Abstract
Cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) sono di tipo potente che interferone (IFN-I) che producono cellule che si attivano in risposta a infezioni o durante le risposte infiammatorie. Purtroppo, studio della funzione pDC è ostacolato dalla loro bassa frequenza in organi linfoidi, e metodi esistenti per la generazione vitro DC prevalentemente favoriscono la produzione di CDC sopra pDC. Qui vi presentiamo un approccio unico per generare efficientemente pDCs da progenitori linfoidi comuni (CLPS) in vitro. In particolare, il protocollo ha descritto i dettagli come purificare CLPS dal midollo osseo e generano pDCs da coculturing con AC-6 cellule di alimentazione gamma-irradiati in presenza di Flt3 ligando. Una caratteristica unica di questo sistema di coltura è che i CLPS migrano sotto le celle AC-6 e diventano cellule territoriali che formano acciottolate, un passaggio fondamentale per l'espansione pDCs. DC morfologicamente distinte, vale a dire PDC e CDC, sono stati generati dopo circa due settimane con una composizione di 70-90% pDCs in condizioni ottimali. Tipicamente, il numero di pDC generati da questo metodo è circa 100 volte del numero di CLPS seminati. Pertanto, questo è un nuovo sistema con cui generare robusto il gran numero di pDC necessarie per agevolare ulteriori studi sviluppo e la funzione di queste cellule.
Introduction
Le cellule dendritiche (DC) sono cellule presentanti l'antigene professionale che svolgono un ruolo importante nel controllo risposte immunitarie 1. Mentre DC sono eterogenei, possono essere classificati in due popolazioni, DC convenzionale (CDC) e cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) 2,3. Oltre agli organi linfoidi, CDC e pDCs si trovano anche in tessuti tra cui polmone, intestino, pelle e 2. La morfologia di CDC e pDCs differenzia, con CDC espositrici proiezioni dendriti-simili e la forma di pDCs essere più plasma alveolare. Inoltre, il marcatore DC comune topo, CD11c, è più altamente espresso su CDCS che su pDC. Inoltre, CDC può essere ulteriormente suddivisa in CD11b + CD24 - CDC e CD11b - CD24 + CDC, entrambi i quali esprimono alti livelli di MHC di classe II e molecole costimolatorie di fare pDCs 2. PDC mature, d'altra parte, hanno mostrato di esprimere selettivamente Siglec-H e BST2 4. Functionally, CDC sono antigene migliori presentano cellule rispetto sono pDCs; tuttavia, pDCs in grado di produrre una grande quantità di interferone di tipo I dopo l'infezione da virus o la stimolazione infiammatoria 5.
Entrambi i CDC e pDCs sono di breve durata, e di conseguenza, devono essere costantemente rifornite da progenitori all'interno del midollo osseo (BM) 6,7. Trasferimento adottivo di progenitori comuni mieloidi (CMP) e progenitori linfoidi comuni (CLPS) in topi irradiati letalmente dimostra che i CDC e pDCs possono essere generati da entrambe le linee 8-10. Tuttavia, vi è un sottoinsieme di pDC che esprimono RAG1 / 2 e possiedono segmenti DJ riarrangiati al locus IgH 11,12. Queste cellule condividono anche analogie molecolari con linfociti B, tra cui l'espressione del marcatore B220, recettori dell'acido nucleico-sensing (TLR7 / TLR9), e fattori di trascrizione (SPIB e BCL11A) 13, dispone di tutto che si ritiene essere le firme del lignaggio linfoide. Pertanto, CLPs possono essere buone scelte per la generazione in vitro di pDCs causa di lignaggio somiglianza.
Mentre la frequenza sia CDC e pDC negli esseri umani e nei topi è molto basso 6, DC, particolarmente CDC, può essere generato in vitro da BM o progenitori in presenza di citochine quali GM-CSF o 11,14 Flt3 ligand (FL ) utilizzando sistemi privi di alimentazione 11,15,16. Purtroppo, però, non è possibile produrre un gran numero di pDC in vitro su FL 11,15,16. In precedenza abbiamo dimostrato che pDCs possono essere efficacemente generati in vitro da CLPS utilizzando il sistema 17 AC-6 alimentatore. Il vantaggio di usare la linea cellulare stromale AC-6 nel sistema di coltura è che fornisce il contatto cellula-cellula e la secrezione di citochine che supportano la generazione di un gran numero di pDC da CLPS. Anche se la produzione con questo sistema è molto robusto, attento replica delle procedure descritte di seguito i è necessariol fine di garantire la generazione efficiente di pDCs.
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Protocol
C57BL / 6 topi wild-type sono stati acquistati dal National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan. Tutti i topi sono stati allevati e tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici. Protocolli e le procedure di utilizzo degli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l'uso degli animali istituzionale della National Taiwan University College of Medicine (Permesso Numero: 20.120.075). Inoltre, i ricercatori fatto ogni sforzo per ridurre il potenziale di dolore, la sofferenza, l'angoscia negli animali durante l'esecuzione di esperimenti. Tutte le procedure descritte sono state effettuate a temperatura ambiente con i guanti.
1. Preparazione di 6-AC cellule feeder
Nota: L'AC-6.21 (AC-6 in breve) linea di cellule stromali 18 (fornito da I. Weissman, della Stanford University) deve essere mantenuta in RPMI integrato con siero fetale bovino inattivato al calore del 15% (FBS). Per servire come cellule di alimentazione, AC-6 celle sono γ-irradiati con 3000 rad (30Gy) un giorno prima della co-coltura per evitare la loro proliferazione. Nota thAC-6 celle tendono a perdere la loro capacità differenziazione sostenere se lasciato sovraffollate durante la manutenzione, o se il loro numero passaggio è superiore a 20.
- Lavare AC-6 celle una volta con 1 ml di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) e rimuovere DPBS per aspirazione. Trattare AC-6 cellule con 0,8 ml di soluzione di tripsina (0,05% tripsina e EDTA 0,5 mM in DPBS) per 3-5 minuti a 37 ° C, 5% CO 2 e quindi arrestare la reazione diluendo con 10 volumi di mezzo di coltura a fare sospensione singola cellula.
- Seme AC-6 celle a 5.9x10 4 cellule / pozzetto in piastre da 12 pozzetti e incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 O / N.
Nota: La densità di AC-6 celle è molto importante in quanto una densità inferiore favorirà generazione CDC. Semina ad una densità di 5.9x10 4 cellule / pozzetto permetteranno AC-6 per raggiungere confluenza entro il giorno successivo, che è ottimale per la derivazione di pDCs da CLPS. - Irradiare AC-6 celle a 3000 rad (30 Gy) con γ-irradiatore.
Nota: La dose utilizzata per irradiare AC-6 è ottimizzato per evitare che le cellule proliferazione e tuttavia mantenerli vitali sufficientemente lungo da assicurare le citochine e contatto cellula-cellula necessari per la differenziazione delle DC da CLPS. - Aspirare media e sostituirlo con 1 ml RPMI completo (RPMI con 10% di calore inattivato FBS, 50 mg / ml di gentamicina e 50 micron β-mercaptoetanolo).
2. Isolare BM cellule da topi
- Sacrifica topi di CO 2 asfissia e dislocazione cervicale. Posizionare i topi su un vassoio dissezione e sterilizzare con il 70% di etanolo. Fare un'incisione a metà addome e rimuovere la pelle dalla parte distale del mouse compresa la pelle che copre le estremità inferiori.
- Sezionare topi in una cappa semi-sterile. Per rilasciare il femore e tibia, femore agganciare sopra e tibie sotto del ginocchio. Staccare i muscoli dalle ossa con le forbici e posto le ossa in una capsula di Petri 6 centimetri contenente 5 ml RPMI completare.
- Spostarsi in una cappa di coltura sterile. Riempire una siringa da 3 ml collegata ad un ago 27G con RPMI completo. Tagliare entrambe le estremità delle ossa con le forbici, e inserire l'ago 27G per irrigare il midollo dalle ossa iniettando delicatamente RPMI completo una volta da ogni estremità.
- Preparare una singola sospensione cellulare delicatamente pipettando le cellule su e giù per 3-5 volte in piatto cultura con la siringa senza ago.
- Centrifugare le cellule per 5 minuti a 500 xg e decantare il surnatante.
- Lisare globuli rossi con 1 ml di tampone di ACK (150 mm NH 4 Cl, 10 KHCO mm 3, 0,1 mM EDTA) incubazione per 1 min e fermare la reazione diluendo con 10 volumi di RPMI completo. Consentono alle cellule riposare per 5 min per pellet giù grumi di cellule morte e detriti di tessuto per gravità.
Nota: non stare in piedi più di 5 min come questo si tradurrà in una perdita di cellule a causa della sedimentazione di cellule vitali. - Lentamente decantare il surnatante cellulare contenente un nuovo tubo lasciando detritidietro nel tubo originale.
- Centrifugare per 5 minuti a 500 xg per far sedimentare le cellule, quindi rimuovere e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule totali BM (tipicamente 4-6 x 10 7 cellule BM sono ottenuti da un topo) in 100 microlitri tampone FACS (PBS 1x + 2% FBS + 1 mM EDTA).
3. FACS Analisi e ordinamento di CLPS
- Aggiungi anti-CD16 / 32 (ibridoma supernant clone 2.4G2, 50 ml / reazione o 1-2 mg / reazione) in cellule in tampone FACS (passo 2.9) per 1-2 minuti, al fine di bloccare i recettori Fc.
Nota: Anti-CD16 / 32 è anche chiamato blocco Fc, che si aggiunge a prevenire legame non specifico degli anticorpi di cellule esprimenti recettori Fc, tra cui i granulociti, monociti e linfociti B. - Contemporaneamente colorare le cellule con i seguenti anticorpi fluorescenti colorante marcati (per 4x10 7 cellule) per 15 min in ghiaccio, evitando luce ambientale. Anticorpi: marcatori lignaggio PE-coniugati (0,2 mcg ciascuna) tra cui anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119), e anti-MHC-II (NIMR-4), 0.2 mg anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 mg anti-Sca-1-FITC (D7), 0.4 mg anti-M-CSFR-APC (AFS98), e 0,2 mg anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
- Lavare le cellule con 3 ml di tampone FACS, e centrifugare per 5 min a 500 x g.
- Risospendere le cellule in 300 microlitri di buffer FACS e celle filtranti attraverso un colino cella di 40 micron.
- Lavare il tubo con un 100 microlitri di buffer FACS aggiuntivo per recuperare tutte le cellule residue e filtrare in un FACS sterile ordinamento tubo con la stessa colino cella.
- Eseguire immediatamente citometria a flusso dopo la colorazione utilizzando filtri e tensioni appropriati per il rilevamento del segnale. Utilizzare 488 nm laser per rilevare gli anticorpi FITC, PerCP-Cy5.5-etichettati, 561 nm laser per rilevare il PE e PE-anticorpi Cy7-labelded e 633 nm laser per rilevare l'anticorpo marcato APC.
- Classificare CLPS secondo i seguenti marcatori lin - c-kit int Sca-1 int M-CSFR - IL-7Rα + (come macchiato al punto 3.2) utilizzando un cell sorter. Raccogliere le cellule ordinati in una provetta da 15 ml contenente 8 ml di RPMI completo come un cuscino.
- Registrare il numero assoluto di cellule ordinati come mostrato dalla cell sorter alla fine della corsa. Tipicamente, 5x10 4 CLPS possono essere ottenuti dal BM di un topo.
4. coculture CLPS e AC-6
- Centrifugare le cellule ordinati dal punto 3.7 per 10 minuti a 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare con abbastanza completo RPMI per ottenere una densità cellulare intorno 5x10 4 cellule / ml. Seed 500 cellule / pozzetto in 12-pozzetti contenenti cellule di alimentazione previste al punto 1.4.
- Aggiungere 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig generato internamente utilizzando un sistema di espressione fornita da M. Manz, University Hospital Zurigo, Svizzera) e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 con controllo visivo periodico di sviluppo DC al microscopio.
Nota: disponibile in commercio FL umana ricombinante o il mouse FL può essere utilizzato come un sostituto per hu-Flt3L-Ig per sostenere lo sviluppo continua. - Raccogliere le cellule nel supernatante a giorno 12 e lavare i pozzetti una volta con 0,5 ml di terreno RPMI completare combinando sovranatanti risultanti. Aggiungere 0,5 ml di mezzo fresco e rottami le cellule aderenti con un raschietto cellulare.
- Combinare il mezzo cellulare contenente da entrambe le parti e centrifugare per 5 min a 500 x g.
- Surnatante e risospendere le cellule decantare in 50 microlitri di buffer FACS. Aggiungere 50 microlitri anti-CD16 / 32 ibridomi surnatante e incubare per 1-2 minuti per bloccare i recettori Fc.
- Enumerare e macchia tutte le celle con i seguenti anticorpi (0,05 mcg ciascuna) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC e anti-B220-PE.
- Lavare e centrifugare le cellule come descrivered al punto 3.3.
- Risospendere le cellule in 100 microlitri di buffer FACS, cancello CD11c + e analizzare per CDC (CD11c + CD11b + B220 -) e pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) 17.
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Representative Results
Un totale di 7 4-6x10 cellule BM sono in genere isolate da femori e tibie di un 6-8 sett-vecchio, wild-type C57BL / 6 del mouse. Per risolvere CLPS, cellule totali BM sono colorate con anticorpi coniugati PE contro marcatori lignaggio (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119, e MHC-II), anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-Cecoslovacchia-APC e anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analizzati e ordinati con un cell sorter. La strategia di ordinamento per CLP è mostrato in Figura 1. Tipicamente, 5x10 4 CLPS sono ottenuti da un C57BL / 6 del mouse. Per ottenere più CLPS, cellule BM da 3-4 topi possono essere combinati e protocollo adeguati di conseguenza prima della cernita.
A seguito della co-coltura di 500 CLPS con 5.9x10 6 AC-6 cellule di alimentazione, le cellule che formano zona di ciottoli (CAFC) iniziano a comparire in giorno 3-4. Di giorno 8, pDCs forma circolare appaiono e sospendere in cima alla CAFC (Figura 2A). Il numero di pDCs picchi intorno day 12-14 in cui pDCs punto di partenza per apoptosi dopo il loro pieno sviluppo, ed i numeri iniziano a diminuire gradualmente. colonie Cdc appaiono entro colonie pDC, al giorno 6-8, e la morfologia del CDC sono più grandi, come mandrino, ed aderente (Figura 2B).
In genere, 5-6x10 4 cellule possono essere generati da 500 CLPS dopo 2 settimane di co-coltura. Dopo la colorazione delle cellule con anticorpi anti-CD11c-APC, anti-CD11b-FITC e anti-B220-PE, analisi di flusso mostra citometria che la percentuale di pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) e CDC (CD11c + CD11b + B220 - ) è 91% e 6%, rispettivamente (Figura 3). Pertanto, con questo metodo pDC possono essere espansi fino a 100 volte.
Figura 1. strategie gating per CLPS. Le cellule BM isolata da un mouse sono stati colorati con gli anticorpi fluorescenza marcata e analizzati per CLPS, che sono stati definiti come lin - c-Kit int Sca-1 int M-Cecoslovacchia -. IL-7Rα + Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .
Figura 2. Morfologia di CDC e pDC colonie in CLP-AC-6 co-colture. 500 CLPS furono co-coltivate con AC-6 cellule di alimentazione gamma-irradiati in presenza di 100 ng / ml FL. (A) colonie PDC giorno 8, 10 , e 12, e (B) colonie Cdc a giorno 8, 12, e 16 sono stati fotografati al microscopio ottico a 200 x (bar scala 50 micron). Cliccate qui per visualizzare un largVersione er di questa figura.
Figura 3. analisi citofluorimetrica di pDCs CLP-derivati e CDC. Cinquecento CLPS e AC-6 cellule di alimentazione gamma-irradiati (5.9x10 4 / ml) sono stati messi in coltura in vitro per 12 giorni in presenza di FL (100 ng / ml ). Le cellule sono state colorate con anti-CD11c-APC, anti-CD11b-FITC e anti-B220-PE e analizzati mediante citometria a flusso. Le cellule sono state prima gated su CD11c + e poi analizzati per CDC (CD11c + CD11b + B220 -) e pDCs (CD11c + CD11b - B220 +). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui si descrive un sistema in vitro in coltura per la robusta generazione di DC, e pDCs in particolare, da un piccolo numero di CLPS. L'unicità di questo sistema di coltura è dovuto all'uso di AC-6 cellule, una linea cellulare stromale, come alimentatori. Questo approccio ha dimostrato di fornire non solo le citochine, come IL-7, SCF, M-CSF e FL 20, ma anche il contatto cellula-cellula 21 necessario per sostenere lo sviluppo DC. AC-6 cellule sono state usate in precedenza per facilitare lo studio di sviluppo vitro in DC da diversi progenitori 8,16,22. Abbiamo scoperto che è fondamentale per seminare una densità ottimale di cellule AC-6 alimentatore per sostenere la differenziazione efficiente di pDCs da CLPS. In particolare, la semina 5.9x10 4 gamma-irradiati AC-6 cellule in 12-pozzetti risultati in confluenza il giorno successivo, che è adatto per lo sviluppo pDC. A AC-6 densità cellulare inferiore (3.9x10 4 / bene in 12-pozzetti) tende a sostenere Cdc SVILUPPOt 24. Pertanto, si raccomanda di primo seme diverse concentrazioni di AC-6 cellule per ottimizzare le condizioni per scalare il sistema di coltura 23. Inoltre, è anche importante che le cellule AC-6 scrupolosamente mantenute, compreso attenzione al numero di passaggio, e mai permesso di raggiungere confluenza. Se lasciato sovraffollati o se il loro numero è maggiore di passaggio 20, queste cellule tendono a perdere la capacità di supportare ematopoiesi in vitro. Inoltre, la concentrazione di FL influisce anche sviluppo DC. In particolare, a basse dosi (25-50 ng / ml) vengono preferenzialmente CDCS sviluppati, mentre ad alte dosi (100-200 ng / ml) pDC sono prevalentemente generati 24. Oltre a AC-6 densità cellulare e FL dosaggio, accurata selezione di un lotto di FBS che supporta efficacemente lo sviluppo DC in questo sistema di coltura è fondamentale per il successo della procedura.
Mentre CDC e pDCs -derived in vitro possono essere disstinto dai loro marcatori di superficie, vale a dire CD11c + CD11b + B220 - e CD11c + CD11b - B220 + rispettivamente, le loro morfologie sono distinguibili al microscopio. CDC sono più grandi, a forma di fuso e sono aderenti, mentre pDC sono più piccole, di forma circolare e crescere in sospensione (Figura 2). La cinetica di differenziazione DC differisce anche, con pDCs apparendo prima e CDC tardi. Inoltre, il processo di sviluppo del PDC è significativamente influenzato da AC-6 densità cellulare con una maggiore densità di AC-6 accelerare il processo di sviluppo. Va notato che pDC iniziano a morire seguente sviluppo completo e pertanto, il rapporto di CDC rispetto pDC in questo sistema di coltura aumenta gradualmente in momenti successivi. Pertanto, il controllo periodico dello sviluppo DC al microscopio e citometria a flusso è altamente raccomandato, al fine di determinare quando pDCs iniziano a subire apoptosi.
Da segnalare la describMetodo ed può essere applicato anche ad altri progenitori DC, come CDP; tuttavia, la principale popolazione continua generata da queste cellule sono CDC 17, anche alle alte AC-6 densità o dosi FL. Il basso potenziale PDC del CDP è coerente con le relazioni di diversi gruppi utilizzando sia CDP-alimentatore 11 o 16 sistemi, due diversi sistemi di coltura in vitro senza alimentatore. Questi risultati suggeriscono che il sistema AC-6 alimentatore può riflettere fedelmente il potenziale di differenziazione di progenitori diversi.
I pDCs generate da questo sistema cultura sono CD11c + CD11b - B220 +. Inoltre, esprimono livelli relativamente alti di TCF4 (codifica E2-2) e Rag1, i geni di due pDC-specifici, ma livelli più bassi di Id2, un gene CDC-specifici, di quanto non facciano CDC 17. Anche se questi mancano pDCs Siglec-H e BST2, marcatori considerati caratteristica pDCs murine, sono ancora in grado di produrre alti livelli di IFN-I chefare CDC e upregulate CD86 quando infettati con il virus della stomatite vescicolare (VSV) 24. Ciò suggerisce che questi pDC, anche se non completamente differenziate, sono ancora funzionanti. Inoltre, abbiamo già utilizzato con successo questo metodo per delineare un ruolo sinergico di IFN-I e FL in sviluppo pDC da CLPS 17, confermando che questa tecnica è utile per lo studio dello sviluppo DC.
In conclusione, qui presentiamo una semplice, ma efficace, metodo per generare pDC da un piccolo numero di CLPS utilizzando il sistema di co-coltura AC-6 alimentatore, che può facilitare gli studi di sviluppo o funzionali di pDC.
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Acknowledgments
Siamo grati a Drs. Markus Manz e Irving Weissman per la fornitura di reagenti. Riconosciamo inoltre il servizio fornito dal citometria a flusso di analisi e cellulare ordinamento Nucleo Struttura del Primo e del Secondo Nucleo Laboratory presso la National Taiwan University College of Medicine e NTU ospedale, rispettivamente. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) e il National Institutes Health Research, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI e NHRI-EX103-10256SI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
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