Abstract
宿主 - 病原体相互作用を研究することは、微生物感染の間に病原性の根底にあるメカニズムを理解することを可能にしています。ホストの予後は、病原体1に対する適応免疫応答の関与に依存します。免疫応答は複雑であり、病原体およびいくつかの免疫または非免疫細胞型2との相互作用の結果である。in vitro試験は、これらの相互作用を特徴付けるおよび細胞-病原体相互作用に焦点を当てることはできません。また、特に化膿性慢性肺疾患を有するか、機械的に換気患者の患者における気道3に 、複数菌のコミュニティが存在しており、宿主-病原体相互作用を複雑にする。 緑膿菌及びカンジダ・アルビカンスは、両方の問題が頻繁に気管支サンプルから単離し、4病原体である、と特に集中治療部 5に、重症感染症に関連します。微生物の相互作用が持っていますin vitroでこれらの病原体の間で報告されたが、これらの相互作用の臨床的影響は不明6のままされて。 C。アルビカンスとPとの間の相互作用を研究するために、 緑膿菌 、CのマウスモデルP.続いアルビカンス気道の植民地化、 aeruginosa-媒介急性肺感染を行いました。
Introduction
動物モデル、特にマウスは、広範囲の病原体に対する免疫応答を探索するために使用されています。自然免疫と獲得免疫は、げっ歯類およびヒト7との間で異なるが、繁殖の容易かつ多数の遺伝子のためのノックアウトの開発は、免疫応答8を研究するためにマウスに優れたモデルを作ります。免疫応答は複雑であり、病原体の相互作用の結果、常駐微生物叢およびいくつかの免疫（リンパ球、好中球、マクロファージ）および非免疫（上皮細胞、内皮細胞）細胞の種類は2。 インビトロ研究は、観察ができませんこれらの複雑な相互作用は、主にユニークな細胞 - 病原体相互作用に焦点を当てています。動物モデルは、注意して使用し、非常に具体的で関連の質問に限定されなければならないが、マウスモデルは 、in vivoでの哺乳類の免疫応答に優れた洞察力を提供し、重要な臨床的な質問7の一部に対処することができます。
6の多数を関連付ける複雑です。構成するもの "通常の"気道microbiomeが決定されていないものの、居住者のコミュニティは、しばしば複数菌であり、多様な生態系のソースに由来します。化膿性慢性肺疾患（嚢胞性線維症、bronchectasis）の患者や人工呼吸器患者が環境に獲得した微生物9による気道の植民地に特定の植物相を示す。 緑膿菌及びカンジダ・アルビカンスは、両方の問題が頻繁に気管支サンプルから一緒に分離され、5病原体であります、特に集中治療室（ICU）4で、これらの患者における重篤な日和見感染症の責任。
P.に対する抗微生物処理におけるICU結果に急性肺炎の間にこれらの微生物の単離緑膿菌 BUT酵母は通常、このサイト5で病原性とはみなされません。Pとの間の インビトロ相互作用を緑膿菌とC.アルビカンスは、広く報告され、これらの微生物が成長し、お互いの生存に影響を与えることができるが、研究は結論付けていないことを示したされている場合はCの存在アルビカンスは、有害なまたはホスト10のために有益です。マウスモデルは 、Pのこの関連性に対処するために開発されました緑膿菌とC. 生体内で アルビカンスが、微生物間の相互作用が重要なポイントではありませんでした。実際、このモデルはCの関与を評価するために設立されました宿主免疫応答、および結果でアルビカンス 。
ルーらによって確立された以前のモデルは、すでにCで初期定着を使用しましたPによって誘発される急性肺感染が続くアルビカンス 緑膿菌は。彼らのモデルを使用して、著者らは、pの有害な役割を発見しましたrior C.アルビカンスは 11コロニー形成します。しかしルーらは、C の高負荷を使用しました3日間連続2×10 6 CFU /マウスで彼らのモデルでアルビカンス 。我々は、Cの 4日間のモデルを確立しアルビカンスは、このモデルCに、肺損傷せずに植民地化、または少なくとも持続気道アルビカンスは、マウス （ 図2B）12,13あたり10 5 CFUの単一点眼後4日までに取得されました。 4日後、炎症細胞補充、炎症性サイトカインの産生も上皮損傷の証拠は観察されませんでした。 48時間、Cのピーク存在で- 24時、細胞およびサイトカイン先天性免疫応答が観察されたにもかかわらず、肺損傷の証拠はアルビカンスなかったです。驚くべきことに、マウスは、このようにCで植民地化前Pの鼻腔内点滴注入にアルビカンス 48時間緑膿菌は 、Pを用いたマウスに比べて感染を減弱していました単独の緑膿菌感染症 。私ndeed、マウスが少ない肺損傷を示し、細菌負荷12,13を減少させました 。
いくつかの仮説は、Cで前植民地のこの有益な効果を説明することができますP上 アルビカンス 緑膿菌は、急性肺感染症を媒介しました。まず、各微生物クオラムセンシングシステム、homoserinelactoneベースのPを含む種間のクロストーク緑膿菌システムとファルネソールベースC.アルビカンスシステムは 、評価しました。第二に、C。肺上皮細胞からの病原体を流用緑膿菌のための「おとり」のターゲットとして機能するアルビカンスを検討しました 。どちらの仮説は（未発表データ）無効化されました。第三の仮説は 、Cによって先天性免疫系の「プライミング」のそれでしたP.に対する強化された後続の生得的応答を担うアルビカンス 緑膿菌 。この最後の仮定が確認されました。実際、C。アルビカンスのコロニー形成は、先天性免疫のプライミングthrouにつながりましたGH IL-22は、主に増加した細菌のクリアランスをもたらす、先天性リンパ系細胞によって分泌され、肺損傷12を減少させました。
結論として、ホストは、自然免疫応答を調節し、種々の炎症性細胞型が関与する微生物との間の相互作用の中心的俳優です。これらの複合体の免疫相互作用がインビトロで切開することができるが、最初の仮説は、in vivoモデルで適切によって提供され得ます。以下のプロトコルは、他の微生物に適合させることができる宿主媒介病原体相互作用の in vivo研究の例を提供します。
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Protocol
動物実験のための地域の倫理委員会は、地域の治験研究指針における国内および国際的な動物のケアと用途に応じて、この方法を承認しました。
1.サンプルの採取
- 試料保存
- 劣化を避けるために、冷凍保存まで20℃または氷上で - で保存してすぐにすべてのサンプルを収集し。気管支肺胞洗浄液（BAL）の性能を向上させるために、氷上で滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）を置きます。
- 手術
- オートクレーブを使用して、すべての手術用機器を滅菌します。
注：可能な場合は、交差汚染を避けるために、腹部と胸部のステップのための機器の二つの異なるセットを使用することをお勧めします。必要な解剖装置は、図4（a）に詳述されています
- オートクレーブを使用して、すべての手術用機器を滅菌します。
2.マウス、細菌や酵母株
- 再における動物の局所的な使用に準拠したハウスマウスバイオセーフティーレベル2微生物の使用にバイオセーフティーレベル2収容施設で、食料や水アドリブで、ケージあたり5匹を超えることなく換気ラック内検索委員会のガイドライン：P。緑膿菌とC.アルビカンス。
- 40％のグリセロール培地中で-80℃で細菌株を保管してください。
- 10μlの接種ループを使用して滅菌LB培地の3ミリリットルを含む培養チューブに凍結ストックから直接細菌を追加します。軌道点眼前日（400 rpm）し振とうしながら37℃でN / Oのままにしておきます。
- 5分間2000×gで遠心分離することによって収穫細菌。
- 適切なクローズドバイオハザード廃棄物処理に上清を吸引除去します。培養管の底に白い付着ペレットを観察します。
- 5mlのPBSを使用してペレットを洗浄し、一時停止。
- 繰り返して、第二の洗浄を行うための第2の時間を2.2.3する2.2.2を繰り返します。
- 1mlのPBSを使用してペレット化した細菌を再懸濁し簡単なボルテックス。
- 光学濃度計を用いて600nmでの光学濃度計を使用して、接種密度を決定します。 0.9の密度は、PAO1 10 9 CFU / mlに相当し、それに応じて希釈します。
注：この結果は、較正された接種物の連続希釈物の濃度を決定することによって、各使用した株について得られなければなりません。 - シリアル対数希釈液によって接種物を確認し、ブロモクレゾールパープル寒天（BCP）プレートとO / N培養上の各希釈液100μlをプレート。鼻腔内に1mlあたり1×10 8〜2×10 8 CFU（マウスあたり5×10 6〜1×10 7 CFU）を含む溶液50μlを各マウスを管理します。
- 使用C.参照株としてアルビカンス SC5314。 -80℃で40％グリセロール培地中で株を節約。
- 0.015％のアミカシンとサプリメント酵母ペプトンデキストロースブロス細菌汚染を回避し、さらに数を容易にします。
- および10を使用して酵母を追加＃181; 37℃でアミカシン、O / Nで補充準備YPDブロスにリットル接種ループ。
- 5分間2000×gで遠心分離することによって収穫酵母。
- 適切なbioharzardの廃棄物処理に上清を取り除きます。ホワイト付着ペレットは、培養管の底部に観察されるはずです。
- 洗浄し、PBSと簡単なボルテックスの5ミリリットルを使用してペレット化した細菌を一時停止します。
- 繰り返して、第二の洗浄を行うための第2の時間を2.2.3する2.2.2を繰り返します。
- PBSおよび簡単なボルテックスの1ミリリットルを使用してペレットを再懸濁。
- 40倍の倍率で、標準的な顕微鏡を用いてMallassezの血球にカウントすることにより、接種物のサイズを決定します。
注：（酵母の数×10 5）/（Mallassezの血球のカウントグリッド矩形の数）：（CFU / ml単位）の濃度は、以下の式を用いて得られます。 - そのソリューションが含まれているを確認するために10 -5、10 -6シリアル対数希釈することによって確認し、2×10 6 CFU / mlです。
- 0.015％のアミカシンを補ったYPD寒天プレート上にプレート。
C. 3.航空植民地化アルビカンス
注：環境順応後、マウスを一日二回秤量します。
- ヒュームフードの下では、4センチメートル×4センチガーゼ（オープン・ドロップ技法）14へのセボフルランの預金を500μl。
- すぐに約750ミリリットル導入室の床の上にガーゼを置きます。すぐに動物とガーゼの間の直接接触を避けるために、ガーゼの上にメッシュ上げプラットフォームを配置します。
- 気密蓋を閉じて、チャンバ内のセボフルランの拡散を可能にするために、1〜2分待ってください。
- プラットフォームと開閉蓋を噛み合うようにケージからマウスを転送します。保存された自発呼吸と軽い麻酔は30〜45秒で達成されるべきです。
- マウスをf除去することができる点で、正向反射の消失を観察することにより、低血圧を監視ボックスをROMや点眼。
- 鼻腔内点滴注入（訓練を受けたオペレータにより10秒で実行することができます）。
- 片手が（ 図4B）直立開催の背中に囲まれ、マウスを押したままにします。
- 人差し指を使って、頭をサポートし、顎を維持するために親指を使用喀出（ 図4C）を回避するために、閉鎖しました。
- ステップ2.3.8で説明したように、準備されたCのことを確認してくださいアルビカンスソリューションは、ボリュームを点眼50μlのための1mlあたり2×10 6 CFUを含んでいます。
注：第2の臨界点は、点眼ボリュームです。ボリューム下の50μlを不十分植民地化や気道の不均一な点滴をもたらす可能性よりも、より大きなボリュームは溺死/窒息と死を誘導する可能性があります。 - 鼻孔にピペットに接近することにより、マウスの鼻腔内を浸透さ。
- その後spontaneouslによって吸入鼻の溶液を含む泡を形成する50μlのドロップを、ピペットY呼吸マウス。
- リカバリ領域に入れマウス（例えば、オーバーヘッド加熱ランプを持つ大規模な、よく通気裸ケージ）。マウスは完全に覚醒するまで監視する必要があります。それは胸骨横臥し、立ち直り反射を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。この時点で、マウスは、通常の住宅ケージに戻すことができます。
4. P.緑膿菌誘発性急性肺感染
注：マウスは、4つの次の日中に秤量します。通常、マウスは 、Cの間に体重が増えますアルビカンス媒介気道コロニー形成（ 図2A）。
- Pを含有する懸濁液を準備緑膿菌 O / Nの成長（2.2節）後の点滴の日。
- 前述したように（セクション3.1）吸入セボフルランを使用して簡単に麻酔。
注：急性肺感染症を実行するために提案されている細菌負荷を推奨表1。 - ポスト点眼回復に特に注意して（セクション3.2）のようにマウスを浸透さ。
肺損傷指数の5測定
- FITC標識アルブミンを含む溶液を調製します。殺処分する前に、この溶液2時間を注入。
- 適切な機器とアルブミン-FITCの0.2 mgの計量。
- 1mlのPBSに0.2ミリグラムを追加します。簡単に言うと渦。すぐに使用しない場合は、周囲光への暴露を避けるために、ホイルにソリューションを配置します。
- 各マウスにFITC標識アルブミン溶液の腹腔内に200μLを注入します。
- 安楽死
- 最後の重量データのためのマウスを秤量します。
- 5.47パーセントのペントバルビタールを300μl：ペントバルビタールの致死過剰摂取の腹腔内注射を用いた研究委員会のガイドラインにおける動物の局所的な用途に応じて、単一のマウスを安楽死させます。
- ケージからマウスを削除し、Lを受け取りますオペレータによるethal注入。
- 注入後、任意の他の動物から隠さ別のケージに単独でマウスを転送します。運動の不在になるまでマウスを観察します。死を確認して動き、特に呼吸運動、パルスの欠如が存在しないことです。
- したがって、麻酔薬や鎮痛剤なしで、死んだ動物のサンプルを外科的にコレクションを実行します。
- 外科サンプル収集：胸部ステージ。
注：無菌状態を維持するために、すべての手術は、バイオセーフティーレベル2環境で滅菌装置を用いて行われます。- 皮膚にエタノールを適用します。ハサミで半ば腹部に胸骨から正中皮膚切開を行います。いずれかの側の胸郭に沿って正中切開から。胸郭を視覚化するために胸部の両側に皮を折り返します。
- どちらの側が船尾で全体の前部胸壁をリクライニングすることができるように、鎖骨に向かって行く上で胸郭の縦切開を行いますええと心臓や肺（ 図5A、5B）の完全な可視化を可能にします。
- 心室間の動脈の隣に心穿刺によって事前にheparined注射器を用いて血液を採取します。プラズマの少なくとも100μLを得るために、500μlの最低を撤回。氷上で血液サンプルを置きます。
- 気管（ 図5B及び5C）を可視化する正中頸部切開を行います。慎重に気管の周りの筋膜を切開します。気管（ 図5Cおよび5D）の背後に縫合糸を配置します。その後縫合糸は、適切な洗浄を確実にするためにカニューレ挿入針の周りに閉じられます。
- 20-Gを使用して気管をカテーテルを挿入強制経口投与針（ 図5Dおよび図4（a））を修正しました。以前に配置された縫合糸を挿管気管の周りに外科的な結び目を作ります。
- 気管支肺胞洗浄（BAL）を実行するには、静かに徐々に肺からの/への氷冷PBSを500μlを注入し、描画します。私にサンプルを置き、細胞溶解を回避するために、CE。
- 2ミリリットル遠心管（ 図5E）に1,500μlのBAL液とプール洗浄試料の合計を取得するための手順を繰り返し5.3.6、3回。
- 胸から肺を取り出します。 80°C - 1.5ミリリットル遠心管に（サイズが1肺またはローブの半分に対応する必要があります）とで急速に保存肺のセグメントを配置します。
- 細菌負荷を決定し、氷の上に置くために、PBSを含む予め秤量した溶血チューブに肺のセグメントを配置します。
- 外科サンプル収集：腹部のステージ。
- 腹部の左側に別の切開を行います。腹膜を介して脾臓を守ってください。
- 氷上で1mlのPBSと場所を含む第二の溶血管に脾臓と場所を削除します。
- 肺損傷指数
注：肺胞毛細血管膜透過性は、肺胞 - interstに血管区画からのFITC標識アルブミンの漏出を測定することによって評価されますitialコンパートメント。- 遠心血液サンプルと1500×gで10分間のBAL液。新しい遠心チューブに上清を収集します。ペレットは、血漿またはBAL細胞を動員し、氷上に置かれるべきである対応します。
- 96ウェル透明板（300μlのウエル）に各血液上清（血漿、黄色）、またはBALの上清100μlを追加します。すぐに使用しない場合はプレートに箔を置きます。
- 血漿中の蛍光レベルを測定し、BALは、蛍光マイクロプレートリーダー（励起、487 nmで、発光520 nm）を用いて上清。
- 蛍光比を計算することにより、肺損傷指数を決定[（BAL上清/血液上清）×100]。
- 気管支肺胞洗浄（BAL）の細胞計数差動。
注：ステップ5.5.1でBAL液の遠心分離から得られた細胞ペレットを使用してください。- 必要に応じて、赤血球溶解緩衝液を使用。セルを含む遠心管に赤血球溶解緩衝液500μlを加えますLペレット。簡単に言うとボルテックスし、氷上で10分のままにしておきます。赤血球の溶解を停止するために500μlのPBSを追加します。
- 1,500×gで10分間の遠心分離によって細胞を回収。上清を除去し、滅菌PBS 1 mlの中に細胞ペレットを中断。 Mallassezの血球の細胞を列挙します。セルをカウントする血球計算盤を使用しました。サイトスピンでスライド上の細胞を濃縮します。
- セル識別および計数（マクロファージ、リンパ球、好中球）を可能にする着色キットを用いて染色細胞。
- 肺細菌負荷および細菌普及
注：肺細菌負荷を評価するために、細菌の普及、肺および脾臓をそれぞれ1mlのPBS（ステップ5.3.9）を含む予め秤量した溶血チューブに収集し、保存しました。- 1mlのPBSおよび肺または脾臓のいずれかを含む溶血管を計量。肺ホモジネートおよび脾臓ホモジネートを得るために、組織ホモジナイザーを用いてサンプルを均質化します。
- デポジット組織ホモ100μlのシリアル対数希釈液を得るために、無菌のPBS 900μLを含む遠心チューブにgenates。
- Pの BCP寒天のいずれかのプレート2の最後の適切な希釈した試料（10 -3および10 -2） Cの 緑膿菌やYPD-アミカシン補充寒天アルビカンス肺および脾臓負担決意。
- 37℃でプレートO / Nインキュベートします。翌日、プレート上のコロニーを列挙。
- インデックス肺重量の結果は、肺のグラム当たりのCFUを得ました。肺サンプルサイズが同じではない、その結果、肺のグラム当たりのCFUで表現する必要があります。
インデックスの計算式は次のとおりです。[CFU]×[溶血管と肺の重量] - [溶血管の重量]。
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Representative Results
プロトコル記述中に以前に見られるように、実験は、（：実験のタイムライン図1）を完了するために5日必要があります。一人のオペレータは、実験の全実行中に募集され、最大10匹のマウスの最大のプロセスを処理することができます。多くの動物が必要な場合は、二人は、特に外科用サンプル採取のために必要とされます。実際、すべてのサンプルは、最後のマウスでのFITC標識アルブミンの増加パッシブ肺胞毛細血管の漏れを回避するために、2時間の下で収集されなければなりません。
最初のステップは、Cの製造でありますCで気道コロニー形成を得るためにアルビカンス接種材料と鼻腔内点滴注入アルビカンス 。 4日永続性モデルはCの 5×10 5 CFUの鼻腔内点滴注入することによって得られますマウスあたりアルビカンス （ 図2B）。これらの4日の間に、マウスは体重（ 図2A）および 5×10 5 CFUの点滴リットルを誘導しないを得ますUNG損傷（ 図2C）。 C.が、 アルビカンスがこのモデルで最大4日間持続することが、負荷が48時間後に減少しています。したがって、P。緑膿菌誘発性急性肺感染はCの 48時間後に施行していますアルビカンスの永続性 。
臨床肺の75％が15を分離すると緑膿菌 PAO1株は、主要な毒性因子、タイプ三分泌系（T3SS）を含む大部分は特徴付け実験室株です。論文の理由から、PAO1は、急性肺感染症の動物モデルにおいて関連株です。肺損傷、肺損傷の指標として表現気道内に血管区画からのタンパク質のリークにより測定歯茎capillar透過性によって評価されます。接種材料（ 図3A）と肺損傷が大きくなります。ここでは、前にせず、単独で（ 図3B-3F）（5×10 6 CFU /マウス）PAO1株により誘導された我々のモデルの急性肺損傷成分の動態を報告C.は、媒介プライミングをalbicans-。モデルのひずみと時間経過、初期Pの選択に応じて緑膿菌接種は、次のセクションで説明されており、 表1に提案されています。
グループあたり5匹のマウスを用いました。肺傷害値（ 図3B）、肺の中の細菌負荷（ 図3C）、脾臓中の細菌負荷は、細菌の普及（ 図3D）を反映し、BALの細胞性（ 図3E）と差動細胞数（ 図3F）は 、すべての12を決定しました時間。肺損傷は、感染（ 図3B）後24時間と36時間の間で最大でした。細菌負担は1ログCFUを示した/ 24時間毎（ 図3C）を減少させるmLです。脾臓ホモジネート培養によって評価累計細菌普及が毎日（ 図3D）の増加となりました。最後に、非感染マウスにおけるBALの細胞性は、主に（90％）で構成されているが、O感染マウスからのBAL中のF肺胞マクロファージ、好中球は、広く採用された、差動細胞数は90％の好中球及び10％のマクロファージおよびリンパ球（ 図3E、3F）を示しました 。
℃の間 、宿主媒介相互作用を探検する急性肺損傷モデルの図1.タイムライン アルビカンス と P. 緑膿菌。
手順全体のグラフィック表現。最初のステップは、住宅施設のマウスの環境適応したものです。第二段階は、Cです。アルビカンスは、気道コロニー形成を媒介します。最後に、第3のステップはP.によって媒介される急性肺感染症であります緑膿菌 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. C.アルビカンス 気道植民地化。
（A、B）マウスを鼻腔10 5 CFU Cで滴下していますアルビカンス （株SC5314）。マウスは 、Cの間に体重が増えますアルビカンス媒介気道コロニー形成（A）。気道のコロニー形成は一初期点滴で3~4日間まで延長することができます。以前の研究では、自然免疫のプライミングは、24と48時間の間で行われます。 （群あたりn = 5）、エラーバーは平均±SDを表します。 Cの （C、D）マウスを鼻腔内に点滴注入された5×10 5または5×10 6 CFU アルビカンス 。 24時間後に肺胞毛細血管関門透過性によって評価肺損傷の指標（C）。体重増加（D）は、初期重 量（群あたりn = 5）のパーセントとして表しました。エラーバーは、平均±SDを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
緑膿菌 によって誘導される急性肺損傷の図3モデル 。
（A）C57BL / 6Jマウスに鼻腔内にPの増大する負荷に感染しています（マウス当たり1×10 6 7 5×10 CFUから） 緑膿菌 （群当たりn = 5）、エラーバーは平均±SDを表します。マウスは、24時間で安楽死させます。肺損傷指数は、細菌の負荷に比例して増加する肺胞毛細血管関門透過性によって評価されます。肺損傷指数はグレーのバー（気管支肺胞洗浄液上清を用いて、肺ホモジネート上清（黒いバー）と古い方法と新しい組み合わせ法を用いて得られるの比較単数または複数）（BF）マウスは、鼻腔内に、マウスあたり5×10 6 CFUを感染させます。マウスは、急性損傷モデル動態へのすべての12〜48時間を安楽死させます。肺損傷（B）、肺の細菌負荷（C）、脾臓の細菌負荷（D）、気管支肺胞洗浄（BAL）細胞性（E）及びBAL示差細胞数（F）もまた評価されます。 （n = 5）でグループごとに、エラーバーは、平均±SDを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.手術装置および鼻腔内点滴注入。
（A） 急性損傷モデルおよび気管支肺胞洗浄を実行するために必要な手術用機器。ここで気管カニューレ（20G）と2つの1 mlの注射器をルアーロック三方弁に接続されています。一つはバックアウト肺から気管支流体を描画するために、肺に水を注入するための一つの注射器。 （B、C） 鼻腔内点滴注入を実行するために手にマウスの位置。この写真では、顎の下の親指が点滴中に、閉じた口を確実にします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.手術および気管支肺胞洗浄。
胸は広く（A）が開放され、胸郭心臓（B）への損傷を回避するために横方向に開放されます。採血後、子宮頸部領域は気管（C）を露出させるために切開されます。デンタルフロスは、以下のように使用されています縫合糸とは、気管（C、D）の後ろに渡されます。気管は、シリンジと三方弁に取り付けられた（D）を合わせ、20 Gカニューレでカニューレを挿入します。気管をしっかりと気管の後ろの場所に縫合糸を使用して、外科的結び目を結ぶことにより、カニューレの周りに固定する必要があります。最後に、500μlのPBSを静かに肺に点滴注入され、その後、BALを静かに引き出されています。 （E）流体・点眼肺。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 最小点眼負担 | 最大点眼負担 | |
| T3SS- | 5×10 7 | 1×10 8 |
| T3SS + | 5×10 6 | 1×10 7 |
| T3SS + exoU + | 5×10 | 1×10 5 | |
表1. P.緑膿菌 接種は、急性肺感染モデルで使用されます。
接種の推奨最適な鼻腔内濃度は、株に応じて急性肺損傷を誘導しました。
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Discussion
動物モデル、特に哺乳動物は、免疫の分野における宿主 - 病原体相互作用の複雑なメカニズムを解明するのに有用です。もちろん、唯一の動物モデルから得られる情報の必要性が不可欠である必要があります。そうでなければ、動物の使用は 、in vitroモデルに置き換えなければなりません。この動物モデルは、病原体の間の相互作用が多成分宿主応答によって媒介されるので、唯一の動物モデルで提供することができる洞察を示しています。現在、この宿主 - 病原体の相互作用を研究するために使用したマウスは、成熟と変化していない免疫応答で6〜10週齢の若年成人です。先天性免疫応答に着目した場合、のC57Bl6 / Jバックグラウンドマウスが好ましいです。セックスと免疫応答のホルモンサイクル（特にエストロゲン）の影響を回避するために、男性はそのための最良の選択です。統計的有意性を達成するために、グループは、実験の終了時に、少なくとも5個体を持っているが、すべての動物experimenによって示唆されるようにしなければなりませんテーションのガイドラインは、使用する動物の数は、厳格な最小限に低減し、洗練されなければなりません。
研究施設に動物を提供するブリーダーからの交通は、マウスにストレスを誘発します。結果は、私たちのように、次の実験を変更することができる炎症性サイトカインの分泌が増加します。また、新しい環境、新しい「ケージメイトは「ストレスに貢献します。その結果、マウスは彼らの新しい住宅環境で勉強する前に少なくとも7日間順応させなければなりません。この住宅環境は、標準的な食料と水アドリブ、昼/夜サイクル、および適切な安定した湿度と温度を提供し、制御されなければなりません。
両肺のコロニー形成および肺感染モデルは、練習と器用さを必要とします。点滴は、鼻腔内または気管内に行うことができます。後者は、より困難であり、無酸素による心停止のリスクが高いに研修を通じ大きな専門知識を必要とします。実際、PRocedureが正常未満15秒でマウスを挿管し、したがって、より深い麻酔を必要とする必要があります。投与経路は、よりリスクの少ない必要と軽い麻酔アクセス可能であり、したがって、より再現性があるため、鼻腔内点滴注入の私たちの選択は、実行する方が簡単です。
Boutoille らは既にFITC標識されたアルブミン16を用いて肺胞毛細血管関門透過性を測定することを通じ、急性肺傷害モデル、肺損傷の特に評価を記載しました。実験当たりのマウスの数を減らすために、この方法は、適合および気管支肺胞洗浄（BAL）とカップリングさせました。 Boutoille らの研究では、我々は、肺ホモジネート上清中のFITC標識アルブミンの蛍光および血液上清17との間の比較を使用します。
完全にこの比較を行うために、ヘモグロビンレベルおよびヘマトクリットレベルはまた、必要とされます。この方法は、アロに適応させました均質化および肺損傷の評価と洗浄と宿主応答の研究に他の1つの肺を捧げることによって宿主応答の付随的分析ワット実際に、BAL液は、サイトカインレベル、タンパク質分泌および細胞動員を評価することができます。私たちの適応は、動物実験ガイドラインで推奨されているようにノックアウトマウス17を使用する場合は特に、コストやマウスの必要数を減らすこと、単一の動物実験からより多くの結果を提供します。また、肺の一部は、全RNA抽出および定量的ポリメラーゼ連鎖反応または組織学的分析を行うために-80°Cに維持されます。従来の方法とBALと相まって新たな適応方法との比較は、比較可能な結果（ 図3A）が肺傷害の指標を評価することを示しています。
Mear らの研究では、同様の手順を用いて、フローサイトメーター分析BAL液を遠心分離して得たBAL細胞で行いました。同様のAnalysesは、肺12からの全肺細胞で実施しました。この場合、FITC標識アルブミンと肺損傷の評価が原因で、FITC（緑色蛍光タンパク質と同じチャンネル）によって誘発されるアーティファクトに、同時に実行することはできません。フローサイトメトリーが必要な場合はそのため、実験では、それに応じて計画されなければなりません。
安楽死のタイミングは非常に重要です。最初の72時間にわたる急性肺感染モデルの時間経過は、 図3に示されている。このモデルでは、肺損傷と宿主応答のアクメ（3図 ）24時間の間と36を発生します。したがって、我々の設計で24時間のエンドポイントは3つの理由のための読み出しとして選択した：第一に、それは、第2に、最終的に24と36時間との間の死亡率にマウスの損失を回避するために、実験室で整理することが容易であり、ホスト応答がこの時点で最大であったためです。
私たちの相互作用の研究の最初のステップは、と気道の植民地です<em>のC。アルビカンス。マウス当たり10 5 CFUの点眼を使用して、4日間の永続化モデルは、任意の肺損傷することなく得られます。実際には、マウスは、このフェーズの時間にわたって体重が増えました。感染とは対照的に、体重増加は植民地化に沿った損傷のない状態の有用な指標です。確かに、増加した初期負荷（マウスあたり10 6を超えるCFU）誘発肺傷害（ 図2C）とケースマウスは体重を失っているこれまでのプライミングを超えた有害な宿主応答、（ 図2D）。逆に、小さい初期負荷（マウス当たり例えば10 4 CFU）気道永続化モデルを得ることができなかったを使用して。したがって、Mear ら 12によって記載さ宿主免疫の観察されたプライミングを得るために、点眼真菌負担のキャリブレーションが成功するために重要であり、重量曲線を監視することは重要なコントロールです。
同じ精度は 、P。のために必要とされます緑膿菌 P.を誘発しません緑膿菌は、速やかに適切な宿主応答によって気道からクリアされます。過度に高い初期Pを使用して緑膿菌は宿主防御の能力を超えた、あるいは負荷が生じ不適切とderleterious応答を誘導します グループ間のすべての違いを消去する大規模な急性損傷や死亡につながります。急性の傷害を誘導するための最適な接種物は、機能性3型分泌系（T3SS）外毒素及びUの製造、宿主細胞の細胞質へのT3SSによって転毒素の存在に依存します。これら二つの系統固有の属性は、最初の細菌負荷の選択に考慮しなければなりません。初期の細菌の負担がT3SS陰性または陽性の株で急性肺損傷を誘発する下限と上限の例、および外毒素Uまたはない（ 表1）の製造株として、この記事で提案されています。勉強するときT3SSの関与は、株は、O / Nを成長させ、接種材料の調製はT3SSの最適な活性を得るために、前に新しいLB培地で3時間で復活する必要があります。
P.後の細菌および真菌負担24時間の決意緑膿菌誘発性肺感染は、このセクションで説明する具体的な配慮を必要とします。示すように、マウスを5×10 6 CFU T3SS陽性株に感染したとき確かに、24時間の意志で肺内の細菌負荷は約1ログ（ 図3C）に減少しました。サンプルの連続希釈を5対数希釈まで行い、BCP寒天プレート上にプレーティングする必要があります。 C.について肺の中のアルビカンスは 、72時間で、真菌の負担は約2ログに減少し、サンプルは、コロニーの識別を容易にするために、アミカシンを補ったYPD寒天上にプレーティングされるようにしなければなりません。最後に、細菌の播種の決意は、BCP寒天上に血液試料100μlのメッキにより、または脾臓hの100μLをめっきすることによって評価することができます同じ媒体上omogenates。二つの方法は、すでに比較された脾臓培養は、より正確であると思われます。確かに、脾臓は「フィルタ」全血とは、「集中」と血の上に播種した細菌を節約することが器官です。このように、脾臓ホモジネートは、血液よりも高い感度で急性肺感染の間の全身細菌普及を反映しています。血液サンプルは、非常に特定の所定の時間に細菌普及を表し、真に全体として細菌普及の現象を反映していない場合があります。したがって脾臓ホモジネートの培養物が好ましいです。
肺損傷指数は、感染および/または不適切な宿主応答し、これらのコンポーネントの潜在的な治療薬の効果に起因する肺損傷の敏感な評価です。さらに、この中VIV Oモデルは、ホストの応答を研究するために、いくつかの異なるサンプルの収集を可能にします。肺は、RNA抽出および解析のために使用することができ遺伝子転写の。肺のサンプルはまた、組織学的観察とパラホルムアルデヒド（PFA）中に入れることができます。 BAL液は、炎症性サイトカインのようなタンパク質の分泌を評価するために使用することができます。最後に、プロトコル上述したように、フローサイトメトリー分析のためのサンプルを提供するように適合させることができます。
最後に、このプロトコルは 、C を modelizeに適合させることができますこのような黄色ブドウ球菌 18または腸内細菌などの人工呼吸器関連肺炎に関与albicans-微生物の相互作用。別の適応ではなくCの細菌を用いた気道コロニー形成可能性がありアルビカンスは、気管支拡張症などの慢性化膿性肺疾患における細菌相互作用をmodelizeする。免疫適格マウスにおける細菌クリアランスが永続的な気道コロニー形成を許可していないので、この目的を達成するために、免疫不全マウスは、使用されるようにしています。
点滴のために、動物を保持している手の位置はCRIですtical。鼻腔内にマウスを浸透させる際に、既に、前のセクションで下線が引かれたように、オペレータは、その口は液の喀出を回避するために、完全に閉鎖されるようにする必要があります。親指が顎をサポートしており、全体の点滴手順（ 図4B）の間に閉じた口を維持しています。その後、もう一方の手で、ピペットを徐々に穏やかに気泡の形成を防止するために空気なし点眼鼻孔（ 図4C）、その溶液上に堆積されます。明らかに、点滴は、レベル2のバイオセーフティキャビネット内で実行する必要があります。
サンプルの収集は、オペレータのcertifed小動物の外科的訓練が必要。各ステップにおいて、試料は細胞溶解を回避し、変性からタンパク質を維持するために氷の上に配置されなければなりません。基本的な手術器具は、（ 図4A）が必要です。それらは、使用前にオートクレーブ滅菌されるようにしなければなりません。これは、異なる手術器具セットは開腹に使用することをお勧めしますl及び胸部外科手術手順、肺サンプルの交差汚染を回避します。外科的切開の異なる重要なステップは、（ 図5A-5E）提示されています。マウスの位置が重要です。それは、オペレータとストレートからヘッド反対背中に動物が平らに固定化されるべきです。エタノールは自由に皮膚からのサンプル中の髪の広がりと可能性細菌汚染を避けるために、最初の切開の前に準備するために使用する必要があります。皮膚は十分に血管新生であり、出血（ 図5A）を避けるために慎重に後退させなければなりません。
そして、胸郭は胸郭が常に切開中に心臓や肺の損傷を避けるために、ピンセットグリップに維持されるべきで、その間横胸部切開次リクライニングされます。肺と心臓は（ 図5B）が露出されています。感染していない肺（図5B）白っぽく見えます。頚部の解剖は、気管を露出し、縫合糸は車ですefully上部の気管（ 図5C）の後ろに配置。気管カニューレ挿入することは慎重に行わなければなりません。特大のカニューレを使用しないでください（最大サイズは20、Gです）。 2軟骨環の間の膜性気管の小さな前方切開は、カニューレを挿入することができます。カニューレは、竜骨（ 図5D）上記気管を通して透明で観察したときに、縫合糸をしっかりとカニューレ（ 図5E）の周りに固定する気管の周りに結ばれます。カニューレは、ポートに接続された雌2シリンジとの3ウェイ雄型ルアーロック弁に接続されています。一つの注射器は、気管支肺胞洗浄用の氷冷PBSを含んでいます。他には、BAL液を引くために空になっています。これらの注射器は、グループ間でchagedする必要があります。
結論として、急性肺傷害モデルの前にプライミングすることは、病原体との間に生体内宿主媒介相互作用に探索する適切かつ強力なモデルです。動物の使用であります主な制限、慎重に、in vitroで入手可能な情報と比較検討する必要があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sevorane, Sevoflurane | Abott | 05458-02 | 250 ml plastic bottle |
| Fluorescence Reader Mithras LB940 | Berthold Technologies | reference in first column | no comment |
| Bromo-cresol purple agar | Biomerieux | 43021 | 20x per unit |
| Pentobarbital sodique 5.47% | CEVA | 6742145 | 100 ml plastic bottle |
| 2-headed valve | Distrimed | 92831 | no comment |
| Sterile inoculation loop 10 µl | Dutscher | 10175 | x1,000 conditioning |
| Insuline syringes 1 ml | Dutscher | 30003 | per 100 conditioning |
| 2 positions Culture tube 8 ml | Dutscher | 64300 | no comment |
| Ultrospec 10 | General Electric life sciences | 80-2116-30 | no comment |
| Hemolysis tubes 13 x 75 mm | Gosselin | W1773X | per 100 |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life technologies | 10010023 | packaged in 500 ml |
| amikacin 1 g | Mylan | 62516778 | per 10 |
| Heparin 10,000 UI in 2 ml | Pan pharma | 9128701 | 10x per unit |
| RAL 555 coloration kit | RAL Diagnostics | 361550 | 3 flacons of 100 mL |
| 1.5 ml microcentrifuge tube | Sarstedt | 55.526.006 | x 1000 |
| Transparent 300 µl 96-well plate | Sarstedt | 82 1581500 | no comment |
| Yest-peptone-Dextrose Broth | Sigma | 95763 | in powder |
| FITC-albumin | Sigma | A9771 | in powder |
| Luria Bertani Broth | Sigma | L3022 | in powder |
| 25-gauge needle | Terumo or unisharp | A231 | x 100 conditioning |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | no comment |
References
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