواية التي لتوليد بقوة الأعداد الكبيرة من pDCs اللازمة لتسهيل إجراء المزيد من الدراسات في تطوير وظيفة هذه الخلايا.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الخلايا الجذعية (DCS) هي خلايا العارضة للمستضد المهنية التي تلعب دورا هاما في السيطرة على الاستجابات المناعية 1. بينما البلدان النامية غير متجانسة، فإنها يمكن تصنيفها إلى قسمين السكان، البلدان النامية التقليدي (جان تنمية المجتمعات المحلية) والبلدان النامية بلازماوية الشكل (pDCs) 2،3. بالإضافة إلى الأجهزة اللمفاوية، تم العثور جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs أيضا في الأنسجة بما في ذلك الرئة والأمعاء، والجلد 2. مورفولوجية جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs يختلف، مع جان تنمية المجتمعات المحلية واظهار التوقعات تشبه التغصنات وشكل pDCs يجري مثل خلية المزيد من البلازما. بالإضافة إلى ذلك، الماوس المشترك DC علامة، CD11c و، وأعرب أكثر إلى حد كبير على جان تنمية المجتمعات المحلية من على pDCs. وعلاوة على ذلك، جان تنمية المجتمعات المحلية ويمكن تقسيمها الى مزيد من CD11b + CD24 - جان تنمية المجتمعات المحلية وCD11b - CD24 + جان تنمية المجتمعات المحلية، وكلاهما تعبير عن مستويات أعلى من الدرجة MHC II والجزيئات costimulatory من القيام pDCs 2. pDCs ناضجة، من ناحية أخرى، وقد ثبت للتعبير بشكل انتقائي Siglec-H وBST2 4. Functionally، جان تنمية المجتمعات المحلية والمستضد أفضل عرض الخلايا من هم pDCs. ومع ذلك، يمكن pDCs تنتج كمية هائلة من النوع الأول إنترفيرون على عدوى فيروس أو التحفيز التهابات 5.

كلا جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs وقصيرة الأمد، وبالتالي، يجب أن تتجدد باستمرار من الأسلاف في نخاع العظم (BM) 6،7. نقل بالتبني من الأسلاف المشتركة الدم النخاعي (CMPS) والأسلاف اللمفاوية المشتركة (CLPs) في الفئران قاتل المشع يوضح أن جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs يمكن أن تتولد من كل الأنساب 10/08. ومع ذلك، هناك مجموعة فرعية من pDCs التي تعبر عن RAG1 / 2 وتمتلك قطاعات DJ ترتيبها في موضع IGH 11،12. كما شارك هذه الخلايا الجزيئية التشابه مع الخلايا الليمفاوية B، بما في ذلك التعبير عن علامة B220، الاستشعار الحمض النووي مستقبلات (TLR7 / TLR9)، وعوامل النسخ (Spib وBcl11a) 13، ويضم كل يعتقد أن التوقيعات على النسب اللمفاوية. ولذلك، CLPالصورة قد تكون خيارات جيدة للجيل في المختبر من pDCs بسبب النسب التشابه.

في حين أن تردد كل من جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs في البشر والفئران منخفض جدا البلدان النامية، ولا سيما جان تنمية المجتمعات المحلية، يمكن أن تتولد في المختبر من BM أو الأسلاف في حضور السيتوكينات، مثل GM-CSF 11،14 أو Flt3 يجند (FL ) باستخدام أنظمة خالية المغذية 11،15،16. لسوء الحظ، ومع ذلك، فإنه ليس من الممكن لإنتاج أعداد كبيرة من pDCs في المختبر باستخدام FL 11،15،16. سابقا أثبتنا أن pDCs يمكن أن تتولد بكفاءة في المختبر من CLPs باستخدام نظام AC-6 التغذية 17. وميزة استخدام خط الخلية انسجة AC-6 في نظام الثقافة هو أنه يوفر اتصال خلية خلية وإفراز السيتوكينات التي تدعم توليد أعداد كبيرة من pDCs من CLPs. على الرغم من أن الإنتاج مع هذا النظام قوي جدا، والنسخ دقيق للإجراءات المبينة أدناه مطلوب طالدرجة n لضمان جيل كفاءة pDCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم شراؤها C57BL / 6 الفئران البرية من نوع من المركز الوطني للمختبر الحيوان (NLAC)، تايوان. كانت ولدت كل الفئران وأبقى في ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة. تم استعراض البروتوكولات والإجراءات استخدام الحيواني والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من كلية جامعة تايوان الوطنية في الطب (رخصة رقم: 20120075). بالإضافة إلى ذلك، قدم الباحثون كل جهد ممكن لتقليل احتمال الألم والمعاناة، أو ضيق في الحيوانات أثناء أداء التجارب. نفذت جميع الإجراءات الموضحة بها في RT بينما يرتدي قفازات.

