Summary

研究微生物群落<em>在体内</em>:主机之间介互动的典范<em>白色念珠菌</em>和<em>铜绿假单胞菌</em>在航空

Published: January 13, 2016
doi:

Summary

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Abstract

研究宿主 – 病原体相互作用使我们能够理解的致病性的基本机制微生物感染时。的主机的预后取决于抗病原菌1的适于免疫应答的参与。免疫反应是复杂的,结果从的病原体和几个免疫或非免疫细胞类型2的相互作用。 体外研究不能表征这些相互作用并集中于细胞-病原体相互作用。此外,在气道3中,特别是在患者的化脓性慢性肺疾病或机械通气患者中,多种微生物群落是本和复杂化宿主-病原体的相互作用。 绿脓杆菌 白色念珠菌都问题病原体4,从气管样品经常分离,并相关的严重感染,尤其是在重症监护病房5。微生物相互作用这些病原体之间被报道在体外但是这些相互作用的临床影响仍不清楚6。研究℃。白色念珠菌P之间的相互作用假单胞菌,C 鼠模型白色念珠菌呼吸道定植,随后是P.进行aeruginosa-介导的急性肺部感染。

Introduction

动物模型,特别是小鼠,已被广泛用来研究对病原体的免疫应答。虽然啮齿动物和人7之间先天和获得性免疫不同,容易在育种和击倒的发展,为众多的基因,使小鼠极好模型来研究免疫应答8。免疫反应是复杂的,来自病原体的相互作用的结果,驻地微生物菌群和多种免疫(淋巴细胞,中性粒细胞,巨噬细胞)和非免疫(上皮细胞,内皮细胞)的细胞类型2。 体外研究不允许观察这些复杂的相互作用,并主要集中在唯一的小区 – 病原体相互作用。而动物模型必须谨慎使用,并仅限于非常具体和相关问题,小鼠模型提供了良好的洞察体内的哺乳动物的免疫反应,并且可以解决重要的临床问题,7份

<p class=“jove_content”>在气道的微生物群落是复杂的关联有大量不同的微生物6。而什么构成一个“正常”的气道微生物组仍有待确定,居民社区经常多种微生物,并从不同的生态源产生。化脓性慢性肺疾病(囊性纤维化,bronchectasis)的患者或机械通气患者由环境获得微生物9显示出一个特定的菌群,由于气道的定植。 绿脓杆菌 白色念珠菌都是问题病原体5,经常分离一起从气管样品,和负责在这些患者严重的机会感染,特别是在重症监护病房(ICU)4。

这些微生物的急性肺炎在ICU的结果铜绿抗微生物治疗期间隔离铜绿 bUT酵母通常不会在这个网站5考虑致病。P.之间的体外相互作用铜绿假单胞菌C.白色念珠菌得到了广泛的报道,并表明,这些微生物可以影响生长和彼此的生存但研究不能断定,如果C的存在下白色念珠菌是有害还是有益的主机 10。小鼠模型被开发来解决这个P的相关性铜绿假单胞菌C. 白色念珠菌在 体内 ,但微生物之间的相互作用不是重点。事实上,建立模型以评价C的参与白色念珠菌在宿主免疫应答,和结果。

通过Roux等建立了以前的模式已经使用初始定植C.白色念珠菌其次是一种急性肺部感染诱发P.铜绿假单胞菌,利用他们的模型中,作者发现P的有害作用rior C.白色念珠菌定植11。然而Roux等使用℃的高负荷期间连续3天白色念珠菌在其用2×10 6 CFU /小鼠模型。我们建立了C的 4天模式白色念珠菌呼吸道定植,或至少没有持续性肺损伤,在这个模型C.白色念珠菌被检索长达4天的每只小鼠2B)12,13 10 5 CFU单个滴注后。 4天后,没有观察到证据炎性细胞募集,炎症性细胞因子的产生,也没有上皮损伤。在24 – 48小时在C的峰值出现白色念珠菌 ,即使在蜂窝和细胞因子的先天免疫反应,观察,没有任何证据表明肺损伤。出人意料的是,这样的小鼠定植C.白色念珠菌 48小时前鼻内P的滴注绿脓杆菌已经减弱感染相比,小鼠P.绿脓杆菌感染孤单。一世ndeed,小鼠表现出较少的肺损伤和减少细菌负荷12,13。

有几个假说可以解释前定植C.这种有益作用白色念珠菌P.铜绿假单胞菌介导的急性肺部感染。首先,将种间串扰涉及每个微生物群体感应系统,所述homoserinelactone基P.假单胞菌系统和金合欢醇系C.白色念珠菌系统,进行了评价。其次,C。白色念珠菌作为“诱饵”目标绿脓杆菌转向从肺上皮细胞中的病原体进行了研究。这两种假设都无效(未公布数据)。第三假设是一个由C“启动”先天免疫系统的白色念珠菌负责铜绿增强后续的先天响应铜绿假单胞菌 。这最后一种假设得到证实。事实上C.白色念珠菌定植导致先天免疫的启动THROUGH,IL-22,主要由分泌的先天淋巴样细胞,导致增加细菌的间隙并减小肺损伤12。

最后,该宿主是微生物调节先天免疫反应和涉及不同炎性细胞类型之间的相互作用的中心角色。虽然这些复杂的免疫相互作用可以在体外被解剖的初始假设只能通过适当的体内模型提供。以下协议提供的体内研究宿主介导的病原体相互作用的可适于其他微生物的一个例子。

Protocol

动物实验的区域伦理区域委员会已经批准了这个方法,按照在研究性研究指导原则与各国和国际动物护理和使用。 1.样品采集样品存储收集所有的样品,并立即在存放 – 20℃或在冰上直到冷冻储存以避免恶化。置于冰上的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS),以改善支气管肺泡灌洗(BAL)的性能。 手术灭菌用高压灭菌器的所有手术设备。 注意:…

Representative Results

作为协议的描述中之前看到的,实验需要5个一天就能完成( 图1:实验时间表)。在实验的整个运行过程中的一个操作员请求的和可处理的处理最多10只小鼠。如果更多的动物是必需的,需要特别用于外科样品收集两个人。实际上,所有样本必须收集在下2小时,以避免在最后的小鼠FITC标记的白蛋白的增加的被动肺泡 – 毛细血管渗漏。 第一步是C的制备白…

Discussion

动物模型,特别是哺乳动物,是有用的阐明宿主 – 病原体相互作用的复杂机制的免疫的领域。当然,对信息的需求只能从动物模型一定是必不可少的获得;否则,使用动物必须由体外模型来代替。该动物模型示出了只能由动物模型来提供自病原体之间的相互作用是由多组分宿主反应介导的洞察力。目前用来研究这种宿主 – 病原体相互作用小鼠是6岁到10周与成熟,不变的免疫反应的年轻人。当…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the “Société de Pathologies Infectieuses de Langue Française” (SPILF).

Materials

Sevorane, Sevoflurane Abott 05458-02 250 mL plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940 Berthold Technologies reference in first column no comment
Bromo-cresol purple agar Biomerieux 43021 x20 per unit
Pentobarbital sodique 5,47% CEVA 6742145 100 mL plastic bottle
2-headed valve  Distrimed 92831 no comment
Sterile inoculation loop 10 µL Dutscher 10175 x1000 conditioning
Insuline syringes 1 mL Dutscher 30003 per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 mL Dutscher 64300 no comment
Ultrospec 10  General Electric life sciences 80-2116-30 no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm  Gosselin W1773X per 100
PBS – Phosphate-Buffered Saline Life technologies 10010023 packaged in 500 mL
amikacin 1g Mylan 62516778 per 10 
Heparin 10 000 UI in 2 mL Pan pharma 9128701 x 10 per unit
RAL 555 coloration kit RAL Diagnostics 361550 3 flacons of 100 mL
1,5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 55.526.006 x  1000
Transparent 300 µL 96-well plate Sarstedt 82 1581500 no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth Sigma 95763 in powder
FITC-albumin Sigma A9771 in powder
Luria Bertani Broth Sigma L3022 in powder
25-gauge needle Terumo or unisharp A231 x100 conditioning
Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 no comment

References

  1. Casadevall, A., Pirofski, L. -. A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).
  2. Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. , (2012).
  3. Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).
  4. Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
  5. Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).
  6. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).
  7. Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).
  8. Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. , (2013).
  9. Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).
  10. Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
  11. Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).
  12. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  13. Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. , 1-33 (2009).
  14. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
  15. Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
  16. Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).
  17. Faure, E., Mear, J. -. B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).
  18. Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).

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Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).

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