Abstract
Studera värdpatogen interaktion ger oss möjlighet att förstå de bakomliggande mekanismerna för patogeniciteten under mikrobiell infektion. Prognosen i den mottagande beror på medverkan av en anpassad immunsvar mot patogenen 1. Immunsvar är komplex och resultaten från samverkan mellan patogener och flera immun eller icke-immuna celltyper 2. In vitro-studier kan inte karaktärisera dessa interaktioner och fokusera på cell patogen interaktioner. Dessutom, i luftvägarna 3, särskilt hos patienter med varig kronisk lungsjukdom eller i mekaniskt ventilerade patienter, polymikrobiella samhällen förekommer och försvåra värdpatogen interaktion. Pseudomonas aeruginosa och Candida albicans är både problem patogener 4, ofta isolerade från trakeobronkiala prover, och associerad med svåra infektioner, särskilt i intensivvårdsavdelning 5. Mikrobiella interaktioner harrapporterats mellan dessa patogener in vitro men den kliniska effekten av dessa interaktioner är fortfarande oklart 6. Att studera samspelet mellan C. Albicans och P. aeruginosa, en murin modell för C. albicans airways kolonisering, följt av en P. aeruginosa- medierad akut lunginfektion utfördes.
Introduction
Djurmodeller, speciellt möss, har i stor utsträckning använts för att undersöka immunsvar mot patogener. Även medfödda och förvärvade immuniteten skiljer mellan gnagare och människa 7, den lätthet i avel och utveckling av knockouts för många gener, göra möss en utmärkt modell för att studera immunsvar 8. Immunsvaret är komplex och resultat från interaktionen mellan en patogen, bosatta mikrobiella flora och flera immun (lymfocyter, neutrofiler, makrofager) och icke-immuna (epitelceller, endotelceller) cellulära typer 2. In vitro-studier tillåter inte iaktta dessa komplexa interaktioner och främst fokusera på unika cell-patogen interaktioner. Även djurmodeller måste användas med försiktighet, och begränsad till mycket specifika och aktuella frågor, musmodeller ger en god inblick i däggdjuret immunsvar in vivo och kan ta itu med delar av kliniska viktiga frågor 7.
6. Medan vad som utgör en "normal" luftvägs microbiome återstår att bestämmas, bosatta samhällen är ofta polymikrobiella, och kommer från olika ekologiska källor. Patienter med varig kronisk lungsjukdom (cystisk fibros, bronchectasis) eller mekaniskt ventilerade patienter uppvisar en viss flora på grund av kolonisering av luftvägarna genom miljö förvärvade mikroorganismer 9. Pseudomonas aeruginosa och Candida albicans är både problem patogener 5, ofta isolerade tillsammans från trakeobronkial prover och ansvarig för svår opportunistisk infektion hos dessa patienter, särskilt i intensivvårdsavdelning (IVA) 4.
Isolering av dessa mikroorganismer under akut lunginflammation i ICU resulterar i antimikrobiell behandling mot P. aeruginosa But jäst brukar inte vara patogena på denna webbplats 5. In vitro-interaktioner mellan P. aeruginosa och C. albicans har fått stor uppmärksamhet och visade att dessa mikroorganismer kan påverka tillväxt och överlevnad varandra men studier kan inte avgöra om förekomsten av C. albicans är skadligt eller välgörande för värden 10. Musmodeller har utvecklats för att ta itu med denna relevans P. aeruginosa och C. albicans in vivo, men samspelet mellan mikroorganismer var inte den viktigaste punkten. I själva verket var den modell som inrättats för att utvärdera medverkan av C. albicans i värdens immunsvar, och utfall.
En tidigare modell som fastställts av Roux et al används redan en initial kolonisering med C. albicans följt av en akut lunginflammation inducerad av P. aeruginosa. Med hjälp av deras modell, författarna hittat en skadlig roll plägsen C. albicans kolonisering 11. Men Roux et al använde en hög belastning av C. albicans i deras modell med 2 x 10 6 CFU / mus under 3 dagar i följd. Vi etablerade en 4-dagars modell av C. albicans luftvägs kolonisering, eller åtminstone uthållighet utan lungskada, I denna modell C. albicans hämtades upp till 4 dagar efter en enda instillation av 10 5 CFU per mus (Figur 2B) 12,13. Efter 4 dagar, inga tecken på inflammatorisk cellrekrytering, inflammatorisk cytokinproduktion eller epitelskada observerats. Vid 24-48 timmar, på toppen förekomsten av C. albicans, även om ett cellulärt och cytokin medfödda immunsvaret observerades, det fanns inga tecken på lungskada. Överraskande, möss sålunda koloniserade med C. albicans 48 h före intranasal instillation av P. aeruginosa hade försvagat infektion jämfört med möss med P. aeruginosa infektion enbart. jagndeed, möss uppvisade mindre lungskada och minskad bakteriell belastning 12,13.
Flera hypoteser kan förklara detta gynnsamma effekten av tidigare kolonisering med C. albicans på P. aeruginosa medierad akut lunginflammation. Först, en mellan arter överhörning omfattar varje mikroorganismer beslutför analys system, den homoserinelactone baserade P. aeruginosa systemet och farnesol baserade C. albicans systemet utvärderades. För det andra, C. albicans fungerar som en "lockbete" mål för P. aeruginosa avleda patogenen från lung epitelceller studerades. Båda hypoteser ogiltig (opublicerade data). Den tredje hypotesen var att en "priming" av det medfödda immunförsvaret av C. albicans ansvarig för en förbättrad efterföljande medfödd respons mot P. aeruginosa. Denna sista hypotes bekräftades. Faktiskt C. albicans kolonisationen ledde till en priming av medfödd immunitet through IL-22, främst utsöndras av medfödda lymfoidceller, vilket resulterar i ökad bakterie clearance och minskad lungskada 12.
Sammanfattningsvis, är värd en central aktör i samspelet mellan mikroorganismer som modulerar medfödda immunförsvaret och involverar olika inflammatoriska celltyper. Medan dessa komplexa immun interaktioner kan dissekeras in vitro de initiala hypoteser endast kan åstadkommas genom lämpliga in vivo-modeller. Följande protokoll är ett exempel på in vivo-studie av värd-medierad patogen interaktion som kan anpassas till andra mikroorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den regionala etiska regionkommittén för djurförsök har godkänt denna metod, i enlighet med nationell och internationell djuromsorg och användning i prövnings riktlinjer för forskning.
1. Provtagning
- Prov lagring
- Samla alla prover och omedelbart lagra vid - 20 ° C eller på is tills frysförvaring att undvika en försämring. Placera steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på is för att förbättra bronkobstruktiva alveolära sköljningar (BAL) prestanda.
- Kirurgi
- Sterilisera all kirurgisk utrustning med hjälp av en autoklav.
OBS: Om det är möjligt, rekommenderas att använda två olika uppsättningar instrument för buken och bröstkorg åtgärder för att undvika korskontaminering. Krävs dissektion utrustning beskrivs i figur 4A
- Sterilisera all kirurgisk utrustning med hjälp av en autoklav.
2. Möss, bakteriella jäststammar
- Hus möss i enlighet med lokal användning av djur i reriktlinjer sökkommitté i en ventilerad rack utan att överskrida 5 möss per bur, med mat och vatten ad lib i en skyddsnivå 2 bostäder anläggning på grund av användningen av skyddsnivå 2 mikroorganismer: P. aeruginosa och C. albicans.
- Håll bakteriestammarna vid -80 ° C i 40% glycerol-medium.
- Lägg bakterier direkt från frysta lager i odlings rör innehållande 3 ml steril Luria-Bertani buljong med hjälp av en 10 pl ympning slinga. Lämna O / N vid 37 ° C med orbital skakning (400 rpm) dagen före instillation.
- Harvest bakterier genom centrifugering vid 2000 xg under 5 min.
- Aspirera supernatanten i en lämplig avfalls sluten biologiskt avfall. Observera vit vidhäftande pellet på botten av odlingsröret.
- Tvätta och suspendera pelleten med 5 ml PBS.
- Upprepa steg 2.2.2 till 2.2.3 en andra gång för att utföra en andra tvätt.
- Resuspendera pelleterat bakterier med 1 ml PBSoch kort vortex.
- Bestäm inokulatet tätheten med hjälp av optisk densitometer vid 600 nm med hjälp av en optisk densitet Meter. En densitet av 0,9 motsvarar 10 9 CFU / ml för PAO1, späd därefter.
OBS: Detta resultat måste erhållas för varje använd stam genom bestämning densitet av successiva utspädningar av ett kalibrerat inokulat. - Kontrollera inokulatet genom serie logaritmiska späd och plattan 100 ul av varje utspädning på bromkresolpurpur agar (BCP) plattor och O / N-kulturen. Administrera varje mus intranasalt 50 ul av lösningen innehållande 1 X 10 8 till två x10 8 CFU per ml (5 X 10 6 till en x10 7 CFU per mus).
- Använd C. albicans SC5314 som referensstam. Bevara stammen i 40% glycerol-medium vid -80 ° C.
- Tillägg Jäst-Pepton-dextrosbuljong med 0,015% amikacin att undvika bakteriekontamination och underlätta ytterligare räkning.
- Lägg jäst med användning av 10 &# 181; l ympning slinga i förberedda YPD-buljong kompletterad med amikacin O / N vid 37 ° C.
- Skörd jäst genom centrifugering vid 2000 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten i en lämplig avfalls bioharzard avfall. Vit vidhäftande pellets bör observeras i botten av odlingsröret.
- Tvätta och suspendera pelleterade bakterier med 5 ml PBS och kort vortex.
- Upprepa steg 2.2.2 till 2.2.3 en andra gång för att utföra en andra tvätt.
- Resuspendera pelleten med användning av 1 ml av PBS och kortvarig virvling.
- Bestäm storleken på inokulatet genom att räkna på en Mallassez hematocytometer användning av ett standardmikroskop vid 40x förstoring.
OBS: Koncentration (i CFU / ml) erhålles med användning av följande formel: (antal jäst x 10 5) / (antalet räknade galler rektanglar på Mallassez hematocytometer). - Kontrollera genom serie logaritmisk utspädning till 10 -5 och 10 -6 för att bekräfta att lösningen innehåller 2 x 10 6 CFU / ml.
- Plattan på YPD agarplattor kompletterade med 0,015% amikacin.
3. Airways Colonization av C. albicans
OBS: Efter miljöanpassning, möss vägdes två gånger om dagen.
- Under ett dragskåp, deposition 500 il sevofluran PÅ en 4 cm x 4 cm gasväv (open-släpp-teknik) 14.
- Placera omedelbart gasväv på golvet i en ca 750 ml induktion kammare. Placera omedelbart en mask upphöjd plattform ovanför gasväv för att undvika direkt kontakt mellan djur och gasväv.
- Stäng lufttätt lock och vänta 1 till 2 min för att tillåta diffusion av sevofluran i kammaren.
- Överför musen från buren mask plattform och stäng locket. Ljus anestesi med bevarad spontanandning bör uppnås i 30 till 45 sekunder.
- Övervaka hypotonus genom att observera förlust av rätande reflex vid vilken punkt musen kan tas bort from lådan och instilleras.
- Intranasal indrypning (Kan genomföras i 10 sekunder av en utbildad operatör).
- Håll musen med en hand inbäddat på rygg hålls upprätt (Figur 4B).
- Med hjälp av pekfingret, stödja huvudet och använda tummen för att hålla käften stängd för att undvika upphostningar (Figur 4C).
- Som beskrivits i steg 2.3.8, se till att den behandlade C. albicans lösning innehåller 2 x10 6 CFU per ml för en 50 pl ingjutit volym.
OBS: Den andra kritiska punkten är ingjutit volymen. En volym är lägre än 50 ^ kan resultera i en otillräcklig kolonisering eller inhomogen instillation av luftvägarna, kan en större volym framkalla drunkning / kvävning och död. - Ingjuta musen intranasalt genom att närma pipetten till näsborrarna.
- Pipettera en 50 pl droppe som bildar en bubbla som innehåller lösningen på näsborrarna, därefter inhaleras av spontaneously andas mus.
- Placera musen i en återhämtning område (t.ex. en stor väl luftad bare bur med en overhead värmelampa). Möss måste övervakas tills fullständig uppvaknande. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräckligt medvetandet att upprätthålla sternala VILA och rätande reflex. Vid denna punkt, kan musen returneras till en normal bostad bur.
4. P. aeruginosa-inducerad akut lunginflammation
OBS: Möss vägs under de fyra följande dagarna. Normalt möss upp i vikt under C. albicans medierad luftvägar kolonisering (Figur 2A).
- Förbered suspension innehållande P. aeruginosa dagen för instillation efter O / N tillväxt (avsnitt 2.2).
- Söva kort användning av inhalerat sevofluran som beskrivits ovan (avsnitt 3.1).
OBS: För att utföra akut lunginfektion, rekommenderas bakteriell belastning föreslås iTabell 1. - Ingjuta musen som beskrivs ovan (punkt 3.2) med särskild hänsyn till efter instilla återhämtning.
5. Mät Lung Injury Index
- Bered en lösning innehållande FITC-märkt albumin. Injicera denna lösning 2 h före avlivning.
- Väg 0,2 mg albumin-FITC med lämplig utrustning.
- Lägg 0,2 mg i 1 ml PBS. Kortfattat virvel. Om den inte används omedelbart, placera lösningen i folie för att undvika exponering för omgivande ljus.
- Injicera intraperitonealt 200 il FITC-märkt albuminlösning till varje mus.
- Dödshjälp
- Väg mössen för den sista viktdata.
- Euthanize en enda mus i enlighet med lokal användning av djur i riktlinjerna kommitté forskning med en intraperitoneal injektion av en dödlig överdos av pentobarbital: 300 pl 5,47% pentobarbital.
- Ta musen från buren och erhåller lethal injektion av operatör.
- Efter injektion, överföra musen ensam till en annan bur, gömd från alla andra djur. Observera musen tills frånvaron av rörelse. Bekräfta döden är genom frånvaron av rörelse, särskilt andningsrörelse, avsaknad av puls.
- Utför kirurgisk provtagning på döda djur, därför utan bedövningsmedel eller smärtstillande medel.
- Kirurgisk provsamling: Thorax skede.
OBS: För att bibehålla sterila förhållanden, är all kirurgi utförs med hjälp av steril utrustning i en skyddsnivå 2 miljö.- Applicera etanol till huden. Gör en mittlinjen hud snitt från bröstbenet till mitten av buken med en sax. Från mittlinjen incise längs bröstkorgen på vardera sidan. Vik tillbaka huden på vardera sidan av bröstkorgen för att visualisera bröstkorgen.
- Utför en vertikalt snitt av bröstkorgen på vardera sidan går upp mot nyckelbenen, för att kunna luta hela främre bröstväggen med akternum tillåter perfekt visualisering av hjärta och lungor (fig 5A, 5B).
- Samla blod med hjälp av en pre-heparined sprutan genom att punktera hjärtat bredvid inter artären. Dra tillbaka minst 500 | j, l för att erhålla åtminstone 100 | il plasma. Placera blodprovet på is.
- Gör en mittlinjen livmoderhalscancer snitt för att visualisera luftstrupen (figur 5B och 5C). Försiktigt dissekera fascian runt luftstrupen. Placera en sutur bakom luftstrupen (figur 5C och 5D). Därefter suturen kommer att stängas runt kanyle nålen för att säkerställa korrekt sköljning.
- ANVÄNDA KATETER luftstrupen med hjälp av 20-G modifierad sondmatning nål (Figur 5D och 4A). Knyt en kirurgisk knut runt kanylluftstrupen med den tidigare placerade sutur.
- För att utföra bronkoalveolära skölj (BAL), försiktigt och gradvis injicera och rita 500 il iskall PBS i / från lungan. Placera provet på ice för att undvika cellulär lys.
- Upprepa steg 5.3.6, 3 gånger för att få en total av 1500 il BAL vätska och pool sköljprover i en 2 ml centrifugrör (Figur 5E).
- Ta lungorna från bröstet. Placera en lungsegment (storlek ska motsvara den halv av en lunga eller en lob) i 1,5 ml centrifugrör och lagra snabbt vid - 80 ° C.
- Placera en lunga segment i en förvägd hemolys rör innehållande PBS för att fastställa bakteriebörda och placera den på is.
- Kirurgisk provsamling: buken skede.
- Utföra en annan snitt på vänster sida av buken. Observera mjälten genom bukhinnan.
- Ta bort mjälten och placera i en andra hemolys rör innehållande 1 ml PBS och lägg på is.
- Lungskada Index
OBS: Alveolar-kapillär membranpermeabilitet bedöms genom mätning av FITC-märkt-albuminläckage från blodomloppet till alveolär-interstitial utrymmet.- Centrifug blodprov och BAL vätska för 10 minuter vid 1500 x g. Samla supernatanterna till nya centrifugrör. Pelletsen motsvarar rekryterade plasma eller BAL-celler och bör placeras på is.
- Tillsätt 100 | il av varje blod supernatanten (plasma, gul) eller BAL supernatanten till ett 96-brunnars transparenta plattan (300 pl brunnar). Placera en folie på plattan om den inte används omedelbart.
- Mät fluorescensnivåer i plasma och BAL supernatanter med hjälp av en fluorescensmikroplattläsare (excitation, 487 nm, emission, 520 nm).
- Bestäm lungskada index genom att beräkna fluorescensförhållandet [(BAL supernatant / blodvätskan) x 100].
- Bronkoalveolärt lavage (BAL) differentialcellräkning.
OBS: Använd cellpelleten erhållits från centrifugering av BAL vätska i steg 5.5.1.- Om det behövs, använd röd-cellysbuffert. Tillsätt 500 pl av röd-cell-lyseringsbuffert i centrifugröret innehållande cell pelleten. Kortfattat virvel och lämnar 10 minuter på is. Lägg 500 pl PBS för att stoppa röda cellys.
- Harvest celler genom centrifugering under 10 min vid 1500 x g. Avlägsna supernatanten och suspendera cellpelleten i 1 ml steril PBS. Räkna celler på en Mallassez hematocytometer. Med hjälp av en hemacytometer att räkna celler. Koncentrera celler på ett objektglas med en cytospin.
- Fläcken celler med användning av färg kit möjliggör identifiering och räkning (makrofager, lymfocyter, neutrofiler) cell.
- Lung bakteriell belastning och bakteriespridning
OBS: För att bedöma lung bakteriell belastning och bakteriespridning, lungor och mjälte respektive samlas in och lagras i förväg vägda hemolys rör innehållande 1 ml PBS (steg 5.3.9).- Väg hemolys rör innehållande 1 ml PBS och antingen lung- eller mjälte. Homogenisera prover med en vävnad homogenisator för att få lunghomogenat och mjälte homogenat.
- Insättning 100 pl vävnad homogenates till centrifugrör innehållande 900 ul steril PBS för att få serie logaritmiska utspädningar.
- Plate de två sista lämpliga utspädda prover (10 -3 och 10 -2) på antingen BCP-agar för P. aeruginosa eller YPD-amikacin-kompletteras agar för C. albicans lunga och mjälte börda bestämning.
- Inkubera plattorna O / N vid 37 ° C. Följande dag, räkna kolonierna på plattor.
- Index resultatet till lungvikt för erhållande av en CFU per gram lunga. Lung urvalen är inte samma sak, resultaten bör uttryckas i CFU per gram lunga.
Formel för indexet är: [CFU] x [vikt hemolys rör och lungan] - [vikt hemolys rör].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som tidigare setts under protokollbeskrivningen måste experimentet 5 dag för att slutföra (Figur 1: experiment tidslinje). En operatör beställt under hela körningen av experimentet och kan hantera processer upp till maximalt 10 möss. Om fler djur krävs två personer behövs särskilt för kirurgisk provtagning. I själva verket alla prover ska samlas in under två timmar för att undvika en ökad passiv alveolär-kapillär läckage av FITC-märkt albumin under de senaste möss.
Det första steget är framställningen av C. albicans inokulum och intranasal indrypning att få luftvägs kolonisering av C. albicans. En 4 dagar-persistens modell erhålls genom intranasal instillation av 5 x 10 5 CFU C. albicans per mus (Figur 2B). Under dessa 4 dagar, möss upp i vikt (figur 2A) och instillation av 5x10 5 CFU inducerar inte lung skada (Figur 2C). Även C. albicans kan kvarstå upp till 4 dagar i denna modell, minskar belastningen efter 48 timmar. Därför P. aeruginosa-inducerad akut lunginflammation är uppträtt vid 48 timmar C. albicans uthållighet.
P. aeruginosa stam PAO1 är en stor del präglaboratoriestam som omfattar huvud virulensfaktorn, typ tre-sekretionssystemet (T3SS), som i 75% av klinisk lung isolat 15. För avhandlingar skäl är PAO1 en relevant stam i djurmodeller av akut lunginfektion. Lungskada bedöms genom alveolo-capillar permeabilitet mätt genom proteinläckage från vaskulära utrymmet i luftvägarna uttryckt som lungskada index. Lungskada ökar med inokulatet (figur 3A). Här rapporterar vi kinetik akut lungskada del av vår modell inducerad av PAO1 stam (5x10 6 CFU / mus) (Figur 3B-3F) ensam utan föregåendeC. albicans- medierad priming. Beroende på stam och tidsförloppet av modellen, valet av initiala P. aeruginosa inokulum diskuteras i nästa avsnitt och antyds i tabell 1.
Fem möss per grupp användes. Lungskada index (figur 3B), bakteriell belastning i lungan (fig 3C), bakteriell belastning i mjälten, vilket återspeglar bakteriell spridning (figur 3D), BAL cellularitet (figur 3E) och differentialcellräkning (fig 3F) bestämdes varje 12 h. Lungskada var maximal mellan 24 timmar och 36 timmar efter infektion (Figur 3B). Bakteriell börda visade en 1-log CFU / ml minska varje 24 timmar (Figur 3C). Kumulativ bakteriell spridning bedöms av mjälte homogenat kulturer ökat varje dag (Figur 3D). Slutligen, medan BAL cellularitet i oinfekterade möss huvudsakligen består (90%) of alveolära makrofager, i BAL från infekterade möss, var neutrofiler allmänt rekryterats och differentialcellräkning visade 90% neutrofiler och 10% makrofager och lymfocyter (Figur 3E, 3F).
Figur 1. Tidslinje av akut lungskada Model att utforska Host-medierad interaktion mellan C. albicans och P. aeruginosa.
Grafisk representation av hela proceduren. Det första steget är miljöanpassning av möss bostadsanläggningen. Det andra steget är C. albicans medierad luftvägs kolonisering. Slutligen är det tredje steget akut lunginfektion förmedlad av P. aeruginosa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. C. albicans airway Colonization.
(A, B) Möss intranasalt ingjutit med 10 5 CFU C. albicans (stam SC5314). Möss upp i vikt under C. albicans medierad luftvägar kolonisering (A). Kolonisering av luftvägarna kan förlängas till 3-4 dagar med bara en initial tillförseln. I en tidigare studie, grundning av medfödd immunitet äger rum mellan 24 och 48 timmar. (n = 5 per grupp), felstaplar representerar medelvärden ± SD. (C, D) möss intranasalt instilleras 5 x 10 5 eller 5 x 10 6 CFU C. albicans. Lungskada index (C) bedöms av alveolär kapillär barriär permeabilitet på 24 timmar. Viktökning (D), uttryckt som procent av ursprunglig vikt (n = 5 per grupp).Felstaplar representerar medel ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Modell av akut lungskada inducerad av P aeruginosa.
(A) C57BL / 6J-möss intranasalt infekterade med ökande belastningar av P. aeruginosa (från 1 x 10 sex till 5 x 10 7 CFU per mus) (n = 5 per grupp), felstaplar representerar medelvärden ± SD. Mössen avlivas vid 24 tim. Lungskada index bedöms av alveolär-kapillär barriär permeabilitet som ökar proportionellt med bakteriell belastning. Jämförelse av lungskada index som erhålls genom att använda gamla metoden med lunghomogenat supernatanter (svarta staplar) och ny kombinerad metod med hjälp av bronkoalveolär skölj supernatanter (grå fältets) (BF) möss intranasalt infekterades med 5 x10 6 CFU per mus. Möss avlivas varje 12-48 h till akuta skador modell kinetik. Lungskada (B), lunga bakteriell belastning (C), mjälte bakteriell belastning (D), bronkoalveolärt lavage (BAL) cellularitet (E) och BAL differentialkroppar (F) bedöms också. (n = 5) per grupp, felstaplar representerar medel ± SD. klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. kirurgisk utrustning och intranasal indrypning.
(A) Kirurgisk utrustning som krävs för att utföra akuta skador modell och bronkoalveolär sköljning. Här trakealkanylen (20G) och de två 1 ml-sprutor är anslutna till ett Luer-lås 3-vägsventil. En spruta för att injicera vatten i lungorna, en för att dra bronkoalveolär vätska tillbaka ut från lungorna. (B, C) Placering av musen i handen för att utföra den intranasal instillation. I detta foto, tummen under hakan garanterar en stängd mun under tillförseln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Kirurgi och Broncho-alveolär Lavage.
Bröstet är allmänt öppnas (A), och bröstkorg öppnas i sidled för att undvika skador på hjärtat (B). Efter blodinsamling, är halsområdet dissekeras att exponera luftstrupen (C). Tandtråd används som ensuturen och ledes bakom luftstrupen (C, D). Trakea därefter kanyleras med den 20-G kanyl kombinerat (D) som är monterad på sprutan och 3-vägsventilen. Luftstrupen bör tätt säkras runt kanylen genom att knyta en kirurgisk knut med hjälp av sutur på plats bakom luftstrupen. Slutligen 500 fil PBS försiktigt ingjutas i lungorna och sedan BAL försiktigt dras ut. (E) Vätske-ingjutit lungor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kortaste instilleras Burden | Maximal instilleras Burden | |
| T3SS- | 5 x 10 7 | 1 x 10 8 |
| T3SS + | 5 x 10 6 | 1 x 10 7 |
| T3SS + exoU + | 5 X 10 | 1 x 10 5 | |
Tabell 1. P. aeruginosa Inokula Används i akut lunginfektion modeller.
Föreslagna optimala intranasal koncentrationer av inokulat att framkalla akut lungskada enligt stammar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Djurmodeller, speciellt däggdjur, är användbara för att belysa komplexa mekanismer av värdpatogen interaktion inom immunitet. Naturligtvis, behovet av information som endast kan erhållas från djurmodeller måste vara nödvändig; I annat fall måste användningen av djur ersättas med in vitro-modeller. Denna djurmodell illustrerar insikten att endast kan tillhandahållas av en djurmodell eftersom interaktionen mellan patogener förmedlas av ett flerkomponentvärdsvar. Möss som för närvarande används för att studera denna värdpatogen interaktion är unga vuxna i åldern 6 till 10 veckor med en mogen och oförändrat immunsvar. När fokus på det medfödda immunsvaret är C57BL6 / J bakgrund möss föredra. För att undvika en effekt av kön och hormonella cykel (särskilt östrogen) på immunsvaret, män är därför det bästa valet. För att uppnå statistisk signifikans, måste grupperna ha minst 5 individer vid slutet av experimentet, men som föreslagits av alla djur experimenrings riktlinjer bör antalet djur som används minskas och förfinas till ett absolut minimum.
Transport från uppfödaren ge djuren till forskningsanläggningen inducerar stress hos möss. Följden är en ökad utsöndring av inflammatoriska cytokiner som kan förändra efterföljande experiment som vårt. Dessutom, en ny miljö och nya "bur kompisar" bidra till stress. Följaktligen måste mössen acklimatiseras i minst sju dagar före att studera i sin nya boendemiljö. Detta boendemiljö måste kontrolleras, vilket ger standard mat och vatten ad-lib, en dag / natt cykel, och lämplig stabil luftfuktighet och temperatur.
Både lung kolonisering och lunginflammation modeller kräver praxis och skicklighet. Instillation kan utföras intranasalt eller intratrakealt. Det senare är svårare och kräver ökad kompetens genom utbildning på grund av en hög risk för syrefria hjärtstillestånd. Faktiskt, procedure behöver för att framgångsrikt intubation en mus på mindre än 15 sekunder och därför krävs djupare anestesi. Vårt val av intranasal instillation är lättare att utföra eftersom administrationssättet är tillgänglig, mindre riskfyllt att kräva lättare anestesi och är därför mer reproducerbar.
Boutoille et al beskrev redan vår akut lungskada modell, i synnerhet vid bedömningen av lungskada genom mätning av alveolär-kapillär barriär permeabilitet med hjälp av FITC-märkt albumin 16. För att minska antalet möss per försök, var detta förfarande anpassas och kopplas med bronkoalveolärt lavage (BAL). I studierna av Boutoille et al, använde vi en jämförelse mellan fluorescens av FITC-märkt albumin i lunghomogenat supernatanterna och blod supernatanterna 17.
För att till fullo utföra denna jämförelse är hemoglobinnivåer och hematokritnivåer krävs också. Denna metod har anpassats till allow samtidig analys av värdsvar genom att tillägna en lunga till homogenisering och bedömning av lungskada och den andra till sköljn och studier av värdsvar. I själva verket kan BAL-vätskan användas för att bedöma cytokinnivåer, proteinsekretion och cellrekrytering. Vår anpassning ger fler resultat från en enda djurexperiment, minska kostnaderna och erforderligt antal möss, i synnerhet när man använder knock-out-möss 17 som rekommenderas i djurförsök riktlinjer. Dessutom är en del av lungan som hölls vid -80 ° C för att utföra totalt RNA-extraktion och kvantitativ polymeraskedjereaktion eller histologisk analys. Jämförelse mellan den tidigare metoden och den nya anpassad metod i kombination med BAL visar jämförbara resultat (figur 3A) för att bedöma lungskada index.
I studien av Mear m.fl., med användning av samma förfaranden, flödescytometer analys utfördes på BAL-celler erhållna genom centrifugering av BAL-vätska. Liknande ennalyses utfördes på totala lungceller från lungorna 12. I detta fall, kan lungskada bedömning med FITC-märkt albumin inte utföras samtidigt, på grund av artefakter inducerade av FITC (samma kanal än grönt fluorescerande protein). Därför, om flödescytometri krävs experiment måste planeras därefter.
Tidpunkten för dödshjälp är kritisk. Ett tidsförlopp av akut lunginfektionsmodell över den första 72 h presenteras Figur 3. I denna modell, höjden av lungskada och värdsvar sker mellan 24 och 36 h (fig 3). Således, i vår design 24 hr slutpunkten valdes som en avläsning för 3 skäl: För det första, är det lätt att organisera i laboratoriet, dels för att undvika förlust av möss på grund av dödlighet mellan 24 och 36 timmar, och slutligen, eftersom värd svar var maximal vid denna tidpunkt.
Det första steget i vår interaktionsstudie är koloniseringen av luftvägarna med <em> C. albicans. Med hjälp av en instillation av 10 5 CFU per mus, är en 4-dagars uthållighet modell som köpts utan någon lungskada. I själva verket fick möss vikt över tidsförloppet av denna fas. Viktökning är en användbar indikator på avsaknad av skada i linje med kolonisering i motsats till infektion. I själva verket, en ökad initial belastning (över 10 6 CFU per mus) inducerad lungskada (Figur 2C) och en skadlig värd svar långt bortom priming, i vilket fall möss bantade (figur 2D). Tvärtom, med användning av en mindre initial last (till exempel 10 4 CFU per mus) en luftväg persistens modell kunde inte erhållas. Således, för att erhålla den observerade primning av värdimmunitet beskrivits av Mear m.fl. 12, är kalibreringen av instillerade svamp bördan kritisk för framgång och övervakning av viktkurvan är en nyckelkontroll.
Samma precision krävs för P. aeruginosa P. aeruginosa försvinner snabbt från luftvägarna av en lämplig värd-svar. Med hjälp av en alltför hög initial P. aeruginosa överträffar kapaciteten hos värd försvar eller ens inducerar ett olämpligt och derleterious svar resulterar i belastning leder till massiv akuta skador och död radera alla skillnader mellan grupperna. Den optimala inokulum för att inducera akut skada beror av närvaron av en funktionell typ-3 sekretionssystemet (T3SS) och produktionen av exotoxin U, ett toxin translokeras av T3SS i värdcellens cytoplasma. Dessa båda stamspecifika attribut måste beaktas vid valet av den initiala bakteriella bördan. Initiala bakteriella bördor föreslås i denna artikel som exempel på nedre och övre gränser för att framkalla akut lungskada med T3SS-negativ eller positiv stam, och stammar som producerar exotoxin U eller inte (tabell 1). När man studerarmedverkan av T3SS, har stammen skall odlas O / N och återupplivades med ny LB-medium 3 h före framställningen av inokulatet att erhålla optimal aktivitet hos T3SS.
Bestämningen av bakterier och svamp börda 24 h efter P. aeruginosa inducerad lunginflammation kräver särskilda överväganden som diskuteras i det här avsnittet. Faktiskt, som visas, när möss infekteras med 5 x 10 6 CFU T3SS-positiv stam, bakteriell belastning i lungorna vid 24 h kommer minskade till ungefär 1 log (fig 3C). Serieutspädningar av prover måste utföras upp till 5-log spädning och ströks ut på BCP-agarplattor. Beträffande C. albicans i lungorna, vid 72 timmar, är svamp börda minskade till ungefär 2 log och prover måste att vara klädd på YPD-agar kompletterad med amikacin att underlätta kolonin. Slutligen kan bedömas genom plätering 100 pl blodprov på BCP-agar eller genom plätering 100 pl mjälte h bestämning av bakteriell spridningomogenates på samma medium. De två metoder redan jämförts och mjälte kultur verkar vara mer exakt. I själva verket är mjälten ett organ som "filter" helblod och kan "koncentrera" och bevara bakterier som sprider på blod. Således, mjälte homogen återspeglar den systemiska bakteriella spridning under akut lunginflammation med en högre känslighet än blod. Blodprov representerar bakteriell spridning på en mycket specifik med tanke på tid och kanske inte riktigt speglar fenomenet bakteriespridning som helhet. Därför mjälte homogenat kulturer är att föredra.
Lungskada index är en känslig bedömning av lungskada till följd av infektion och / eller olämpligt värdsvar och effekten av potentiella läkemedel på dessa komponenter. Dessutom ger detta viv o modell samling av flera olika prover för att studera värdsvar. Lung kan användas för RNA-extraktion och analysav gentranskription. Lungprover kan också placeras in i paraformaldehyd (PFA) för att ytterligare histologiska observationer. BAL-vätskan kan användas för bedömning av proteinsekretion, såsom inflammatoriska cytokiner. Slutligen, såsom diskuterats ovan protokollet kan anpassas för att tillhandahålla prover för flödescytometrianalys.
Slutligen kan detta protokoll anpassas till modelize C. albicans- mikrober interaktion inblandade i ventilatorassocierad pneumoni såsom Staphylococcus aureus 18 eller Enterobacteriae. En annan anpassning kan vara luftvägs kolonisering med hjälp av bakterier i stället för C. albicans att modelize bakteriell interaktion i kronisk varig lungsjukdom såsom bronchiectasis. För detta ändamål har nedsatt immunförsvar möss som ska användas, eftersom bakterie clearance i immunkompetenta möss inte tillåter en ihållande luftvägs kolonisering.
För indrypning är cri läget för hand som håller djurettisk. Som redan framhållits i föregående avsnitt, när intranasalt ingjuta musen, måste operatören se till att munnen är perfekt stängd för att undvika UPPHOSTNING av lösningen. Tummen stöder käken och håller munnen stängd under hela tillförseln förfarandet (Figur 4B). Därefter, med den andra handen, är pipetten avsatt på en näsborre (figur 4C) och lösningen progressivt och försiktigt instilleras utan luft för att förhindra bubbelbildning. Självklart måste instillation utföras i en nivå 2-biosäkerhetsskåp.
Provtagning kräver certiferat smådjurs kirurgisk träning av operatören. Vid varje steg måste proverna placeras på is för att undvika cellys och bevara proteiner från denaturering. Grundläggande kirurgiska instrument krävs (figur 4A). De måste steriliseras genom autoklavering före användning. Det rekommenderas att olika kirurgiska instrumentuppsättningar användas för abdominal och bröstkorg kirurgiska åtgärder, undvika korskontaminering av lungprover. De olika kritiska stegen av kirurgisk dissektion presenteras (Figur 5A-5E). Placering av musen är kritisk; djuret bör immobiliserade platt på det tillbaka huvudet motsatt från operatören och raka. Etanol bör frikostigt för att prep före första snittet för att undvika spridning av håret i proven och potentiell bakteriell kontaminering från huden. Huden är väl vaskulariserad och måste dras tillbaka noggrant för att undvika blödning (Figur 5A).
Därefter bröstkorgen är tillbakalutad efter en lateral snitt kista under vilken bröstkorgen bör ständigt underhållas i pincett grepp för att undvika skador på hjärta och lungor under snittet. Lungor och hjärta är exponerade (figur 5B). Oinfekterade lunga visas vitaktig (figur 5B). Dissekering av halsområdet utsätter luftstrupe och en sutur är bilefully placerad bakom den övre luftstrupen (figur 5C). Kanyleluftstrupen skall ske med försiktighet. Använd inte en överdimensionerad kanyl (maximal storlek är 20 G). En liten främre snitt i MEMBRAN- trakea mellan två broskringar tillåter insättning av kanylen. När kanylen observeras genom transparens genom trakea ovanför carina (figur 5D) är suturen hårt knuten runt luftstrupen säkra den runt kanylen (Figur 5E). Kanylen är ansluten till en tre-vägs Luer-låsventil med 2 sprutor anslutna till de kvinnliga portar. En spruta innehåller iskall PBS för bronkoalveolär sköljning; den andra är tomt för att dra tillbaka BAL-vätskan. Dessa sprutor ska chaged mellan grupper.
Sammanfattningsvis, priming före akut lungskada modell är en relevant och kraftfull modell för att utforska in vivo värd förmedlade interaktioner mellan patogener. Användningen av djur ärhuvudsakliga begränsningen och bör noga vägas mot den information som kan erhållas in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sevorane, Sevoflurane | Abott | 05458-02 | 250 ml plastic bottle |
| Fluorescence Reader Mithras LB940 | Berthold Technologies | reference in first column | no comment |
| Bromo-cresol purple agar | Biomerieux | 43021 | 20x per unit |
| Pentobarbital sodique 5.47% | CEVA | 6742145 | 100 ml plastic bottle |
| 2-headed valve | Distrimed | 92831 | no comment |
| Sterile inoculation loop 10 µl | Dutscher | 10175 | x1,000 conditioning |
| Insuline syringes 1 ml | Dutscher | 30003 | per 100 conditioning |
| 2 positions Culture tube 8 ml | Dutscher | 64300 | no comment |
| Ultrospec 10 | General Electric life sciences | 80-2116-30 | no comment |
| Hemolysis tubes 13 x 75 mm | Gosselin | W1773X | per 100 |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life technologies | 10010023 | packaged in 500 ml |
| amikacin 1 g | Mylan | 62516778 | per 10 |
| Heparin 10,000 UI in 2 ml | Pan pharma | 9128701 | 10x per unit |
| RAL 555 coloration kit | RAL Diagnostics | 361550 | 3 flacons of 100 mL |
| 1.5 ml microcentrifuge tube | Sarstedt | 55.526.006 | x 1000 |
| Transparent 300 µl 96-well plate | Sarstedt | 82 1581500 | no comment |
| Yest-peptone-Dextrose Broth | Sigma | 95763 | in powder |
| FITC-albumin | Sigma | A9771 | in powder |
| Luria Bertani Broth | Sigma | L3022 | in powder |
| 25-gauge needle | Terumo or unisharp | A231 | x 100 conditioning |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | no comment |
References
- Casadevall, A., Pirofski, L. -A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).
- Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. , (2012).
- Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).
- Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
- Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).
- Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).
- Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. , (2013).
- Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
- Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).
- Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
- Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. , 1-33 (2009).
- Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
- Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).
- Faure, E., Mear, J. -B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