1. إعداد AC-6 خلايا الطاعم

ملاحظة: AC-6.21 (AC-6 في القصير) خط خلية انسجة 18 (التي قدمها أولا ويسمان، جامعة ستانفورد) ينبغي الحفاظ في RPMI تستكمل مع 15٪ مصل بقري جنيني للحرارة المعطل (FBS). لتكون بمثابة الخلايا المغذية، AC-6 الخلايا جاما المشع مع 3000 راد (30Gy) قبل الثقافة المشتركة لمنع انتشارها يوم واحد. ملاحظة عشرفي AC-6 خلايا تميل الى فقدان القدرة على دعم التمايز في حال ترك مكتظة أثناء الصيانة، أو إذا كان عدد مرورهم أكثر من 20.

  1. غسل AC-6 خلايا مرة واحدة مع 1 مل Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) وإزالة DPBS بواسطة الطموح. علاج AC-6 خلايا مع 0.8 مل من محلول التربسين (0.05٪ التربسين و 0.5 ملي EDTA في DPBS) لمدة 3-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 ثم وقف رد فعل عن طريق تمييع مع 10 مجلدات من مستنبت ل جعل تعليق خلية واحدة.
  2. البذور AC-6 خلايا في 5.9x10 4 خلايا / جيد في لوحات 12-جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 O / N.
    ملاحظة: إن كثافة AC-6 خلايا مهمة للغاية حيث كثافة أقل نرجح الجيل CDC. البذر في كثافة 5.9x10 4 خلايا / جيد سيسمح AC-6 للوصول إلى confluency في اليوم التالي، والذي هو الأمثل لاشتقاق pDCs من CLPs.
  3. أشرق AC-6 خلايا في 3000 راد (30 غراي) باستخدام جاما-irradiator.
    ملاحظة: تم تحسين الجرعات المستخدمة لأشرق AC-6 لمنع الخلايا من التكاثر وبعد الاحتفاظ بها قابلة للحياة طويلة بما يكفي لتوفير السيتوكينات وخلية خلية الاتصال اللازمة لتمايز البلدان النامية من CLPs.
  4. نضح المتوسطة واستبدالها مع 1 مل كامل RPMI (RPMI مع الحرارة المعطل 10٪ FBS، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين و 50 ميكرومتر β المركابتويثانول).

2. عزل خلايا من الفئران BM

  1. التضحية الفئران عن طريق CO 2 الخنق وخلع عنق الرحم. وضع الفئران في علبة تشريح وتعقيم مع الايثانول 70٪. إجراء شق في منتصف البطن وإزالة الجلد من الجزء الأعلى من الفأرة بما في ذلك الجلد المغطي للالسفلية.
  2. تشريح الفئران في غطاء شبه عقيمة. الإفراج عن عظم الفخذ والظنبوب، مقطع عظم الفخذ والظنبوب فوق تحت مفصل الركبة. فصل العضلات من العظام باستخدام مقص ووضع العظام في طبق بتري 6 سم تحتوي على 5 مل إكمال RPMI.
  3. الانتقال إلى غطاء الثقافة العقيمة. ملء حقنة 3 مل متصلة إبرة 27G مع كامل RPMI. قطع طرفي العظام باستخدام مقص، وادخال الإبرة 27G لطرد نخاع من العظام عن طريق حقن بلطف كاملة RPMI مرة واحدة من كل طرف.
  4. إعداد تعليق خلية واحدة من قبل pipetting لطيف الخلايا صعودا وهبوطا 3-5 مرات في صحن الثقافة باستخدام حقنة من دون إبرة.
  5. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 500 x ج وصب طاف.
  6. ليز خلايا الدم الحمراء مع 1 مل ACK العازلة (150 ملي NH 4 الكلورين، 10 ملي KHCO 0.1 ملي EDTA) حضانة لمدة 1 دقيقة، ووقف رد فعل عن طريق تمييع مع 10 مجلدات كاملة من RPMI. تسمح للخلايا للوقوف لمدة 5 دقائق لبيليه أسفل كتل الخلايا الميتة والبقايا الأنسجة عن طريق الجاذبية.
    ملاحظة: لا تقف أكثر من 5 دقائق لأن ذلك سيؤدي إلى فقدان الخلايا بسبب تسوية من خلايا قابلة للحياة.
  7. صب ببطء طاف التي تحتوي على خلية إلى حطام جديد أنبوب مغادرةوراء في الأنبوب الأصلي.
  8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ج لخلايا بيليه، ثم إزالة والتخلص من طاف.
  9. و resuspend مجموع الخلايا BM (عادة يتم الحصول على 4-6 × 10 7 BM الخلايا من الماوس واحد) في 100 ميكرولتر FACS العازلة (1X PBS + 2٪ FBS + 1MM EDTA).

3. FACS تحليل وفرز من CLPs

  1. إضافة معاداة CD16 / 32 (هجين supernant استنساخ 2.4G2، 50 ميكرولتر / رد فعل أو 1-2 ميكروغرام / رد فعل) إلى خلايا في المخزن FACS (الخطوة 2.9) لمدة 1-2 دقيقة من أجل منع مستقبلات لكرة القدم.
    ملاحظة: مكافحة CD16 / 32 وتسمى أيضا كتلة التيسير، الذي يضاف لمنع غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة لمستقبلات الخلايا معربا عن التيسير بما في ذلك المحببة، وحيدات، والخلايا الليمفاوية B.
  2. وصمة عار في وقت واحد الخلايا مع الأجسام المضادة بعد الفلورسنت المسمى صبغ (ل4x10 7 الخلايا) لمدة 15 دقيقة على الجليد، وتجنب الإضاءة المحيطة. الأجسام المضادة: علامات النسب PE-مترافق (0.2 ميكروغرام لكل منهما) بما في ذلك مكافحة CD3 (17A2)، ومكافحة CD8 (53 حتي 6،7)، ومكافحة B220 (RA3-6B2)، ومكافحة CD19 (eBio1D3)، ومكافحة CD11b (M1 / 70)، ومكافحة GR-1 (RB6-8C5)، ومكافحة Thy1.1 (HIS51)، ومكافحة NK1.1 (PK136)، ومكافحة TER119 (TER-119)، ومكافحة MHC-II (نمر-4)، 0.2 ميكروغرام المضادة للج-كيت-PerCP-Cy5.5 (2B8)، 1 ميكروغرام المضادة للهيئة السلع التموينية-1-FITC (D7) و 0.4 ميكروغرام المضادة للM-CSFR-APC (AFS98)، و 0.2 ميكروغرام المضادة للIL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
  3. غسل الخلايا مع 3 مل FACS العازلة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 ز س.
  4. resuspend الخلايا في 300 FACS ميكرولتر العازلة والخلايا مرشح من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر.
  5. غسل أنبوب مع إضافي 100 ميكرولتر FACS العازلة لاسترداد أي الخلايا المتبقية وتصفية إلى FACS معقمة الفرز أنبوب باستخدام نفس مصفاة الخلية.
  6. لتحليل تدفق cytometric مباشرة بعد تلطيخ باستخدام مرشحات والفولتية المناسبة للكشف عن إشارة. استخدام 488 نانومتر ليزر للكشف عن الأجسام المضادة FITC-، PerCP-Cy5.5 المسمى، 561 نانومتر ليزر للكشف عن الأجسام المضادة PE- وPE-Cy7 labelded-و 633 نانومتر لاسإيه للكشف عن الأجسام المضادة APC المسمى.
  7. فرز CLPs وفقا للعلامات التالية لين - ج طقم الباحث هيئة السلع التموينية، 1 الباحث M-CSFR - IL-7Rα + (كما الملون في الخطوة 3.2) باستخدام فارز الخلية. جمع الخلايا مرتبة في أنبوب 15 مل تحتوي على 8 مل من RPMI بمثابة وسادة.
  8. تسجيل العدد المطلق للخلايا مرتبة كما هو موضح من قبل فارز الخلية في نهاية المدى. عادة، يمكن الحصول على 5X10 4 CLPs من BM من الماوس واحد.

4. Coculture CLPs وAC-6

  1. الطرد المركزي الخلايا مرتبة من الخطوة 3.7 لمدة 10 دقيقة في 500 x ج، وإزالة طاف و resuspend بيليه الخلية مع ما يكفي من كامل RPMI للحصول على كثافة الخلايا في جميع أنحاء 5X10 4 خلية / مل. البذور 500 خلية / جيدا في لوحة ال 12 أيضا التي تحتوي على الخلايا المغذية التي أعدت في الخطوة 1.4.
  2. إضافة 100 نانوغرام / مل FL 19 (HU-Flt3L مكتب المفتش العام ولدت في المنزل باستخدام نظام التعبير التي تقدمها M. مانز، Universiمستشفى تاي زيورخ، سويسرا)، واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 مع رصد بصرية الدوري DC تنمية تحت المجهر.
    ملاحظة: المتاحة تجاريا FL البشري المؤتلف أو الماوس FL يمكن استخدامها كبديل للHU-Flt3L مكتب المفتش العام لدعم DC التنمية.
  3. جمع الخلايا في طاف في اليوم 12، ويغسل الآبار مرة واحدة مع 0.5 مل إكمال RPMI المتوسطة الجمع بين supernatants الناتجة عن ذلك. إضافة 0.5 مل متوسطة جديدة والغاء الخلايا الملتصقة مع مكشطة الخلية.
  4. الجمع بين المتوسطة التي تحتوي على خلية من كل أجزاء وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 ز س.
  5. الخلايا طاف و resuspend صب في 50 ميكرولتر FACS العازلة. إضافة 50 ميكرولتر مكافحة CD16 / 32 هجين طاف واحتضان لمدة 1-2 دقيقة لمنع مستقبلات لكرة القدم.
  6. تعداد وصمة عار جميع الخلايا مع الأجسام المضادة التالية (0.05 ميكروغرام لكل منهما) لمكافحة CD11c و-APC (N418)، ومكافحة CD11b-FITC، ومكافحة B220-PE.
  7. غسل وأجهزة الطرد المركزي الخلايا كما وصفد في الخطوة 3.3.
  8. resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر FACS العازلة، البوابة على CD11c و+ وتحليل لجان تنمية المجتمعات المحلية (CD11c و+ CD11b + B220 -) وpDCs (CD11c و+ CD11b - B220 +) 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وعادة ما يتم عزل ما مجموعه 4-6x10 7 خلايا BM من عظام الفخذ والظنبوب واحدة 6-8 أسبوع عمره، من النوع البري C57BL / 6 الماوس. لفرز CLPs، هي ملطخة مجموع الخلايا BM مع الأجسام المضادة PE مترافق ضد علامات النسب (CD3، CD8، B220، CD19، CD11b، GR-1، Thy1.1، NK1.1، TER119، وMHC-II)، ومكافحة -c-كيت-PerCP / Cy5.5، ومكافحة هيئة السلع التموينية-1-FITC، ومكافحة M-CSFR-APC ومكافحة IL-7Rα-PE / Cy7 وتحليلها وفرزها مع فارز الخلية. يظهر استراتيجية الفرز لCLP في الشكل 1. وعادة ما يتم الحصول 5X10 4 CLPs من C57BL واحد / 6 الماوس. للحصول على مزيد CLPs، خلايا BM 3-4 الفئران قد تكون مجتمعة وبروتوكول تبعا لذلك قبل الفرز.

بعد coculture من 500 CLPs مع 5.9x10 6 AC-6 الخلايا المغذية، الخلايا المكونة للمنطقة الحصوه (CAFC) تبدأ في الظهور بعد يوم 3-4. يوم 8، ويبدو pDCs جولة على شكل وتعليق على رأس CAFC (الشكل 2A). عدد pDCs قمم حول دعبد المنعم يوسف 14/12 الذي pDCs نقطة البدء في الخضوع لموت الخلايا المبرمج التالية نموهم الكامل، وتبدأ الأرقام أن ينخفض ​​تدريجيا. تظهر المستعمرات مركز السيطرة على الأمراض في وقت لاحق من المستعمرات PDC، في يوم 08/06، ومورفولوجية جان تنمية المجتمعات المحلية تكون أكبر، مثل مغزل، وتمسكا (الشكل 2B).

عادة، يمكن أن تتولد 5-6x10 4 خلايا من 500 CLPs بعد 2 أسابيع من coculture. بعد تلطيخ الخلايا مع مكافحة CD11c و-APC، ومكافحة CD11b-FITC ومكافحة B220-PE، تحليل التدفق يظهر الخلوي أن نسبة pDCs (CD11c و+ CD11b - B220 +) وجان تنمية المجتمعات المحلية (CD11c و+ CD11b + B220 - ) هو 91٪ و 6٪ على التوالي (الشكل 3). لذلك، مع هذا الأسلوب pDCs يمكن توسيعها بقدر 100 أضعاف.

الشكل 1
الشكل 1. استراتيجيات المحاصرة لCLPs. الخلايا BM ايزوذا الصلة من الماوس واحدة كانت ملطخة مع الأجسام المضادة fluorescently المسمى وتحليلها لCLPs، والتي كانت تعرف بأنها لين - ج كيت الباحث هيئة السلع التموينية، 1 الباحث M-CSFR - IL-7Rα + الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .

الرقم 2
تم cocultured الشكل 2. مورفولوجيا من مركز السيطرة على الأمراض وPDC المستعمرات في CLP-AC-6 cocultures 500 CLPs مع AC-6 الخلايا المغذية-المشع γ في ظل وجود 100 نانوغرام / مل FL. (A) مستعمرات PDC في يوم 8، 10 ، و 12، و (B) مستعمرات مركز السيطرة على الأمراض في يوم 8، 12، وصورت 16 تحت المجهر الضوئي في 200 × (شريط نطاق 50 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض تأنسخة إيه من هذا الرقم.

الشكل (3)
تم cocultured الشكل 3. تحليل تدفق cytometric من pDCs CLP المشتقة وجان تنمية المجتمعات المحلية. خمسمائة CLPs وAC-6 الخلايا المغذية-المشع γ (5.9x10 4 / مل) في المختبر لمدة 12 يوما في وجود FL (100 نانوغرام / مل ). كانت ملطخة الخلايا مع مكافحة CD11c و-APC، ومكافحة CD11b-FITC، ومكافحة B220-PE وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. تم بوابات الخلايا أولا على CD11c و+ ومن ثم تحليلها لجان تنمية المجتمعات المحلية (CD11c و+ CD11b + B220 -) وpDCs (CD11c و+ CD11b - B220 +). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نحن هنا وصف في المختبر نظام الثقافة للجيل قوي من البلدان النامية، وpDCs على وجه الخصوص، من عدد صغير من CLPs. ويرجع ذلك إلى استخدام AC-6 خلايا، خط خلية اللحمية، كما مغذيات تفرد هذا النظام الثقافة. وقد تبين هذا النهج لتوفير ليس فقط السيتوكينات، مثل IL-7، SCF، M-CSF وFL 20، ولكن أيضا الاتصال خلية خلية 21 الضروري لدعم DC التنمية. وقد استخدمت AC-6 خلايا سابقا لتسهيل دراسة في المختبر DC التنمية من عدة الأسلاف 8،16،22. وجدنا أنه من الأهمية بمكان أن البذور كثافة المثلى للخلايا AC-6 المغذية لدعم التمايز كفاءة pDCs من CLPs. على وجه التحديد، بذر 5.9x10 4-المشع γ AC-6 خلايا في 12-جيدا لوحات النتائج في confluency في اليوم التالي، الذي هو مناسبة لتطوير الحزب الديمقراطي المسيحي. A أقل كثافة الخلية AC-6 (3.9x10 4 / بشكل جيد في لوحة ال 12 أيضا) يميل إلى دعم مركز السيطرة على الأمراض التنر 24. ولذلك، فمن المستحسن لأول بذرة عدة تركيزات AC-6 خلايا من أجل تحسين الظروف عندما التوسع في نظام الثقافة 23. وعلاوة على ذلك، فمن المهم أيضا أن الخلايا AC-6 الإبقاء بدقة، بما في ذلك الاهتمام الدقيق لعدد مرور، وعدم السماح للوصول إلى confluency. إذا تركت مكتظة أو إذا كان رقم مرورهم أكبر من 20، وهذه الخلايا تميل الى فقدان القدرة على دعم تكون الدم في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، فإن تركيز FL يؤثر أيضا DC التنمية. على وجه التحديد، في الجرعات المنخفضة يتم تطويرها (25-50 نانوغرام / مل) جان تنمية المجتمعات المحلية تفضيلي، في حين عند تناول جرعات عالية (100-200 نانوغرام / مل) pDCs يتم إنشاؤها في الغالب 24. بالإضافة إلى AC-6 كثافة الخلايا وFL الجرعة، واختيار دقيق لمجموعة من FBS التي تدعم كفاءة DC التنمية في هذا النظام الثقافة أمر أساسي لنجاح العملية.

بينما في المختبر جان تنمية المجتمعات المحلية -derived وpDCs يمكن أن يكون ديسtinguished بواسطة علامات سطحها، وهي CD11c و+ CD11b + B220 - وCD11c و+ CD11b - B220 + على التوالي، الأشكال التضاريسية هم أيضا تمييز بواسطة المجهر. جان تنمية المجتمعات المحلية هي أكبر، المغزل على شكل وتكون ملتصقة، في حين pDCs هي أصغر، جولة على شكل وتنمو في تعليق (الشكل 2). حركية DC التمايز يختلف أيضا، مع pDCs الظهور في وقت سابق وفي وقت لاحق جان تنمية المجتمعات المحلية. بالإضافة إلى ذلك، يتأثر عملية التنمية PDC بشكل كبير من قبل AC-6 كثافة الخلية مع ارتفاع AC-6 كثافة تسريع العملية التنموية. وتجدر الإشارة إلى أن pDCs بدء للموت بعد تنمية كاملة وبالتالي، فإن نسبة جان تنمية المجتمعات المحلية مقابل pDCs في هذا النظام الثقافة يزيد تدريجيا في نقطة زمنية لاحقة. لذا، يوصى الرصد الدوري لDC التنمية من خلال الفحص المجهري والتدفق الخلوي للغاية من أجل تحديد متى تبدأ pDCs على الخضوع لموت الخلايا المبرمج.

من المذكرة، وdescribويمكن أيضا طريقة إد تطبيقها على الأسلاف DC أخرى، مثل قياس وحيدة. ومع ذلك، فإن عدد سكان العاصمة الرئيسي المتولدة من هذه الخلايا هي جان تنمية المجتمعات المحلية 17، حتى في عالية AC-6 الكثافة أو جرعات FL. إمكانية PDC منخفضة من قياس وحيدة تتفق مع التقارير الواردة من مجموعات مختلفة باستخدام CDP-تغذية 11 أو 16 النظم، اثنين من مختلف أنظمة الثقافة في المختبر خالية من وحدة التغذية. وتشير هذه النتائج إلى أن نظام التغذية AC-6 يمكن أن تعكس بأمانة إمكانية التفريق بين الأسلاف مختلفة.

قبل PDCs المتولدة من هذا النظام الثقافة هي CD11c و+ CD11b - B220 +. وعلاوة على ذلك، فإنها تعبر عن مستويات عالية نسبيا من Tcf4 (بترميز E2-2) وRag1، الجينين PDC محددة، ولكن مستويات أقل من ID2، جين CDC محددة، من القيام جان تنمية المجتمعات المحلية 17. على الرغم من هذه pDCs تفتقر Siglec-H وBST2، علامات تعتبر سمة من pDCs الفئران، فإنها لا تزال قادرة على إنتاج مستويات أعلى من IFN-I منالقيام جان تنمية المجتمعات المحلية وupregulate CD86 عند المصابين بفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV) 24. وهذا يشير إلى أن هذه pDCs، على الرغم من أن يفرق بشكل غير كامل، لا يزال وظيفية. وعلاوة على ذلك، لدينا بالفعل استخدمت بنجاح هذه الطريقة لتحديد دور التآزر من IFN-I وFL في التنمية PDC من CLPs 17، مؤكدا أن هذه التقنية هي قيمة لدراسة DC التنمية.

في الختام، وهنا نقدم بسيطة، ولكنها فعالة، طريقة لتوليد pDCs من عدد صغير من CLPs باستخدام AC-6 المغذية نظام coculture، والتي يمكن أن تسهل الدراسات التنموية أو وظيفية من pDCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ونحن ممتنون لالدكاترة. ماركوس مانز وايرفينغ ويسمان لتوفير الكواشف. نحن نعترف أيضا الخدمات التي يقدمها تدفق Cytometric تحليل والخلية مرفق الفرز الأساسية من الأول ومختبر الأساسية الثانية في كلية جامعة تايوان الوطنية مستشفى الطب وجامعة تايوان الوطنية، على التوالي. وأيد هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) والمعاهد الوطنية للبحوث الصحية، تايوان (المؤسسة الوطنية-EX102-10256SI وطنية لحقوق الإنسان-EX103-10256SI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10, (8), e0135217 (2015).
<em>في المختبر</em> جيل من الخلايا الجذعية من الفئران بلازماوية الشكل المشتركة اللمفاوية الأسلاف باستخدام نظام تغذية AC-6
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).More

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter