Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

I vitro Generation av murina Plasmacytoid dendritiska celler från Common lymfoid stamfäder med hjälp av AC-6 Feeder System

doi: 10.3791/53211 Published: November 23, 2015

Abstract

Plasmacytoid dendritiska celler (pDCs) är kraftfulla typ I interferon (IFN-I) producerande celler som aktiveras som svar på infektion eller under inflammatoriska svar. Tyvärr är studiet av PDC-funktionen hindras av deras låga frekvens i lymfoida organ och befintliga metoder för in vitro DC generation gynnar främst produktionen av CDCs över pDCs. Här presenterar vi en unik metod för att effektivt generera pDCs från vanliga lymfoida stamceller (CLPS) in vitro. Specifikt beskrev protokollet beskriver hur du renar CLPS från benmärg och generera pDCs genom samodling med y-bestrålade AC-6 feeder-celler i närvaro av Flt3 ligand. En unik egenskap hos denna kultur systemet är att CLPS migrerar under AC-6-celler och bli gatsten område bildande celler, ett viktigt steg för att expandera pDCs. Morfologiskt distinkta DC, nämligen pDCs och CDCs, genererades efter ca 2 veckor med en sammansättning av 70-90% pDCs under optimala förhållanden. Typiskt är antalet pDCs som genereras genom detta förfarande ungefär 100-faldigt av antalet CLPS sådda. Därför är detta ett nytt system som man kraftfullt generera ett stort antal pDCs för att underlätta fortsatta studier i utvecklingen och funktionen hos dessa celler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dendritiska celler (DC) är professionella antigenpresenterande celler som spelar en viktig roll i att kontrollera immunsvar 1. Medan utvecklingsländerna är heterogena, kan de i stort sett delas in i två populationer, konventionell DCs (CDCs) och plasmacytoid DC (pDCs) 2,3. Förutom lymfoidorgan är CDCs och pDCs också i vävnader inklusive lungor, tarm och hud 2. Morfologin hos CDCs och pDCs skiljer, med CDCs uppvisar dendritliknande liknande utsprång och formen på pDCs är mer plasmacell-liknande. Dessutom är den gemensamma mus DC markör, CD11c, högre uttryckt på CDCs än på pDCs. Dessutom kan CDCs delas upp ytterligare i CD11b + CD24 - CDCs och CD11b - CD24 + CDCs, vilka båda uttrycker högre nivåer av MHC klass II och samstimulerande molekyler än gör pDCs 2. Mogna pDCs, å andra sidan, har visats att selektivt uttrycka Siglec-H och BST2 4. Functionally, CDCs är bättre antigenpresenterande celler än är pDCs; kan dock pDCs producera en stor mängd typ I interferon på virusinfektion eller inflammatorisk stimulering 5.

Både CDCs och pDCs är kortlivade, och därför måste ständigt fyllas från stamceller i benmärgen (BM) 6,7. Adoptiv överföring av gemensamma myeloida stamceller (CmpS) och de gemensamma lymfoida progenitorceller (CLPS) i letalt bestrålade möss visar att CDCs och pDCs kan genereras från båda linjerna 8-10. Det finns dock en delmängd av pDCs som uttrycker RAG1 / 2 och besitter omlagrade DJ segment på IgH-locuset 11,12. Dessa celler delar också molekylära likheter med B-lymfocyter, inklusive uttryck av B220 markör, nukleinsyra kännande receptorer (TLR7 / TLR9), och transkriptionsfaktorer (SPIB och Bcl11a) 13, har alla tros vara underskrifter lymfoida. Därför CLPs kan vara bra val för in vitro generation pDCs grund av härstamning likhet.

Medan frekvensen av både CDCsen och pDCs hos människor och möss är mycket låg 6, DCs, särskilt CDCs, kan genereras in vitro från BM eller progenitorer i närvaro av cytokiner, såsom GM-CSF 11,14 eller Flt3-ligand (FL ) med hjälp av matarfria system 11,15,16. Olyckligtvis är det emellertid inte möjligt att framställa ett stort antal pDCs in vitro med användning FL 11,15,16. Tidigare visade vi att pDCs effektivt kan genereras in vitro från CLPS med hjälp av AC-6 matningssystemet 17. Fördelen med att använda en AC-6 stromala cellinje i odlingssystemet är att det ger cell-cellkontakt och utsöndring av cytokiner som stödjer generering av stora antal pDCs från CLPS. Även om produktion med detta system är ganska robust, noggrann replikering av de förfaranden som beskrivs nedan krävs iör att säkerställa en effektiv generering av pDCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

C57BL / 6 vildtypsmöss köptes från National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan. Alla möss avlades och hölls under specifika patogenfria betingelser. Protokoll och förfaranden användning av djur har granskats och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén av National Taiwan University College of Medicine (Tillståndsnummer: 20120075). Dessutom forskarna gjorde allt för att minska risken för smärta, lidande eller ångest hos djuren när de utför experiment. Alla förfaranden som beskrivs genomfördes vid RT med handskar.

1. Framställning av Ac-6 matarceller

Obs: AC-6,21 (AC-6 i korta) stromala cellinjen 18 (tillhandahållen av I. Weissman, Stanford University) bör bibehållas i RPMI kompletterat med 15% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS). Att tjäna som matarceller, AC-6-celler är γ-bestrålades med 3000 rad (30Gy) en dag innan co-kultur för att förhindra deras spridning. Note: tepå AC-6-celler tenderar att förlora sin differentiering stödjande förmåga om de lämnas fulla vid underhåll, eller om deras passage nummer är över 20.

  1. Tvätta AC-6-celler en gång med 1 ml Dulbeccos fosfatbuffrad salin (DPBS) och ta bort DPBS genom aspiration. Behandla AC-6-celler med 0,8 ml trypsinlösning (0,05% trypsin och 0,5 mM EDTA i DPBS) under 3-5 min vid 37 ° C, 5% CO2 och därefter stoppa reaktionen genom att späda den med 10 volymer odlingsmedium till göra enkelcellsuspension.
  2. Seed AC-6-celler vid 5.9x10 4 celler / brunn i 12-brunnars plattor och inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
    Obs: Densiteten hos AC-6-celler är mycket viktig eftersom en lägre densitet kommer att gynna CDC generationen. Sådd med en täthet av 5.9x10 4 celler / brunn gör att AC-6 att växa samman av nästa dag, vilket är optimalt för härledning av pDCs från CLPS.
  3. Bestråla AC-6-celler vid 3000 rad (30 Gy) med hjälp av γ-bestrålare.
    Notera: Dosen som används för att bestråla AC-6 är optimerad för att förhindra cellerna från prolifererande och ändå hålla dem livskraftiga tillräckligt länge för att ge cytokiner och cell-cellkontakt krävs för differentiering av DC från CLPS.
  4. Aspirera medium och ersätt med 1 ml fullständigt RPMI (RPMI med 10% värmeinaktiverat FBS, 50 | ig / ml gentamycin och 50 jiM β-merkaptoetanol).

2. Isolera BM-celler från möss

  1. Sacrifice möss genom CO 2 kvävning och halsdislokation. Placera möss på en dissektion fack och sterilisera med 70% etanol. Gör ett snitt vid mitt buken och ta bort huden från den distala delen av musen, inklusive huden som täcker de nedre extremiteterna.
  2. Dissekera möss i en semi-sterila huven. För att frigöra lårbenet och tibiae, klipp lårbenet ovan och tibiae under knäleden. Lossa musklerna från benen med hjälp av sax och placera benen i en 6 cm petriskål innehållande 5 ml fullständigt RPMI.
  3. Flytta till en steril kultur huva. Fyll en 3 ml spruta kopplad till en 27G nål med fullständig RPMI. Klipp av båda ändarna av benen med hjälp av en sax och sätt i 27G nålen spola märgen ur benen genom att försiktigt injicera komplett RPMI gång från varje ände.
  4. Förbered en enkelcellsuspension genom försiktig pipettering cellerna upp och ned 3-5 gånger i odlingsskålen med användning av spruta utan nål.
  5. Centrifugera cellerna under fem minuter vid 500 x g och dekantera supernatanten.
  6. Lyse röda blodkroppar med en ml ACK-buffert (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) inkubering under 1 min och stoppa reaktionen genom utspädning med 10 volymer av fullständigt RPMI. Låt cellerna att stå i 5 min för att pelletera ner döda cellklumpar och vävnadsrester av tyngdkraften.
    Obs: Stå inte mer än 5 minuter, eftersom detta kommer att resultera i cellförlust på grund av sedimentering av levande celler.
  7. Långsamt dekantera cellinnehållande supernatanten till ett nytt rör som lämnar skräpbakom i det ursprungliga röret.
  8. Centrifugera under 5 minuter vid 500 xg för att pelletera cellerna sedan bort och kasta supernatanten.
  9. Resuspendera totala BM-celler (typiskt 4-6 x 10 7 BM celler erhålls från en mus) i 100 pl FACS buffert (1x PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA).

3. FACS analys och sortering av CLPS

  1. Lägg anti-CD16 / 32 (hybridom supernant klon 2.4G2, 50 | j, l / reaktion eller 1-2 pg / reaktion) in i celler i FACS buffert (steg 2,9) i 1-2 minuter för att blockera Fc-receptorer.
    Obs: anti-CD16 / 32 kallas också Fc-block, som tillsätts för att förhindra icke-specifik bindning av antikroppar till celler som uttrycker Fc-receptorer inklusive granulocyter, monocyter och B-lymfocyter.
  2. Samtidigt färga celler med följande fluorescerande färgämnesmärkta antikroppar (för 4x10 7 celler) för 15 minuter på is, undvika omgivande ljus. Antikroppar: PE-konjugerade härstamning markörer (0,2 ug vardera) inklusive anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119), och anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 ^ g anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 | ig-anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 | j, g anti-M-CSFR-APC (AFS98), och 0,2 | j, g anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
  3. Tvätta celler med 3 ml FACS-buffert och centrifugera i 5 min vid 500 x g.
  4. Resuspendera cellerna i 300 | il FACS-buffert och filtrera celler genom en 40 | iM cellfilter.
  5. Tvätta röret med ytterligare 100 | il FACS-buffert för att återvinna eventuella kvarvarande celler och filtrera till en steril FACS-sortering röret med användning av samma cellfilter.
  6. Utför flödescytometrisk analys omedelbart efter färgningen med hjälp av lämpliga filter och spänningar för signaldetektering. Använd 488 nm laser för att upptäcka FITC-, PerCP-Cy5.5-märkta antikroppar, 561 nm laser för att upptäcka PE och PE-Cy7-labelded antikroppar och 633 nm laser för att detektera APC-märkt antikropp.
  7. Sortera ut CLPS enligt följande markörerna lin - c-kit-int Sca-1 int M-CSFR - IL-7Rα + (som färgade i steg 3,2) med användning av en cellsorterare. Samla de sorterade cellerna i en 15 ml rör innehållande 8 ml fullständigt RPMI som en kudde.
  8. Registrera det absoluta antalet sorterade celler såsom visas av cellsorteraren i slutet av körningen. Normalt kan 5x10 4 CLPS erhållas från BM av en mus.

4. Coculture CLPS och AC-6

  1. Centrifugera de sorterade cellerna från steg 3,7 under 10 minuter vid 500 xg, avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten med tillräckligt komplett RPMI för att erhålla en celltäthet runt 5x10 4 celler / ml. Seed 500 celler / brunn i 12-brunnar innehåller matar celler framställda i steg 1.4.
  2. Tillsätt 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig genereras internt med hjälp av ett expressionssystem som tillhandahålls av M. Manz, University Hospital Zürich, Schweiz) och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 med periodisk visuell kontroll av DC utveckling under ett mikroskop.
    Obs: Kommersiellt tillgänglig rekombinant human FL eller mus FL kan användas som ett substitut för hu-Flt3L-Ig att stödja DC utveckling.
  3. Samla cellerna i supernatanten på dag 12 och tvätta brunnarna en gång med 0,5 ml fullständigt RPMI-medium som kombinerar de resulterande supernatanterna. Tillsätt 0,5 ml färskt medium och skrota de vidhäftande cellerna med en cell skrapa.
  4. Kombinera det cellinnehållande mediet från båda delarna och centrifugera i 5 min vid 500 x g.
  5. Dekan supernatanten och återsuspendera cellerna i 50 pl FACS buffert. Lägg 50 | il anti-CD16 / 32 hybridomsupernatant och inkubera i 1-2 minuter för att blockera Fc-receptorer.
  6. Räkna upp och färgar alla cellerna med följande antikroppar (0,05 ^ g vardera) anti CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC och anti-B220-PE.
  7. Tvätta och centrifugera cellerna som beskriverd i steg 3.3.
  8. Resuspendera cellerna i 100 pl FACS buffert, grind på CD11c + och analysera CDCs (CD11c + CD11b + B220 -) och pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Totalt 4-6x10 7 BM-celler isoleras typiskt från lårben och skenben av ett 6-8 wk-old, vildtyp C57BL / 6-mus. För att reda ut CLPS de totala BM-celler färgades med PE-konjugerade antikroppar mot linjemarkörer (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 och MHC-II), anti -c-kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC och anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analyseras och sorteras med en cellsorterare. Sorteringsstrategin för CLP visas i figur 1. Normalt är 5x10 4 CLPS erhållet från en C57BL / 6-mus. För att få fler CLPS kan BM-celler från 3-4 möss kombineras och protokoll justeras i enlighet före sortering.

Efter samodling av 500 CLPS med 5.9x10 6 AC-6 feeder-celler, kullerstens område bildande celler (CAFC) börjar dyka dag 3-4. Vid dag 8, runda-formade pDCs visas och avbryta ovanpå CAFC (Figur 2A). Antalet pDCs toppar runt day 12-14 vid vilken punkt pDCs börjar genomgå apoptos efter sin fulla utveckling, och siffrorna börjar gradvis minska. CDC kolonier visas senare än PDC kolonier, vid dag 6-8, och morfologin hos CDCs är större, spindel-liknande, och vidhäftande (figur 2B).

Typiskt kan 5-6x10 fyra celler genereras från 500 CLPS efter 2 veckor av samodling. Efter färgning av cellerna med anti-CD11c-APC, anti-CD11b-FITC och anti-B220-PE, cytometri visar analys genom flöde att andelen pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) och CDCs (CD11c + CD11b + B220 - ) är 91% respektive 6%, respektive (Figur 3). Därför, med denna metod pDCs kan utökas så mycket som 100-faldigt.

Figur 1
Figur 1. Gating strategier för CLPS. BM-celler isonas från en mus färgades med fluorescensmärkta antikroppar och analyserades med avseende CLPS, som definieras som lin - c-Kit int Sca-1 int M-CSFR -. IL-7Rα + Klicka här för att se en större version av denna siffra .

Figur 2
Figur 2. Morfologi av CDC och pdc kolonier i CLP-AC-6 samodlingar. 500 CLPS samodlades med y-bestrålade AC-6 matarceller i närvaro av 100 ng / ml FL. (A) PDC kolonier vid dag 8, 10 , och 12, och (B) CDC kolonier vid dag 8, 12 och 16 fotograferades under ljusmikroskop på 200 x (skala bar 50 um). Klicka här för att se en larger version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Flödescytometrisk analys av CLP-härledda pDCs och CDCs. Fem hundra CLPS och y-bestrålade AC-6-matarceller (5.9x10 4 / ml) samodlades in vitro under 12 dagar i närvaro av FL (100 ng / ml ). Cellerna färgades med anti-CD11c-APC, anti-CD11b-FITC och anti-B220-PE och analyserades med flödescytometri. Cellerna först gated på CD11c + och sedan analyseras för CDCs (CD11c + CD11b + B220 -) och pDCs (CD11c + CD11b - B220 +). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här beskriver vi ett in vitro-odlingssystem för den robusta generationen DC och pDCs i synnerhet från ett litet antal CLPS. Det unika med denna odlingssystemet är på grund av användningen av AC-6-celler, en stromala cellinje, som matare. Detta tillvägagångssätt har visat sig ge inte bara de cytokiner, såsom IL-7, SCF, M-CSF och FL 20, men också den cell-cellkontakt 21 nödvändigt för att stödja DC utveckling. AC-6-celler har tidigare använts för att underlätta studier av in vitro DC utvecklingen från flera stamceller 8,16,22. Vi fann att det är viktigt att ympa en optimal densitet av AC-6 matarceller för att stödja en effektiv differentiering av pDCs från CLPS. Specifikt sådd 5.9x10 4 y-bestrålade AC-6-celler i 12-brunnsplattor resulterar i konfluens nästa dag, som är lämplig för pDC utveckling. En lägre AC-6 celldensitet (3.9x10 4 / brunn i 12-brunnars platta) tenderar att stödja CDC development 24. Därför rekommenderas det att första frö flera koncentrationer av AC-6 celler för att optimera betingelserna vid skalning upp odlingssystemet 23. Vidare är det också viktigt att AC-6-celler vara noggrant bibehållas, noggrann uppmärksamhet på passagenummer, och aldrig tilläts nå konfluens. Om den lämnas fulla eller om deras passage antalet är större än 20, dessa celler tenderar att förlora förmågan att stödja hematopoes in vitro. Dessutom var koncentrationen av FL påverkar också DC-utveckling. Specifikt vid låga doser (25 till 50 ng / ml) CDCs preferentiellt utvecklade, medan vid höga doser (100 till 200 ng / ml) pDCs är huvudsakligen genereras 24. Förutom AC-6 celltäthet och FL dosering, är noggrant urval av ett parti FBS som effektivt stödjer DC utvecklingen i denna kultur centralvärme för framgången av förfarandet.

Medan in vitro-härledda CDCs och pDCs kan vara disKännetecknande för ytmarkörer, nämligen CD11c + CD11b + B220 - och CD11c + CD11b - B220 + respektive deras morfologier är också urskiljas genom mikroskopi. CDCs är större, spolformad och är vidhäftande, medan pDCs är mindre, runda formade och växa i suspension (fig 2). Kinetiken för DC differentiering skiljer sig också, med pDCs uppträder tidigare och CDCs senare. Dessutom är processen för pDC utveckling påverkades av AC-6 celltäthet med högre AC-6 densitet påskynda utvecklingsprocessen. Det bör noteras att pDCs börjar dö efter fullständig utveckling och därmed ökar förhållandet av CDCs kontra pDCs i detta odlingssystem gradvis vid senare tidpunkter. Därför är periodisk övervakning av DC-utveckling genom mikroskopi och flödescytometri rekommenderas för att bestämma när pDCs börjar att genomgå apoptos.

Att notera är described metod kan också tillämpas på andra likströms progenitorer, såsom CDPs; Men den huvudsakliga DC befolkningen som genereras från dessa celler är CDCs 17, även vid höga AC-6 densiteter eller FL doser. Den låga pDC potential CDPs överensstämmer med rapporter från olika grupper som använder antingen CDP-matare 11 eller matare fria 16 system, två olika in vitro odlingssystem. Dessa resultat tyder på att AC-6 matningssystemet troget kan spegla differentieringspotential olika progenitorceller.

De pDCs genereras från denna kultur systemet CD11c + CD11b - B220 +. Dessutom uttrycker de relativt höga nivåer av Tcf4 (kodar E2-2) och Rag1, två pDC-specifika gener, men lägre nivåer av Id2, en CDC-specifik gen, än vad CDCs 17. Även om dessa pDCs saknar Siglec-H och BST2, markörer som anses kännetecknande för murina pDCs, är de fortfarande kan producera högre nivåer av IFN-I ängör CDCs och uppreglera CD86 när infekterade med vesikulärt stomatitvirus (VSV) 24. Detta tyder på att dessa pDCs, men ofullständigt differentierade, fungerar fortfarande. Dessutom har vi redan framgångsrikt använt denna metod för att beskriva en synergistisk roll IFN-I och FL i PDC utveckling från CLPS 17, bekräftar att denna teknik är värdefullt för att studera DC utveckling.

Sammanfattningsvis, här presenterar vi en enkel, men effektiv metod för att generera pDCs från ett litet antal CLPS använder AC-6 feeder coculture systemet, vilket kan underlätta utvecklings eller funktionella studier av pDCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi är tacksamma för Dr.. Markus Manz och Irving Weissman för åstad reagens. Vi erkänner också den tjänst som tillhandahålls av flödescytometrisk analys och cellsortering Core Facility av första och andra kärn Laboratory vid National Taiwan University College of Medicine och NTU sjukhus, respektive. Detta arbete stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (MEST 102-2320-B-002-030-My3) och de nationella Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI och NHRI-EX103-10256SI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10, (8), e0135217 (2015).
<em>I vitro</em> Generation av murina Plasmacytoid dendritiska celler från Common lymfoid stamfäder med hjälp av AC-6 Feeder System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).More

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter