Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

In vitro generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System

doi: 10.3791/53211 Published: November 23, 2015

Abstract

Plasmacytoïde dendritische cellen (pDCs) zijn krachtige type I interferon (IFN-I) producerende cellen die geactiveerd worden in reactie op infectie of tijdens ontstekingsreacties. Helaas is studie van PDC-functie gehinderd door hun lage frequentie in lymfoïde organen, en de bestaande methodes voor in vitro DC generatie overwegend voorstander van de productie van CDCS dan pDCs. Hier presenteren we een unieke benadering om efficiënt genereren pDCs van zachte lymfoïde voorlopers (CLPs) in vitro. Specifiek, het protocol beschreven hoe zuiveren CLPs uit beenmerg en pDCs genereren door coculturing met γ bestraalde AC-6 voedingscellen in de aanwezigheid van Flt3 ligand. Een uniek kenmerk van dit kweeksysteem dat de CLPs migreren onder de AC-6 cellen en wordt geplaveide-gebied vormende cellen, een kritische stap voor de uitbreiding pDCs. Morfologisch onderscheiden DCs, namelijk pDCs en CDCs werden gegenereerd na ongeveer 2 weken met een samenstelling van 70-90% pDCs onder optimale omstandigheden. Kenmerkend het aantal pDCs gegenereerd door deze methode is ongeveer 100-voudig van het aantal geënte CLPs. Dit is dus een nieuw systeem waarmee robuust genereren grote aantallen pDCs vereist verder onderzoek naar de ontwikkeling en functie van deze cellen vergemakkelijkt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dendritische cellen (DCs) zijn professionele antigeenpresenterende cellen die een belangrijke rol spelen bij het ​​regelen immuunreacties 1. Hoewel DCs zijn heterogeen, kunnen zij in grote lijnen worden ingedeeld in twee populaties, conventionele DC (CDC) en plasmacytoïde DCs (pDCs) 2,3. Naast lymfoïde organen, zijn CDCs en pDCs ook gevonden in weefsels waaronder longen, darmen en huid 2. De morfologie van CDCs en pDCs verschilt met CDCs vertonen dendriet uitsteeksels en de vorm van pDCs die meer plasma celachtige. Verder wordt een gemeenschappelijke muis DC marker, CD 11 c, sterker uitgedrukt op CDCs dan op pDCs. Bovendien kan CDCs verder worden onderverdeeld in CD11b + CD24 - CDCs en CD11b - CD24 + CDCs, die beide tot expressie hogere niveaus van MHC klasse II en costimulatoire moleculen doen dan pDCs 2. Oudere pDCs, anderzijds, bleken selectieve expressie Siglec-H en BST2 4. Functionally, CDCs beter antigeenpresenterende cellen dan zijn pDCs; kan echter pDCs een grote hoeveelheid type I interferon na virusinfectie of inflammatoire stimulatie 5 produceren.

Zowel CDC en pDCs zijn van korte duur, en daarom moet voortdurend worden aangevuld uit voorlopercellen in het beenmerg (BM) 6,7. Adoptieve overdracht van gewone myeloïde voorlopercellen (CMP) en gebruikelijke lymfoïde voorlopers (CLPs) in lethaal bestraalde muizen toont aan dat CDCs en pDCs kunnen uit beide geslachten 8-10. Er is echter een subset van pDCs die RAG1 / 2 tot expressie en bezitten DJ geherrangschikte segmenten op de IgH locus 11,12. Deze cellen delen ook moleculaire gelijkenissen met B-lymfocyten, met inbegrip van de expressie van de B220 marker, nucleïnezuur sensing receptoren (TLR7 / TLR9), en transcriptiefactoren (SPIB en Bcl11a) 13, voorzien van alle verondersteld om handtekeningen van de lymfoïde afkomst zijn. Daarom CLPs kunnen goede keuzes voor de in vitro generatie van pDCs vanwege afstamming gelijkenis.

Terwijl de frequentie van zowel CDC en pDCs bij mensen en muizen is zeer laag 6, DCs, met name CDCs kan worden gegenereerd in vitro van BM of progenitoren in aanwezigheid van cytokinen, zoals GM-CSF of 11,14 Flt3 ligand (FL ) met behulp van-feeder vrije systemen 11,15,16. Helaas is het niet mogelijk grote aantallen pDCs in vitro gebruik van FL 11,15,16 produceren. Eerder hebben we aangetoond dat pDCs efficiënt kunnen worden gegenereerd in vitro uit CLPs met behulp van de AC-6 feeder-systeem 17. Het voordeel van de AC-6 stromale cellijn in het kweeksysteem is dat het cel-cel contact en uitscheiding van cytokinen die het genereren van grote aantallen pDCs steun van CLPs. Hoewel de productie met dit systeem is zeer robuust, is een zorgvuldige replicatie van de procedures hieronder beschreven vereiste in het oog op een efficiënte opwekking van pDCs garanderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

C57BL / 6 wild-type muizen werden gekocht van de National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan. Alle muizen werden gefokt en onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden. Protocollen en het gebruik van dieren procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de National Taiwan University College of Medicine (Permit nummer: 20.120.075) goedgekeurd. Daarnaast onderzoekers er alles aan gedaan om het potentieel voor pijn, lijden of angst te verminderen in de dieren tijdens het uitvoeren van experimenten. Alle beschreven procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur uitgevoerd terwijl het dragen van handschoenen.

1. Bereiding van AC-6 voedingscellen

Opmerking: De AC-6.21 (AC-6 in het kort) stromale cellijn 18 (geleverd door I. Weissman, Stanford University) moet in RPMI worden gehandhaafd, aangevuld met 15% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS). Om te dienen als feeder-cellen, AC-6 cellen zijn γ-bestraald met 3.000 rad (30Gy) een dag voor de co-cultuur om hun verspreiding te voorkomen. Note thbij AC-6 cellen hebben de neiging om hun differentiatie ondersteunende capaciteit verliezen als ze overvol tijdens het onderhoud, of als hun passage nummer is dan 20.

  1. Wash AC-6 cellen eenmaal met 1 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) en DPBS verwijderen door aspiratie. Behandel AC-6 cellen met 0,8 ml trypsine-oplossing (0,05% trypsine en 0,5 mM EDTA in DPBS) voor 3-5 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2 en dan stoppen de reactie door verdunning met 10 volumes kweekmedium maken enkele celsuspensie.
  2. Seed AC-6 cellen bij 5.9x10 4 cellen / putje in 12-putjes en incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
    Opmerking: De dichtheid van AC-6 cellen is zeer belangrijk omdat een lagere dichtheid zullen cdc generatie bevoordelen. Enten bij een dichtheid van 5.9x10 4 cellen / putje zal AC-6 tot confluentie bereiken de volgende dag, die optimaal is voor het afleiden van pDCs van CLPs.
  3. Bestralen AC-6 cellen bij 3000 rad (30 Gy) met behulp γ-bestraler.
    AantekeningDe gebruikte dosis bestralen AC-6 is geoptimaliseerd om te voorkomen dat cellen uit prolifererende en toch levensvatbaar houden lang genoeg om de cytokinen en cel-cel-contact nodig is voor differentiatie van DC van CLPs verschaffen.
  4. Zuig medium en vervangen door 1 ml compleet RPMI (RPMI met 10% hitte-geïnactiveerd FBS, 50 ug / ml gentamycine en 50 uM β-mercaptoethanol).

2. Isoleer BM cellen van muizen

  1. Offer muizen door CO 2 stikken en cervicale dislocatie. Plaats de muizen op een dissectie lade en steriliseren met 70% ethanol. Maak een insnijding in het midden van de buik en verwijder het vel van het distale deel van de muis met inbegrip van de huid die de onderste ledematen.
  2. Ontleden muizen in een semi-steriele kap. Om het femur en tibiae los klem de femur boven en tibiae onder het kniegewricht. Maak de spieren van de botten met een schaar en plaats de botten in een 6 cm petrischaal met 5 ml compleet RPMI.
  3. Verhuizen naar een steriele cultuur kap. Vul een 3 ml spuit verbonden met een 27G naald met volledig RPMI. Snijd de uiteinden van de botten met een schaar, en breng de 27G naald om het merg spoelen van de botten door zachtjes te injecteren volledig RPMI keer van elk eind.
  4. Bereid een enkele celsuspensie door voorzichtig pipetteren de cellen en neer 3-5 keer in de kweekschaal met de spuit zonder naald.
  5. Centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 500 xg en decanteer het supernatant.
  6. Lyse rode bloedcellen met 1 ml ACK buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) incuberen 1 min en stoppen van de reactie door verdunning met 10 volumina volledig RPMI. Sta cellen gedurende 5 minuten om pellet dood neer celklonten en weefsel puin door de zwaartekracht staan.
    Opmerking: Ga niet meer dan 5 minuten, omdat dit zal resulteren in cel verlies als gevolg van de afwikkeling van levensvatbare cellen.
  7. Langzaam decanteer-cel supernatant naar een nieuwe buis verlaat puinachter in de originele buis.
  8. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 xg om de cellen te pelleteren, verwijder de bovenstaande vloeistof.
  9. Resuspendeer totale BM cellen (gewoonlijk 4-6 x 10 7 BM cellen zijn uit een muis) in 100 ui FACS-buffer (1x PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA).

3. FACS Analyse en sorteren van CLPs

  1. Add anti-CD16 / 32 (hybridoma supernatant kloon 2.4G2, 50 ul / reactie of 1-2 ug / reactie) in cellen in FACS-buffer (stap 2,9) gedurende 1-2 min om Fc-receptoren te blokkeren.
    Opmerking: Anti-CD16 / 32 wordt ook genoemd Fc blok, dat wordt toegevoegd aspecifieke binding van antilichamen te voorkomen dat cellen die Fc-receptoren zoals granulocyten, monocyten en B-lymfocyten.
  2. Gelijktijdig vlek cellen met de volgende fluorescerende kleurstof gemerkte antilichamen (voor 4x10 7 cellen) gedurende 15 min op ijs, het vermijden van omgevingslicht. Antibodies: PE-geconjugeerde lineage markers (0,2 ug elk) waaronder anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD 11 b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119), en anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 ug anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 ug anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 ug anti-M-CSFR-APC (AFS98) en 0,2 ug anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
  3. Was de cellen met 3 ml FACS buffer en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g.
  4. Resuspendeer de cellen in 300 ui FACS-buffer en filtercellen door een 40 uM cel zeef.
  5. Was de buis met een extra 100 ui FACS buffer om eventuele resterende cellen te herstellen en filter in een steriele FACS sortering buis met behulp van dezelfde cel zeef.
  6. Voeren flowcytometrische analyse direct na de kleuring met behulp van geschikte filters en spanningen voor detectie. Gebruik 488 nm laser om de FITC, PerCP-Cy5.5 gemerkte antilichamen, 561 nm laser om de PE- en de PE-Cy7-labelded antilichamen en 633 nm las detecteerter de APC-gemerkte antilichaam te detecteren.
  7. Sorteren CLPs volgens de volgende markers lin - c-kit int Sca-1 int M-CSFR - IL-7Rα + (zoals lood in stap 3,2) met een cell sorter. Verzamel de cellen gesorteerd in een 15 ml buisje met 8 ml compleet RPMI als kussen.
  8. Noteer het absolute aantal gesorteerde cellen zoals getoond door de cel sorteerder aan het eind van de run. Meestal kan 5x10 4 CLPs worden verkregen uit het BM van een muis.

4. Coculture CLPs en AC-6

  1. Centrifugeer de cellen gesorteerd uit stap 3,7 gedurende 10 min bij 500 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet met voldoende compleet RPMI tot een celdichtheid te verkrijgen ongeveer 5x10 4 cellen / ml. Seed 500 cellen / putje in de 12-wells plaat met voedingscellen bereid in stap 1,4.
  2. Voeg 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig gegenereerde interne toepassing van een expressiesysteem door M. Manz, University Hospital Zürich, Zwitserland) en incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 periodieke visuele controle van DC ontwikkeling onder een microscoop.
    Opmerking: In de handel verkrijgbare recombinant humaan of muizen FL FL kan worden gebruikt als vervanging voor hu-Flt3L-Ig DC ontwikkeling.
  3. Verzamel de cellen in de supernatant op dag 12 en spoel de wells eenmaal met 0,5 ml compleet RPMI-medium combineren van de resulterende supernatanten. Voeg 0,5 ml vers medium en schroot van de hechtende cellen met een cel schraper.
  4. Combineer het celbevattende medium uit beide delen en centrifugeer 5 min bij 500 x g.
  5. Decanteer supernatant en resuspendeer cellen in 50 ul FACS buffer. Voeg 50 ul anti-CD16 / 32 hybridoma supernatant en incubeer gedurende 1-2 min aan Fc-receptoren te blokkeren.
  6. Sommen en vlekken alle cellen met de volgende antilichamen (0,05 ug elk) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD 11 b-FITC en anti-B220-PE.
  7. Was en centrifuge de cellen zo te beschrijvend in stap 3.3.
  8. Resuspendeer de cellen in 100 ui FACS-buffer, hek aan CD 11 c + en analyseren CDC (CD 11 c + CD11b + B220 -) en pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Een totaal van 7 4-6x10 BM cellen worden gewoonlijk geïsoleerd uit dijbenen en scheenbenen van een 6-8 weken oude wildtype C57BL / 6 muis. Uitzoeken CLPs, zijn totale BM cellen gekleurd met PE-geconjugeerde antilichamen tegen lineage markers (CD3, CD8, B220, CD19, CD 11 b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 en MHC-II), anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC en anti-IL-7Rα-PE / Cy7, geanalyseerd en gesorteerd met een cell sorter. De sortering strategie CLP is weergegeven in figuur 1. Meestal worden 5x10 4 CLPs verkregen van een C57BL / 6 muis. Om meer CLPs verkrijgen, kan BM cellen 3-4 muizen worden gecombineerd en het protocol aangepast vóór sortering.

Na de co-cultuur van 500 CLPs met 5.9x10 6 AC-6 feeder cellen, geplaveide-gebied vormende cellen (CAFC) beginnen te verschijnen op dag 3-4. Overdag 8, ronde vorm pDCs verschijnen en schorten bovenop de CAFC (Figuur 2A). Het aantal pDCs pieken rond day 12-14 waarna pDCs beginnen apoptose na de volledige ontwikkeling ondergaan, en de nummers beginnen geleidelijk afnemen. CDC kolonies lijken uiterlijk pDC kolonies, op dag 6-8, en de morfologie van CDCs zijn groter, spindel-achtige, en vastzittend (Figuur 2B).

Meestal kan 5-6x10 4 cellen worden gegenereerd uit 500 CLPs na 2 weken coculture. Na het kleuren van de cellen met anti-CD11c-APC, anti-CD 11 b-FITC en anti-B220-PE analyse door doorstroomcytometrie blijkt dat het percentage pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) en CDC (CD 11 c + CD11b + B220 - ) is 91% en 6%, respectievelijk (figuur 3). Daarom is deze werkwijze pDCs kan oplopen tot 100-voudig geëxpandeerd.

Figuur 1
Figuur 1. Gating strategieën voor CLPs. BM cellen isokend van één muis werden gekleurd met fluorescent-gelabelde antilichamen en CLPs, die werden gedefinieerd als lin geanalyseerd - c-Kit int Sca-1 int M-CSFR -. IL-7Rα + Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. Morfologie van CDC en pDC kolonies in CLP-AC-6 cocultures. 500 CLPs werden tezamen gekweekt met bestraalde AC-γ-6 voedingscellen in de aanwezigheid van 100 ng / ml FL. (A) pDC kolonies op dag 8, 10 , en 12, en (B) CDC kolonies op dag 8, 12 en 16 werden gefotografeerd onder een lichtmicroscoop bij 200 x (schaal bar 50 micrometer). Klik hier om een larg bekijkenER versie van deze figuur.

Figuur 3
Figuur 3. Flow cytometrische analyse van CLP-afgeleide pDCs en CDCS. Vijfhonderd CLPs en γ-bestraalde AC-6 voedingscellen (5.9x10 4 / ml) werden tezamen gekweekt in vitro gedurende 12 dagen in aanwezigheid van FL (100 ng / ml ). De cellen werden gekleurd met anti-CD 11 c-APC, anti-CD 11 b-FITC en anti-B220-PE en door stroomcytometrie geanalyseerd. De cellen werden eerst gated op CD11c + en daarna voor CDCS (CD11c + CD11b + B220 -) geanalyseerd en pDCs (CD11c + CD11b - B220 +). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier beschrijven we een in vitro kweeksysteem voor de robuuste genereren van DCs en pDCs name uit een klein aantal CLPs. Het unieke van deze cultuur systeem door het gebruik van AC-6 cellen, een stromale cellijn, zoals feeders. Deze benadering is aangetoond dat niet alleen de cytokinen, zoals IL-7, SCF, M-CSF en FL 20 geven, maar ook de cel-cel contact 21 noodzakelijk DC ontwikkeling. AC-6 cellen zijn eerder gebruikt voor de studie van de in vitro DC ontwikkeling van verscheidene voorlopers 8,16,22 vergemakkelijken. We vonden dat het essentieel is voor een optimale dichtheid van AC-6 voedingscellen zaad de efficiënte differentiatie van pDCs steun van CLPs. Specifiek zaaien 5.9x10 4-γ bestraald AC-6 cellen in 12-well platen leidt tot confluentie de volgende dag, die geschikt is voor pDC ontwikkeling. Een lagere AC-6 celdichtheid (3.9x10 4 / putje in 12-well plaat) neigt cdc developmen ondersteunent 24. Daarom wordt aanbevolen om eerst zaad verschillende concentraties van AC-6 cellen om te optimaliseren bij het ​​opschalen van het kweeksysteem 23. Bovendien is het ook belangrijk dat de AC-6 cellen nauwgezet worden gehandhaafd, met aandacht voor passage nummer, en nooit mag bereiken van confluentie. Als links overbevolkte of als hun passage nummer groter is dan 20, deze cellen de neiging om de mogelijkheid om hematopoiese te ondersteunen in vitro verloren. Bovendien is de concentratie van FL beïnvloedt ook DC ontwikkeling. In het bijzonder bij lage doseringen (25-50 ng / ml) CDCs voorkeur worden ontwikkeld, terwijl hoge doses (100-200 ng / ml) pDCs worden voornamelijk geproduceerd 24. Naast de AC-6 celdichtheid en FL dosering zorgvuldige selectie van een batch van FBS dat ondersteunt efficiënt DC ontwikkeling op dit kweeksysteem is voor het welslagen van de procedure.

Terwijl in vitro afgeleide CDC en pDCs kan distinguished hun oppervlaktemerkers, namelijk CD11c + CD11b + B220 - en CD 11 c + CD11b - B220 +, respectievelijk hun morfologie ook onderscheiden door microscopie. CDCS groter, spoelvormige en zijn adherent, terwijl pDCs kleiner, round-vormig en in suspensie groeien (Figuur 2). De kinetiek van DC differentiatie verschilt ook, met pDCs eerder en CDCS later verschijnen. Bovendien wordt het proces van ontwikkeling pDC significant beïnvloed door AC-6 celdichtheid hogere AC-6 density versnelling van het ontwikkelingsproces. Opgemerkt zij dat pDCs beginnen te sterven na volledige ontwikkeling en dus de verhouding van CDCs versus pDCs in dit kweeksysteem geleidelijk toe op latere tijdstippen. Daarom wordt een periodieke controle van DC ontwikkeling door microscopie en flowcytometrie sterk aanbevolen om te bepalen wanneer pDCs gaan apoptose.

Van de nota, de described werkwijze kan ook worden toegepast op andere DC voorlopers, zoals CDP; echter in hoofdzaak DC populatie gegenereerd uit deze cellen CDC 17, zelfs bij hoge AC-6 dichtheden of FL doses. De lage pDC potentieel van CDP is in overeenstemming met de rapporten van verschillende groepen met behulp van CDP-feeder 11 of-feeder vrije 16 systemen, twee verschillende in vitro kweeksystemen. Deze resultaten suggereren dat de AC-6 voedersysteem getrouwe afspiegeling kan het differentiatievermogen van verschillende voorlopers.

De inkomsten uit deze cultuur systeem pDCs zijn CD11c + CD11b - B220 +. Bovendien drukken zij relatief veel TCF4 (codeert E2-2) en RAG1, twee pDC-specifieke genen, maar lagere Id2 een CDC-specifiek gen, dan doet CDCS 17. Hoewel deze pDCs missen Siglec-H en BST2, markers als kenmerkend murine pDCs, ze nog steeds in staat om hogere productie van IFN-I dandoen CDCS en upregulate CD86 wanneer besmet met vesiculaire stomatitis virus (VSV) 24. Dit suggereert dat deze pDCs, ofschoon onvolledig gedifferentieerde, nog functioneel. Bovendien hebben we reeds met succes gebruikt deze methode om een synergetische rol van IFN-I en FL in pDC ontwikkeling afbakening van CLPs 17 bevestigt dat deze techniek is waardevol voor het bestuderen van DC ontwikkeling.

Concluderend hier presenteren we een eenvoudige, doch doeltreffende methode om pDCs van een klein aantal CLPs met de AC-6 feeder coculture, dat ontwikkelings- of functionele studies van pDCs kunnen vergemakkelijken genereren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

We zijn dankbaar voor Drs. Markus Manz en Irving Weissman voor het verschaffen van reagentia. Wij erkennen ook de dienstverlening van de Flow cytometrische analyse en celsortering Core Facility van de Eerste en Tweede Core Laboratory bij National Taiwan University College of Medicine en NTU ziekenhuis, respectievelijk. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (MOST 102-2320-B-002-030-my3) en de National Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI en NHRI-EX103-10256SI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10, (8), e0135217 (2015).
<em>In vitro</em> generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).More

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter