Summary

Estudar comunidades microbianas<em> In Vivo</em>: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em> Candida Albicans</em> E<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Nas Airways

Published: January 13, 2016
doi:

Summary

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Abstract

Estudar interação patógeno-hospedeiro nos permite compreender os mecanismos subjacentes da patogenicidade durante a infecção microbiana. O prognóstico do hospedeiro depende do envolvimento de uma resposta imune contra o patógeno adaptado 1. A resposta imune é complexo e os resultados a partir da interação dos agentes patogénicos e vários tipos celulares imunes ou não imunes 2. Os estudos in vitro não pode caracterizar essas interações e foco em interações celulares-patógeno. Além disso, nas vias aéreas 3, particularmente em doentes com doença pulmonar crônica supurativa ou em pacientes sob ventilação mecânica, comunidades polimicrobianas estão presentes e complicar interação patógeno-hospedeiro. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans são tanto problema patógenos 4, freqüentemente isolado de amostras traqueobrônquicas, e associado a infecções graves, especialmente na unidade de cuidados intensivos 5. Interações microbianas temfoi relatado entre esses patógenos in vitro, mas o impacto clínico destas interações ainda não está claro 6. Para estudar as interações entre C. Albicans e P. aeruginosa, um modelo de murino de C. colonização albicans vias aéreas, seguido de um p infecção pulmonar aguda mediada aeruginosa- foi realizada.

Introduction

Os modelos animais, especialmente ratinhos, têm sido extensivamente utilizados para explorar as respostas imunitárias contra os agentes patogénicos. Embora a imunidade inata e adquirida diferem entre roedores e humanos 7, a facilidade na criação e no desenvolvimento de nocautes para numerosos genes, fazer camundongos um excelente modelo para estudar as respostas imunes 8. A resposta imune é complexo e resulta da interacção de um agente patogénico, da flora residente microbianas e vários imune (linfócitos, neutrófilos, macrófagos) e não-imune (células epiteliais, células endoteliais) tipos celulares 2. Os estudos in vitro não permitem observar essas interações complexas e centrar-se principalmente nas interações célula-patógeno únicas. Enquanto modelos animais deve ser utilizado com precaução e limitada a questões muito específicas e relevantes, modelos de ratos proporcionam uma boa perspectiva sobre a resposta imune mamífero in vivo e pode dirigir peças de questões clínicas importantes 7.

<p class="jove_content"> Nas vias respiratórias, a comunidade microbiana é complexo que associa um grande número de diferentes microrganismos 6. Enquanto que constitui um microbiome "normal" via aérea continua a ser determinado, comunidades residentes são frequentemente polimicrobiana, e originam a partir de diversas fontes ecológicos. Os pacientes com doença crônica supurativa pulmonar (fibrose cística, bronchectasis) ou pacientes sob ventilação mecânica apresentam uma flora especial devido à colonização das vias aéreas por microrganismos ambientalmente adquiridos 9. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans são ambos problema patógenos 5, freqüentemente isolado em conjunto a partir de amostras traqueobrônquicos , e responsável de infecção oportunista grave nesses pacientes, especialmente na unidade de terapia intensiva (UTI) 4.

O isolamento desses microrganismos durante pneumonia aguda em resultados de UTI no tratamento anti-microbiano contra P. b aeruginosaut levedura geralmente não são considerados patogênicos neste local 5. in vitro interações entre P. aeruginosa e C. albicans têm sido amplamente relatado e mostraram que esses microrganismos podem afectar o crescimento e a sobrevivência de outro, mas estudos não foi possível concluir se a presença de C. albicans é prejudicial ou benéfica para o hospedeiro 10. Mouse modelos foram desenvolvidos para abordar esta relevância do P. aeruginosa e C. albicans in vivo, mas a interação entre microrganismos não foi o ponto-chave. De facto, o modelo foi estabelecido para avaliar o envolvimento da C. albicans na resposta imune do hospedeiro, e resultado.

Um modelo anterior estabelecida por Roux et ai já utilizada uma colonização inicial com C. albicans seguido de uma infecção pulmonar aguda induzida por P. aeruginosa. Usando seu modelo, os autores encontraram um papel deletério da prior C. albicans colonização 11. No entanto Roux et al utilizaram uma carga elevada de C. albicans em seu modelo com 2 x 10 6 CFU / rato durante 3 dias consecutivos. Nós estabelecemos um modelo de 4 dias de C. colonização das vias aéreas albicans, ou pelo menos persistência sem lesão pulmonar, Neste modelo C. albicans foi recuperado até 4 dias após uma única instilação de 10 5 CFU por ratinho (Figura 2B) 12,13. Após 4 dias, não se observou qualquer evidência de recrutamento de células inflamatórias, a produção de citoquinas inflamatórias, nem dano epitelial. Em 24-48 horas, na presença de pico de C. albicans, apesar de uma resposta imune inata celular e de citoquina foi observada, não houve evidência de lesão pulmonar. Surpreendentemente, os murganhos assim colonizada com C. albicans 48 horas antes da instilação intranasal de P. aeruginosa tinham infecção atenuada em comparação com ratinhos com P. aeruginosa infecção sozinho. Euom efeito, os ratinhos exibiram menor lesão pulmonar e diminuição da carga bacteriana 12,13.

