एसी-6 फीडर सिस्टम का उपयोग आम लिम्फायड progenitors से Murine Plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं की इन विट्रो पीढ़ी में
Summary
In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.
Abstract
Plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं (पीडीसी) मैं संक्रमण के लिए या भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के दौरान जवाब में सक्रिय कर रहे हैं कि (IFN-आई) के उत्पादन की कोशिकाओं इंटरफेरॉन शक्तिशाली प्रकार हैं। दुर्भाग्य से, पीडीसी समारोह के अध्ययन लसीकावत् अंगों में उनके कम आवृत्ति द्वारा रुकावट है, और इन विट्रो डीसी पीढ़ी के लिए मौजूदा तरीकों मुख्य रूप से पीडीसी से अधिक सीडीसी के उत्पादन के पक्ष में। यहाँ हम कुशलतापूर्वक इन विट्रो में आम लसीकावत् पूर्वज (CLPs) से पीडीसी उत्पन्न करने के लिए एक अनूठा तरीका मौजूद है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल अस्थि मज्जा से CLPs शुद्ध और FLT3 ligand की उपस्थिति में γ-किरणित एसी 6 फीडर कोशिकाओं के साथ coculturing द्वारा पीडीसी उत्पन्न करने के लिए कैसे विवरण का वर्णन किया। इस संस्कृति प्रणाली की एक अनूठी विशेषता CLPs एसी 6 कोशिकाओं के नीचे की ओर पलायन और cobblestone क्षेत्र कोशिकाओं के गठन, पीडीसी के विस्तार के लिए एक महत्वपूर्ण कदम हो जाते हैं। आकृति विज्ञान अलग डीसी, अर्थात् पीडीसी और सीडीसी, 7 की एक रचना के साथ के बाद लगभग 2 सप्ताह उत्पन्न किया गयाइष्टतम परिस्थितियों में 0-90% पीडीसी। आमतौर पर, इस विधि द्वारा उत्पन्न पीडीसी की संख्या मोटे तौर पर वरीयता प्राप्त CLPs की संख्या का 100 गुना है। इसलिए, इस मजबूती के साथ इन कोशिकाओं के विकास और समारोह में आगे की पढ़ाई की सुविधा के लिए आवश्यक पीडीसी की बड़ी संख्या को उत्पन्न करने के लिए, जिसके साथ एक उपन्यास प्रणाली है।
Introduction
वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि पेशेवर प्रतिजन कोशिकाओं पेश कर रहे हैं। डीसी विषम हैं, वे मोटे तौर पर दो आबादी में वर्गीकृत किया जा सकता है, पारंपरिक DCS (सीडीसी) और plasmacytoid DCS (पीडीसी) 2,3। लसीकावत् अंगों के अलावा, सीडीसी और पीडीसी भी फेफड़े, आंत, और त्वचा के 2 सहित ऊतकों में पाए जाते हैं। सीडीसी और पीडीसी की आकृति विज्ञान डेन्ड्राइट अनुमानों की तरह और अधिक प्लाज्मा सेल की तरह किया जा रहा है पीडीसी के आकार का प्रदर्शन करते सीडीसी के साथ, अलग है। इसके अलावा, आम माउस डीसी मार्कर, CD11c, अधिक उच्च पीडीसी पर की तुलना में सीडीसी पर व्यक्त की है। पीडीसी 2 की तुलना में MHC वर्ग द्वितीय के उच्च स्तर और costimulatory अणुओं का इजहार, जो दोनों के CD24 + सीडीसी, – सीडीसी और CD11b – इसके अलावा, सीडीसी आगे CD11b + CD24 में विभाजित किया जा सकता है। परिपक्व पीडीसी, दूसरे हाथ पर, चुनिंदा Siglec-एच और BST2 4 व्यक्त करने के लिए दिखाया गया है। एफunctionally, सीडीसी पीडीसी रहे हैं की तुलना कोशिकाओं पेश बेहतर प्रतिजन होते हैं; हालांकि, पीडीसी मैं वायरस के संक्रमण या सूजन उत्तेजना 5 पर इंटरफेरॉन प्रकार का एक विशाल राशि का उत्पादन कर सकते हैं।
दोनों सीडीसी और पीडीसी अल्पकालिक हैं, और इसलिए, लगातार अस्थि मज्जा (बीएम) 6.7 भीतर पूर्वज से मंगाया जाना चाहिए। घातक विकिरणित चूहों में आम माइलॉयड पूर्वज (CMPs) और आम लसीकावत् पूर्वज (CLPs) के दत्तक हस्तांतरण सीडीसी और पीडीसी दोनों प्रजातियों 8-10 से उत्पन्न हो सकता है कि यह दर्शाता है। हालांकि, RAG1 / 2 को व्यक्त करने और IGH ठिकाना 11,12 पर पुन: व्यवस्थित डीजे खंडों के अधिकारी है कि पीडीसी के एक सबसेट है। इन कोशिकाओं को भी B220 मार्कर की अभिव्यक्ति, न्यूक्लिक एसिड संवेदन रिसेप्टर्स (TLR7 / TLR9), और प्रतिलेखन कारक (Spib और Bcl11a) 13 सहित बी लिम्फोसाइटों, साथ आणविक समानता का हिस्सा है, लसीकावत् वंश के हस्ताक्षर माना जा रहा है सभी सुविधाएँ। इसलिए, सीएलपीक्योंकि वंश समानता के पीडीसी की इन विट्रो पीढ़ी के लिए अच्छा विकल्प हो सकता है।
इंसानों और चूहों में दोनों सीडीसी और पीडीसी की आवृत्ति बहुत कम है, जबकि 6, डीसी, विशेष रूप से सीडीसी (जैसे जीएम- CSF 11,14 या FLT3 ligand के रूप में साइटोकिन्स, की उपस्थिति में बी.एम. या पूर्वज से इन विट्रो में उत्पन्न किया जा सकता फ्लोरिडा ) फीडर मुफ्त सिस्टम 11,15,16 के प्रयोग से। दुर्भाग्य से, हालांकि, यह फ्लोरिडा 11,15,16 का उपयोग कर इन विट्रो में पीडीसी की बड़ी संख्या के उत्पादन के लिए संभव नहीं है। पहले हम पीडीसी कुशलता से एसी-6 फीडर सिस्टम 17 का उपयोग कर CLPs से इन विट्रो में उत्पन्न किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया। संस्कृति प्रणाली में एसी-6 stromal सेल लाइन का उपयोग करने का लाभ यह है कि सेल सेल से संपर्क करें और CLPs से पीडीसी की बड़ी संख्या की पीढ़ी का समर्थन करने वाले साइटोकिन्स के स्राव प्रदान करता है। इस प्रणाली के साथ उत्पादन काफी मजबूत है, नीचे वर्णित प्रक्रियाओं से सावधान प्रतिकृति मैं आवश्यक हैn आदेश पीडीसी के कुशल पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम CLPs की एक छोटी संख्या से, विशेष रूप से एक में इन विट्रो संस्कृति डीसी के मजबूत पीढ़ी के लिए प्रणाली है, और पीडीसी का वर्णन है। इस संस्कृति प्रणाली की विशिष्टता फीडरों के रूप में एसी-6 कोशिकाओं, ए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉक्टरों के आभारी हैं। अभिकर्मकों प्रदान करने के लिए मार्कस Manz और इरविंग Weissman। हम यह भी क्रमश: चिकित्सा और एनटीयू अस्पताल के नेशनल ताइवान विश्वविद्यालय कॉलेज में प्रवाह cytometric विश्लेषण और पहले की सेल छँटाई कोर सुविधा और दूसरी कोर प्रयोगशाला द्वारा प्रदान की सेवा स्वीकार करते हैं। इस काम के विज्ञान और प्रौद्योगिकी, ताइवान मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया (सबसे 102-2320-बी-002-030-MY3) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों, ताइवान (NHRI-EX102-10256SI और NHRI-EX103-10256SI)।
Materials
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
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