Várias hipóteses poderiam explicar o efeito benéfico da colonização prévia com C. albicans em P. aeruginosa mediada por infecção pulmonar aguda. Primeiro, um cross-talk entre espécies envolvendo cada microorganismos sistemas de sensoriamento quorum, o P. baseada homoserinelactone sistema aeruginosa e C.-base de farnesol sistema albicans, foram avaliados. Em segundo lugar, C. foi estudada albicans agindo como um alvo "chamariz" para P. aeruginosa desviar o agente patogénico a partir de células epiteliais do pulmão. Ambas as hipóteses foram invalidados (dados não publicados). A terceira hipótese era a de um "priming" do sistema imune inato por C. albicans responsável por uma resposta inata subsequente reforçada contra P. aeruginosa. Esta última hipótese foi confirmada. Na verdade C. colonização albicans levou a uma iniciação da imunidade inata atraGH IL-22, segregada principalmente pelas células linfóides inatos, resultando num aumento da depuração bacteriana e reduziu a lesão pulmonar 12.

Em conclusão, o anfitrião é um ator central na interação entre microrganismos modulação da resposta imune inata e que envolvam diferentes tipos de células inflamatórias. Embora estas interacções imunes complexas podem ser dissecados in vitro as hipóteses iniciais só pode ser fornecida por adequado em modelos in vivo. O protocolo seguinte fornece um exemplo de estudo in vivo de interacção hospedeiro-patogénio mediada que pode ser adaptado a outros microrganismos.

Protocol

A ética regionais comitê regional de experimentos com animais aprovou este método, de acordo com atenção nacional e internacional de animais e uso de diretrizes de pesquisa experimentais. Coleção 1. Amostra Armazenamento das amostras Colher todas as amostras e imediatamente armazenar a – 20 ° C ou em gelo até o armazenamento do congelador para evitar a deterioração. Coloque fosfato estéril tamponado salino (PBS) em gelo para melhorar lavagens bronco-alveolar d…

Representative Results

Como visto anteriormente durante a descrição do protocolo, o experimento precisa de cinco dias para ser concluído (Figura 1: Experiência linha do tempo). Um operador é solicitado durante toda a execução do experimento e pode lidar com os processos até um máximo de 10 ratos. Se forem necessários mais animais, duas pessoas são necessários particularmente para coleta de amostras cirúrgico. Na verdade todas as amostras devem ser recolhidos em menos de 2 horas para evitar um aumento da fuga de a…

Discussion

Modelos animais, particularmente mamíferos, são úteis para elucidar os mecanismos complexos de interacção hospedeiro-patogénio nas áreas de imunidade. Claro, a necessidade de informações obtidas somente a partir de modelos animais deve ser essenciais; caso contrário, a utilização de animais devem ser substituídos por modelos in vitro. Este modelo animal ilustra a percepção de que só pode ser fornecida por um modelo animal uma vez que a interacção entre agentes patogénicos é mediada por uma r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the “Société de Pathologies Infectieuses de Langue Française” (SPILF).

Materials

Sevorane, Sevoflurane Abott 05458-02 250 mL plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940 Berthold Technologies reference in first column no comment
Bromo-cresol purple agar Biomerieux 43021 x20 per unit
Pentobarbital sodique 5,47% CEVA 6742145 100 mL plastic bottle
2-headed valve  Distrimed 92831 no comment
Sterile inoculation loop 10 µL Dutscher 10175 x1000 conditioning
Insuline syringes 1 mL Dutscher 30003 per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 mL Dutscher 64300 no comment
Ultrospec 10  General Electric life sciences 80-2116-30 no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm  Gosselin W1773X per 100
PBS – Phosphate-Buffered Saline Life technologies 10010023 packaged in 500 mL
amikacin 1g Mylan 62516778 per 10 
Heparin 10 000 UI in 2 mL Pan pharma 9128701 x 10 per unit
RAL 555 coloration kit RAL Diagnostics 361550 3 flacons of 100 mL
1,5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 55.526.006 x  1000
Transparent 300 µL 96-well plate Sarstedt 82 1581500 no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth Sigma 95763 in powder
FITC-albumin Sigma A9771 in powder
Luria Bertani Broth Sigma L3022 in powder
25-gauge needle Terumo or unisharp A231 x100 conditioning
Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 no comment

References

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Cite This Article
Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).

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