Abstract
At studere vært-patogen interaktion gør os i stand til at forstå de underliggende mekanismer i patogenicitet under mikrobiel infektion. Prognosen for værten afhænger inddragelse af respons en tilpasset immunrespons mod patogenet 1. Immunrespons er kompleks og resultater fra samspillet af patogener og flere immune eller ikke-immune cellulære typer 2. In vitro-undersøgelser kan ikke karakterisere disse interaktioner og fokusere på celle-patogen interaktioner. Desuden i luftvejene 3, især hos patienter med suppurativ kronisk lungesygdom eller i mekanisk ventilerede patienter, polymikrobielle samfund er til stede og komplicere værtspatogene interaktion. Pseudomonas aeruginosa og Candida albicans er begge problem patogener 4, ofte isoleret fra tracheobronchial prøver, og associeret til alvorlige infektioner, især i intensiv afdeling 5. Mikrobielle interaktionerblevet rapporteret mellem disse patogener in vitro, men den kliniske effekt af disse interaktioner er fortsat uklart 6. At studere samspillet mellem C. Albicans og P. aeruginosa, en murin model af C. albicans airways kolonisering, efterfulgt af et P. aeruginosa- medieret akut lungeinfektion blev udført.
Introduction
Dyremodeller, især mus, er blevet udbredt anvendt til at undersøge immunreaktioner mod patogener. Selv medfødte og erhvervede immunitet variere mellem gnavere og mennesker 7, letheden i avl og udvikling af knockouts for mange gener, at mus en fremragende model til at studere immune 8 reaktioner. Det immunrespons er kompleks og et resultat af samspillet af et patogen, beboeren mikrobielle flora og flere immune (lymfocytter, neutrofile, makrofager) og ikke-immune (epitelceller, endotelceller) cellulære typer 2. In vitro-undersøgelser tillader ikke observere disse komplekse samspil og hovedsagelig fokuserer på unikke celle-patogen interaktioner. Mens dyremodeller skal anvendes med forsigtighed og er begrænset til meget specifikke og relevante spørgsmål, musemodeller giver et godt indblik i immunrespons pattedyr in vivo og kan rette dele af vigtige kliniske 7 spørgsmål.
6. Mens hvad der udgør en "normal" luftvejs microbiome mangler at blive fastlagt, hjemmehørende samfund er ofte polymikrobielle, og stammer fra forskellige økologiske kilder. Patienter med suppurativ kronisk lungesygdom (cystisk fibrose, bronchectasis) eller mekanisk ventilerede patienter udviser en bestemt flora grund kolonisering af luftvejene ved miljømæssigt erhvervede mikroorganismer 9. Pseudomonas aeruginosa og Candida albicans er både problemet patogener 5, ofte isoleret sammen fra tracheobronchial prøver , og ansvarlig for alvorlig opportunistisk infektion hos disse patienter, især i intensivafdelingen (ICU) 4.
Isolering af disse mikroorganismer under akut lungebetændelse hos ICU resulterer i antimikrobiel behandling mod P. aeruginosa but gær er normalt ikke anses for patogene på dette site 5. In vitro interaktioner mellem P. aeruginosa og C. albicans er blevet bredt rapporteret og viste, at disse mikroorganismer kan påvirke væksten og overlevelsen af hinanden, men undersøgelser kunne ikke konkludere, om tilstedeværelsen af C. albicans er skadelig eller gavnlig for værten 10. Musemodeller blev udviklet for at løse dette relevans P. aeruginosa og C. albicans in vivo, men interaktionen mellem mikroorganismer var ikke det centrale punkt. Faktisk blev den model, etableret for at vurdere inddragelsen af C. albicans i immunrespons vært, og resultat.
En tidligere model oprettet af Roux et al allerede brugt en indledende kolonisering med C. albicans efterfulgt af en akut lungeinfektion fremkaldt af P. aeruginosa. Ved hjælp af deres model, forfatterne fundet en skadelig rolle prior C. albicans Kolonisering 11. Men Roux et al anvendte en høj belastning med C. albicans i deres model med 2 x 10 6 CFU / mus i løbet af 3 dage i træk. Vi etablerede en 4-dages-model C. albicans luftveje kolonisering, eller i det mindste persistens uden lungeskader, I denne model C. albicans blev hentet op til 4 dage efter en enkelt instillation af 10 5 CFU pr mus (figur 2B) 12,13. Efter 4 dage blev observeret nogen tegn på inflammatorisk celle rekruttering, inflammatorisk cytokinproduktion eller epitelial skader. Ved 24 - 48 timer, på toppen tilstedeværelsen af C. albicans, selv om et cellulært og cytokin medfødte immunreaktion blev observeret, var der ingen tegn på lungeskader. Overraskende mus således koloniseret med C. albicans 48 timer før intranasal instillation af P. aeruginosa havde svækket infektion sammenlignet med mus med P. aeruginosa-infektion alene. jegndeed, udviste mus mindre lungeskade og nedsat bakteriebyrden 12,13.
Adskillige hypoteser kunne forklare denne gavnlige effekt af tidligere kolonisering med C. albicans på P. aeruginosa medieret akut lungeinfektion. Først en interspecies krydstale involverer hver mikroorganismer quorum-sensing systemer, den homoserinelactone-baserede P. aeruginosa systemet og farnesol-baserede C. albicans systemet, blev evalueret. For det andet, C. albicans fungere som "attrap" target for P. aeruginosa aflede patogenet fra lungeepitelceller blev undersøgt. Begge hypoteser blev ugyldige (upublicerede data). Den tredje hypotese var, at en "priming" af medfødte immunsystem ved C. albicans er ansvarlig for en forbedret efterfølgende medfødt respons mod P. aeruginosa. Denne sidste hypotese blev bekræftet. Faktisk C. albicans kolonisering førte til en grunding af medfødte immunitet through IL-22, hovedsageligt udskilles med medfødte lymfoide celler, hvilket resulterer i øget bakteriel clearance og reducerede lungeskader 12.
Afslutningsvis, værten er en central aktør i samspillet mellem mikroorganismer modulerer medfødte immunreaktion og involverer forskellige inflammatoriske celletyper. Mens disse komplekse immune interaktioner kan dissekeres in vitro de indledende hypoteser kan kun gives ved passende in vivo modeller. Følgende protokol giver et eksempel på in vivo-undersøgelse af værtsmedierede patogen interaktion, der kan tilpasses til andre mikroorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den regionale etik regionale komité for dyreforsøg har godkendt denne metode, i overensstemmelse med national og international dyr pleje og brug i testpræparater retningslinjer forskning.
1. Prøvetagning
- Prøveopbevaring
- Indsamle alle prøver og straks opbevares ved - 20 ° C eller på is indtil fryseopbevaring at undgå forringelser. Placer sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) på is for at forbedre bronko-alveolær udskylninger (BAL) performance.
- Kirurgi
- Sterilisere alle kirurgisk udstyr ved hjælp af en autoklave.
BEMÆRK: Hvis det er muligt, anbefales det at anvende to forskellige sæt af instrumenter til abdominale og thorax skridt til at undgå krydskontaminering. Kræves dissektion udstyr er vist detaljeret i figur 4A
- Sterilisere alle kirurgisk udstyr ved hjælp af en autoklave.
2. Mus, bakterielle og gærstammer
- House mus i overensstemmelse med lokal anvendelse af dyr i reretningslinjer søgning udvalgets i en ventileret stativ uden at overskride 5 mus pr bur, med mad og vand ad libitum, i et biosikkerhed niveau 2 boliger facilitet på grund af brugen af biosikkerhed niveau 2 mikroorganismer: P. aeruginosa og C. albicans.
- Hold bakteriestammerne ved -80 ° C i 40% glycerol medium.
- Tilføj bakterier direkte fra frossen lager i kultur rør indeholdende 3 ml sterilt Luria-Bertani-medium under anvendelse af en 10 pi podning loop. Efterlad O / N ved 37 ° C med orbital omrystning (400 rpm) dagen før instillation.
- Harvest bakterier ved centrifugering ved 2.000 x g i 5 min.
- Aspirere supernatanten i en passende bortskaffelse lukket biologisk farligt affald. Observere hvid klæbende pellet nederst i røret kultur.
- Vask og suspendere pellet hjælp 5 ml PBS.
- Gentag trin 2.2.2 til 2.2.3 en anden gang for at udføre en anden vask.
- Resuspender pelleterede bakterier under anvendelse af 1 ml PBSog korte vortex.
- Bestem inokulum tæthed ved hjælp optisk densitometer ved 600 nm ved hjælp af en optisk densitet Meter. En tæthed på 0,9 svarer til 10 9 CFU / ml for PAO1, fortyndes i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: Dette resultat skal opnås for hver anvendt stamme ved at bestemme densiteten af successive fortyndinger af en kalibreret inokulum. - Kontroller, at inokulum ved serielle logaritmiske fortyndinger og pladen 100 pi af hver fortynding på bromcresolrødt agar (BCP) plader og O / N-kulturen. Administrere hver mus intranasalt 50 pi af opløsning indeholdende 1 x 10 8 til at 2 x10 8 CFU pr ml (5 x 06 til 01 oktober x10 7 CFU pr mus).
- Brug C. albicans SC5314 som reference stamme. Bevare stammen i 40% glycerol-medium ved -80 ° C.
- Supplement Gær-pepton-dextrose bouillon med 0,015% amikacin at undgå bakteriel forurening og lette yderligere tæller.
- Tilføj gær under anvendelse af 10 &# 181; l inokulering loop i forberedt YPD-bouillon suppleret med amikacin O / N ved 37 ° C.
- Harvest gær ved centrifugering ved 2.000 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten i en passende bortskaffelse bioharzard affald. Hvid klæbende pille bør observeres i bunden af kultur rør.
- Vask og suspendere de pelleterede bakterier ved hjælp af 5 ml PBS og korte vortex.
- Gentag trin 2.2.2 til 2.2.3 en anden gang for at udføre en anden vask.
- Pellet resuspenderes ved hjælp af 1 ml PBS og kort vortexing.
- Bestemme størrelsen af inoculum ved tælling på en Mallassez hematocytometer anvendelse af en standard mikroskop ved 40x forstørrelse.
BEMÆRK: Koncentration (i CFU / ml) opnås ved hjælp af følgende formel: (antal gær x 10 5) / (antal optalte grid rektangler på Mallassez hematocytometer). - Bekræft ved seriel logaritmisk fortynding til 10 -5 og 10 -6 at bekræfte, at opløsning indeholder 2 x 10 6 CFU / ml.
- Plade på YPD-agarplader suppleret med 0,015% amikacin.
3. Airways kolonisering af C. albicans
BEMÆRK: Efter miljøtilpasning mus vejet to gange om dagen.
- Under et stinkskab, depositum 500 pi Sevofluran onto en 4 cm x 4 cm gaze (åben-drop teknik) 14.
- Umiddelbart placere gaze på gulvet af en ca. 750 ml induktion kammer. Straks placere en maske-hævet platform over gaze for at undgå direkte kontakt mellem dyret og gaze.
- Luk lufttæt låg og vente 1 til 2 minutter for at tillade diffusion af sevofluran i kammeret.
- Overfør musen fra buret til mesh platform og tæt låg. Let anæstesi med bevaret spontan vejrtrækning bør opnås i 30 til 45 sek.
- Overvåg for hypotoni ved at observere tab af balancerefleks på hvilket tidspunkt musen kan fjernes from boksen og indpodet.
- Intranasal instillation (kan udføres i 10 sekunder ved hjælp af en uddannet operatør).
- Hold musen én hånd beliggende på ryggen holdes lodret (figur 4B).
- Brug af pegefingeren, støtte hovedet og bruge tommelfingeren til at holde kæben lukket for at undgå opspyt (figur 4C).
- Som beskrevet i trin 2.3.8, at den forberedte C. albicans opløsning indeholder 2 x10 6 CFU pr ml en 50 pi indpodet volumen.
BEMÆRK: Den anden kritiske punkt er inddryppede volumen. Et volumen på under 50 pi kunne resultere i en utilstrækkelig kolonisering eller inhomogen instillation af luftveje, kan et større volumen inducere drukning / kvælning og død. - Indpode musen intranasalt ved at nærme pipetten til næseborene.
- Afpipetteres en 50 ul dråbe danner en boble indeholdende løsning på næseborene, efterfølgende inhaleres af spontaneously vejrtrækning mus.
- Placer musen i et opsving område (f.eks, en stor godt beluftet nøgne bur med en overhead varmelampe). Mus skal overvåges indtil fuldstændig opvågnen. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje og oprettende refleks. På dette tidspunkt, kan musen blive returneret til et normalt hus bur.
4. P. aeruginosa-induceret akut lungeinfektion
BEMÆRK: Mus vejes i de følgende fire dage. Normalt mus tager på i vægt under C. albicans -medieret luftveje kolonisering (Figur 2A).
- Forbered suspension indeholdende P. aeruginosa dagen for instillation efter O / N vækst (afsnit 2.2).
- Bedøver kortvarigt hjælp inhaleret Sevofluran som beskrevet ovenfor (afsnit 3.1).
BEMÆRK: For at udføre akut lungeinfektion, anbefalede bakteriel byrde er foreslået iTabel 1. - Indgyde musen som beskrevet ovenfor (afsnit 3.2) med særlig vægt på post-instillation opsving.
5. Måling af Lung Injury Indeks
- Forbered en opløsning indeholdende FITC-mærket albumin. Injicere denne løsning 2 timer før dyr dødshjælp.
- 0,2 mg albumin-FITC afvejes med passende udstyr.
- Tilsæt 0,2 mg i 1 ml PBS. Kort fortalt vortex. Hvis det ikke anvendes straks, skal du placere løsningen i folie for at undgå udsættelse for omgivende lys.
- Injicere intraperitonealt 200 pi FITC-mærket albumin-opløsning til hver mus.
- Eutanasi
- Musene for den sidste vægt data afvejes.
- Aflive en enkelt mus i overensstemmelse med lokal anvendelse af dyr til forskning udvalgets retningslinjer ved hjælp af en intraperitoneal injektion af en dødelig overdosis af pentobarbital: 300 pi 5,47% pentobarbital.
- Fjern musen fra buret og modtager lethal injektion ved operatøren.
- Efter injektion, overføre musen alene til en anden buret, skjult fra alle andre dyr. Overhold musen, indtil fravær af bevægelse. Bekræft døden er ved fravær af bevægelse, især respiratorisk bevægelse, manglende puls.
- Udfør kirurgisk samling af prøver på døde dyr, derfor uden bedøvelsesmidler eller analgetika.
- Kirurgisk prøvetagning: Thorax etape.
BEMÆRK: For at opretholde sterile forhold, er al kirurgi udføres ved hjælp af sterilt udstyr i et biosikkerhed niveau 2 miljø.- Anvend ethanol på huden. Udfør en midterlinjen hudincision fra brystbenet til midten maven med en saks. Fra midterlinjen Incise langs brystkassen på begge sider. Fold huden på hver side af thorax at visualisere brystkassen.
- Udfør en lodret indsnit i brystkassen på begge sider går op mod kraveben med henblik på at være i stand til at læne sig tilbage hele forreste brystvæg med agterendenum giver den perfekte visualisering af hjerte og lunger (figur 5A, 5B).
- Indsamle blod under anvendelse af en præ-heparined sprøjte ved at punktere hjertet ved siden af interventrikulære arterie. Trække et minimum af 500 pi at opnå mindst 100 pi plasma. Placer blodprøven på is.
- Udfør en midtlinie cervikal incision at visualisere luftrøret (figur 5B og 5C). Dissekere forsigtigt fascia omkring luftrøret. Placer en sutur bag luftrøret (figur 5C og 5D). Efterfølgende suturen vil blive lukket omkring kanylering nålen for at sikre korrekt udskylning.
- Selvkaterisation luftrøret ved hjælp af 20-G modificeret gavagenål (figur 5D og 4A). Bind en kirurgisk knude omkring kanyle luftrøret med den tidligere placeret sutur.
- For at udføre bronchoalveolære udskylninger (BAL), blidt og gradvist injicere og tegne 500 pi iskold PBS i / fra lungerne. Anbring prøven på ice for at undgå cellelysis.
- Gentag trin 5.3.6, 3 gange for at opnå i alt 1.500 pi BAL fluid og pool udskylningsprøver i en 2 ml centrifugerør (figur 5E).
- Fjern lungerne fra brystet. Placer en lunge segment (størrelse skal svare til halvdelen af en lunge eller en lap) i 1,5 ml centrifugerør og lagre hurtigt ved - 80 ° C.
- Placer en lunge segment i en præ-vejet hæmolyse rør indeholdende PBS til at bestemme bakteriel byrde og placere den på is.
- Kirurgisk prøvetagning: abdominal etape.
- Foretag en ny snit på venstre side af underlivet. Overhold milten gennem bughinden.
- Fjern milten og anbringes i en anden hæmolyse rør indeholdende 1 ml PBS og anbring på is.
- Lungebeskadigelse indeks
BEMÆRK: alveolær-kapillære membran permeabilitet vurderes ved at måle FITC-mærket albumin lækage fra det vaskulære rum til alveolær-interstitial rum.- Centrifuge blodprøve og BAL-væsken i 10 minutter ved 1.500 x g. Saml supernatanterne til nye centrifugeglas. Pillerne svarer til rekrutteret plasma eller BAL-celler, og skal placeres på is.
- Tilsæt 100 pi af hver supernatant blod (plasma, gul) eller BAL supernatanten overføres til en 96-brønds transparent plade (300 pi brønde). Placer en folie på pladen, hvis den ikke anvendes straks.
- Mål fluorescens niveauer i plasma og BAL supernatanter under anvendelse af en fluorescens mikropladelæser (excitation, 487 nm; emission, 520 nm).
- Bestem lungeskader indeks ved at beregne fluorescensforholdet [(BAL supernatant / blod supernatant) x 100].
- Bronchoalveolær lavage (BAL) differential celletal.
BEMÆRK: Brug cellepelletten opnået fra centrifugering af BAL væske ved trin 5.5.1.- Hvis det er nødvendigt, skal du bruge rød-cellelyse buffer. Der tilsættes 500 pi røde cellelysebuffer i centrifugerøret indeholdende cell pellet. Kortvarigt vortex og efterlade 10 minutter på is. Tilsæt 500 pi PBS at stoppe røde cellelyse.
- Harvest cellerne ved centrifugering i 10 minutter ved 1.500 x g. Fjern supernatanten og suspenderer cellepelleten i 1 ml sterilt PBS. Opregne celler på en Mallassez hematocytometer. Ved hjælp af en hæmacytometer til Grev celler. Koncentrer celler på et dias med en cytospin.
- Stain celler ved hjælp af farve-kit til identifikation og optælling (makrofager, lymfocytter, neutrofile) celle.
- Lung bakteriel byrde og bakteriel udbredelse
BEMÆRK: For at vurdere lunge bakteriel byrde og bakteriel udbredelse, lunger og milt blev henholdsvis indsamles og lagres i præ-vejet hæmolyse rør indeholdende 1 ml PBS (trin 5.3.9).- Hæmolyse rør indeholdende 1 ml PBS og enten lunge eller milt vejes. Homogenisere prøverne med en vævshomogenisator at opnå lungehomogenater og milt homogenater.
- Indbetal 100 ul væv homogenates i centrifugerør indeholdende 900 pi sterilt PBS til opnåelse af serielle fortyndinger. logaritmiske
- Plate de to sidste passende fortyndede prøver (10 -3 og 10 -2) på enten BCP-agar for P. aeruginosa eller YPD-amikacin-suppleret agar for C. albicans lunge og milt byrde bestemmelse.
- Inkubér pladerne O / N ved 37 ° C. Den følgende dag, opregne de kolonier på pladerne.
- Indeks resultatet til lungevægt for at opnå en CFU per gram lunge. Lunge stikprøvestørrelser er ikke det samme, resultaterne skal udtrykkes i CFU per gram lunge.
Formel for indekset er: [CFU] x [vægten af hæmolyse rør og lunge] - [vægten af hæmolyse rør].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som set tidligere i protokolbeskrivelse, eksperimentet behov 5 dage at fuldføre (Figur 1: eksperiment tidslinje). En operatør er indhentet under hele køre af eksperimentet og kan håndtere processerne op til et maksimum på 10 mus. Hvis der kræves flere dyr, der er brug for to personer især for kirurgisk prøveindsamling. Faktisk alle prøver skal opsamles i henhold til 2 timer for at undgå en øget passiv alveolær-kapillær lækage af FITC-mærket albumin i de sidste mus.
Det første skridt er udarbejdelsen af C. albicans inoculum og intranasal instillation at opnå luftvejene kolonisering ved C. albicans. En 4 dage persistens model opnås ved intranasal instillation af 5 x 10 5 CFU C. albicans per mus (figur 2B). I løbet af disse 4 dage, mus tage på i vægt (figur 2A) og instillation af 5x10 5 CFU ikke inducerer lung skade (Figur 2C). Selvom C. albicans kan vare op til 4 dage i denne model, belastning falder efter 48 timer. Derfor P. aeruginosa -induceret akut lungeinfektion er perfomed ved 48 timers C. albicans vedholdenhed.
P. aeruginosa stamme PAO1 er en stort set kendetegnet laboratoriestamme omfatter den vigtigste virulensfaktor, typen tre-sekretion systemet (T3SS), som i 75% af de kliniske isolater lunge 15. Af disputatser grunde PAO1 er en relevant belastning i dyremodeller for akut lungeinfektion. Lungeskader vurderes gennem alveolo-kapillar permeabilitet målt ved protein lækage fra det vaskulære rum i luftvejene udtrykt som lungeskade indekset. Lungebeskadigelse stiger med inoculum (figur 3A). Her rapporterer vi kinetikken af akut lungeskade bestanddel af vor model induceret af PAO1-stamme (5x10 6 CFU / mus) (figur 3B-3F) alene uden forudgåendeC. albicans- medieret priming. Afhængigt af belastning og tidsforløbet af modellen, valget af oprindelige P. aeruginosa inokulum diskuteres i næste afsnit, og foreslås i tabel 1.
Fem mus per gruppe blev anvendt. Lungeskader indeks (figur 3B), bakteriel belastning i lungen (figur 3C), bakteriel belastning i milten, hvilket afspejler bakteriel udbredelse (figur 3D), BAL cellularitet (figur 3E) og differentieret celletal (figur 3F) blev bestemt hver 12 time. Lungebeskadigelse var maksimal mellem 24 timer og 36 timer efter infektion (figur 3B). Bakteriebyrden viste en 1-log CFU / ml mindske hver 24 timer (figur 3C). Kumulativ bakteriel udbredelse vurderet af milt homogenatet kulturer steg hver dag (figur 3D). Endelig Mens BAL cellularitet hos ikke-inficerede mus hovedsageligt er sammensat (90%) of alveolære makrofager, i BAL fra inficerede mus blev neutrofiler bredt rekrutteret og differentieret celletallet viste 90% neutrofiler og 10% makrofager og lymfocytter (figur 3E, 3F).
Figur 1. Tidslinje af akut lungeskade Model til Udforsk Host-medieret Samspil mellem C. albicans og P. aeruginosa.
Grafisk repræsentation af hele proceduren. Det første skridt er miljømæssig tilpasning af mus husets facilitet. Det andet skridt er C. albicans medieret luftveje kolonisering. Endelig er den tredje trin er den akutte lungeinfektion medieret af P. aeruginosa. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. C. albicans luftvej kolonisering.
(A, B) Mus intranasalt indpodet med 10 5 CFU C. albicans (stamme SC5314). Mus tager på i vægt under C. albicans -medieret luftveje kolonisering (A). Kolonisering af luftvejene kan forlænges til 3-4 dage med kun én oprindelige instillation. I en tidligere undersøgelse, priming af medfødte immunitet finder sted mellem 24 og 48 timer. (n = 5 pr gruppe), fejlsøjler repræsenterer middelværdier ± SD. (C, D) mus intranasalt inddryppet 5 x 10 5 eller 5 x 10 6 CFU C. albicans. Lungeskader indeks (C) vurderes af alveolær kapillær barriere-permeabilitet på 24 timer. Vægtforøgelse (D) udtrykt som procent af oprindelige vægt (n = 5 pr gruppe).Fejlsøjler repræsenterer midler ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Model af akut lungeskade induceret af P aeruginosa.
(A) C57BL / 6J mus intranasalt inficeret med stigende belastninger af P. aeruginosa (fra 1 x 10 6 til 5 x 10 7 CFU pr mus) (n = 5 pr gruppe), fejlsøjler repræsenterer middelværdier ± SD. Mus aflives 24 timer. Lungeskader indeks bedømmes ved alveolær-kapillær barriere-permeabilitet, der stiger proportionalt med bakteriel belastning. Sammenligning af lungeskader indeks opnået ved hjælp af gamle metode med lungehomogenater supernatanter (sorte søjler) og ny kombineret-metoden ved hjælp bronkoalveolære lavage supernatanter (grå bars) (BF) mus inden nasalt inficeret med 5 x10 6 CFU pr mus. Mus aflives hver 12 til 48 timer til akut skade model kinetik. Lungeskader (B), lunge bakteriebyrden (C), milt bakteriebyrden (D), bronchoalveolær lavage (BAL) cellularitet (E) og BAL forskellen celletal (F) er også vurderes. (n = 5) pr gruppe, fejlsøjler repræsenterer midler ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kirurgisk Udstyr og Intranasal Instillation.
(A) Kirurgisk udstyr, der kræves for at udføre akut skade model og bronchoalveolær udskylning. Her trakealkanyle (20G) og de to 1 ml sprøjter er forbundet til en luer-lock 3-vejs ventil. En sprøjte til at injicere vand ind i lungerne, en til at trække bronchoalveolar fluid tilbage ud fra lungerne. (B, C) Placering af musen i hånden til at udføre den intra-nasal instillation. I dette billede, tommelfingeren under kæben sikrer en lukket mund under instillation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Kirurgi og Broncho-alveolær udskylning.
Brystet er bredt åbnes (A), og brystkassen åbnes sideværts for at undgå skade på hjertet (B). Efter opsamling af blod, er det cervikale område blev dissekeret for at blotlægge trachea (C). Tandtråd anvendes somsutur og er gået forbi luftrøret (C, D). Luftrøret derefter kanyleret med 20-G kanyle kombineret (D) monteret på sprøjten og 3-vejsventil. Luftrøret skal være fuldt sikret omkring kanylen ved at binde en kirurgisk knude ved hjælp af suturen på plads bag luftrøret. Endelig 500 pi PBS forsigtigt indpodet i lungerne og derefter BAL forsigtigt trukket ud. (E) Fluid-indpodet lunger. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Minimal indpodet Burden | Maksimal indpodet Burden | |
| T3SS- | 5 x 10 7 | 1 x 10 8 |
| T3SS + | 5 x 10 6 | 1 x 10 7 |
| T3SS + ExoU + | 5 x 10 | 1 x 10 5 | |
Tabel 1. P. aeruginosa Podestoffer Bruges i akut lungeinfektion Models.
Foreslåede optimale intranasale koncentrationer af podestoffer at inducere akut lungeskade ifølge stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyremodeller, især pattedyr, er nyttige til at belyse komplekse mekanismer værtspatogene interaktion på områderne immunitet. Selvfølgelig behovet for information kun hos dyremodeller skal være af afgørende betydning; ellers skal anvendelsen af dyr blive erstattet af in vitro-modeller. Denne dyremodel illustrerer den indsigt, som kun kan leveres af en dyremodel Da interaktionen mellem patogener medieres af en multi-komponent værtsrespons. Mus i øjeblikket anvendes til at studere denne vært-patogen interaktion er unge voksne i alderen 6 til 10 uger med et svar moden og uændret immunrespons. Når fokus på medfødte immunreaktion, der C57BL6 / J baggrund mus foretrækkes. For at undgå en effekt af køn og hormonelle cyklus (især østrogen) på immunreaktionen, er således det bedste valg hanner. For at opnå statistisk signifikans, skal grupperne have mindst 5 individer ved slutningen af eksperimentet, men som foreslået af alle animalske eksperimenterendetation retningslinjer, bør antallet af dyr, der anvendes reduceres og raffineret til et absolut minimum.
Transport fra opdrætteren give dyrene til forskning facilitet fremkalder stress hos mus. Konsekvensen er en øget sekretion af inflammatoriske cytokiner, der kan ændre efterfølgende eksperimenter som vores. Desuden et nyt miljø og nye "bur kammerater" bidrage til stress. Derfor skal mus være akklimatiseret i mindst syv dage før at studere i deres nye bolig miljø. Denne bolig miljø skal kontrolleres, leverer standard mad og vand ad-libitum, en dag / nat cyklus, og passende stabil luftfugtighed og temperatur.
Både lunge kolonisering og lungeinfektion modeller kræver praksis og fingerfærdighed. Inddrypning kan udføres intranasalt eller intra-trachealt. Sidstnævnte er mere vanskeligt og kræver større ekspertise gennem uddannelse på grund af en høj risiko for anoxisk hjertestop. Faktisk PRocedure kræver at kunne intubere en mus på mindre end 15 sekunder, og derfor kræves dybere anæstesi. Vores valg af intranasal inddrypning er lettere at udføre, da administrationsvejen er tilgængelig, mindre risikabelt kræver lettere anæstesi og er derfor mere reproducerbar.
Boutoille m.fl. allerede beskrevne vores akut lungeskade model, især vurderingen af lungeskader ved måling af alveolær-kapillær barriere permeabilitet ved hjælp FITC-mærket albumin 16. For at reducere antallet af mus pr eksperiment blev denne metode tilpasset og koblet med bronchoalveolær lavage (BAL). I undersøgelserne af Boutoille et al anvendte vi en sammenligning mellem fluorescensen af FITC-mærket albumin i lungehomogenisat supernatanter og blodet supernatanterne 17.
For fuldt ud at udføre denne sammenligning er hæmoglobinniveau og hæmatokritværdier også påkrævet. Denne metode blev tilpasset til Allow samtidig analyse af værtens respons ved at afsætte ene lunge homogenisering og vurdering af lungeskader og den anden til udskylning og undersøgelse af værtsreaktion. Faktisk kan BAL fluid anvendes til at vurdere cytokinniveauer, protein sekretion og celletilgang. Vores tilpasning giver flere resultater fra et enkelt dyr eksperiment, hvilket reducerer omkostningerne og det krævede antal mus, især når der anvendes knock-out-mus 17 som anbefalet i dyreforsøg retningslinjer. Desuden er en del af lungen holdt ved -80 ° C til at udføre total RNA-ekstraktion og kvantitativ polymerasekædereaktion eller histologisk analyse. Sammenligning mellem den tidligere fremgangsmåde og det nye tilpasset fremgangsmåde kombineret med BAL viser sammenlignelige resultater (figur 3A) for at vurdere lungeskade indeks.
I undersøgelsen af Mear et al, under anvendelse af de samme procedurer, flowcytometer analyse blev udført på BAL-celler opnået ved centrifugering af BAL-væsken. Lignende ennalyses blev udført på totale pulmonale celler fra lungerne 12. I dette tilfælde kan lungeskade vurdering med FITC-mærket albumin ikke udføres samtidig, på grund af artefakter fremkaldt af FITC (samme kanal end grøn fluorescens protein). Derfor, hvis flowcytometri er påkrævet, forsøg skal planlægges i overensstemmelse hermed.
Timingen af eutanasi er kritisk. Et tidsforløb for den akutte lungeinfektion model over den første 72 timer er vist figur 3. I denne model forekommer den højdepunktet af lungeskader og vært reaktion mellem 24 og 36 timer (figur 3). Således i vores design 24 hr endepunkt blev valgt som udlæsning for 3 grunde: For det første, er det let at organisere sig i laboratoriet, dels for at undgå tab af mus på grund af mortalitet mellem 24 og 36 timer, og endelig fordi værtsrespons var maksimal på dette tidspunkt.
Det første skridt i vores interaktion undersøgelse er den kolonisering af luftvejene med <em> C. albicans. Ved anvendelse af en instillation af 10 5 CFU pr mus, er en 4-dages persistens model opnås uden nogen lungeskade. Faktisk fik mus vægt over tidsforløbet for denne fase. Vægtøgning er en nyttig indikator for manglende skade i overensstemmelse med kolonisering i modsætning til infektion. Faktisk en forøget første indlæsning (over 10 6 CFU pr mus) induceret lungeskade (figur 2C) og en skadelig host-respons langt ud priming, i hvilket tilfælde mus tabte vægt (Figur 2D). Tværtimod anvendelse af en mindre indledende indlæsning (f.eks 10 4 CFU pr mus) en luftvej persistens model kunne ikke opnås. For således at opnå den observerede priming af værtsimmunitet beskrevet af Mear et al 12, kalibrering af indpodet fungal belastning er afgørende for succes og overvågning af vægten kurve er en central styring.
Samme præcision er nødvendig for P. aeruginosa og P. aeruginosa fjernes hurtigt fra luftvejene af en passende vært-reaktion. Ved hjælp af en alt for høj initial P. aeruginosa overgår kapacitet vært forsvar eller endda fremkalder en uhensigtsmæssig og derleterious reaktion resulterer i belastning fører til massiv akut skade og død slette alle forskelle mellem grupperne. Den optimale inokulum at inducere akut skade afhænger af tilstedeværelsen af et funktionelt type 3 secerneringssystem (T3SS) og produktionen af exotoksin U, et toksin omplantes af T3SS i værtscellens cytoplasma. Disse to stammespecifikke egenskaber skal overvejes i valget af den oprindelige bakterielle belastning. Indledende bakterielle byrder er foreslået i denne artikel som eksempler på nedre og øvre grænser for at inducere akut lungeskade med T3SS-negativ eller positiv belastning, og stammer, der producerer exotoksin U eller ej (tabel 1). Når man studererinddragelse af T3SS, stamme skal dyrkes O / N og genoplivet med nye LB-medium 3 timer før fremstillingen af inoculum for at opnå optimal aktivitet T3SS.
Bestemmelsen af bakteriel og svampe byrde 24 timer efter P. aeruginosa -induceret lungeinfektion kræver særlige overvejelser diskuteret i dette afsnit. Faktisk som vist, når mus inficeres med 5 x 10 6 CFU T3SS-positive stamme, bakteriebyrden i lungerne ved 24 HR faldt til ca. 1 log (figur 3C). Seriefortyndinger af prøver skal udføres op til 5-log fortynding og udpladet på BCP-agarplader. Vedrørende C. albicans i lungerne, efter 72 timer, er svampe byrde faldt til ca. 2 log og prøver skal der skal udpladet på YPD-agar suppleret med amikacin at lette koloni identifikation. Endelig kan bestemmelse af bakteriel spredning vurderes ved at udplade 100 pi blodprøve på BCP-agar eller ved at udplade 100 pi milten homogenates på samme medium. Var allerede blevet sammenlignet de to metoder og milt kultur synes at være mere præcis. Faktisk milten er et organ, som "filtre" fuldblod og kan "koncentrere" og bevare bakterier har formidlet på blodet. Således milt homogenater afspejler den systemiske bakterielle udbredelse under akut lungeinfektion med en højere følsomhed end blod. Blodprøver repræsenterer bakteriel spredning på et meget specifikt givet tidspunkt og kan ikke virkelig afspejler fænomenet bakteriel udbredelse som helhed. Derfor milt homogenatet kulturer foretrækkes.
Lungeskade indeks er et følsomt vurdering af lungeskade som følge af infektion og / eller uhensigtsmæssig værtsrespons og virkningen af potentielle lægemidler på disse komponenter. Desuden er denne i viv o model tillader samling af flere forskellige prøver for at studere host reaktion. Lung kan anvendes til RNA-ekstraktion og analyseaf gentranskription. Lung prøver kan også placeres i paraformaldehyd (PFA) til yderligere histologiske observationer. BAL-væsken kan anvendes til vurdering af protein sekretion såsom inflammatoriske cytokiner. Endelig, som beskrevet ovenfor protokollen kan tilpasses til at levere prøver til flowcytometri analyse.
Endelig kan denne protokol tilpasses til modelize C. albicans- mikrober interaktion involveret i respirator-pneumoni, såsom Staphylococcus aureus 18 eller Enterobacteriae. En anden tilpasning kan således være luftvejene kolonisering ved hjælp af bakterier i stedet for C. albicans at modelize bakteriel interaktion i kronisk suppurativ lungesygdom såsom bronchiectasis. Med henblik herpå har immunkompromitterede mus, der skal anvendes, da bakteriel clearance i immune kompetent mus ikke tillader en vedvarende luftveje kolonisering.
Til instillation, positionen af hånd, der holder dyret er critisk. Som allerede understreget i det foregående afsnit, når intra-nasalt indgyde musen, skal operatøren sikre, at munden er perfekt lukket for at undgå opspyt af løsningen. Tommelfingeren støtter kæben og opretholder munden lukket under hele proceduren instillation (figur 4B). Derefter med den anden hånd, bliver pipetten afsat på et næsebor (figur 4C) og opløsningen gradvis og forsigtigt indpodet uden luft for at forhindre bobledannelse. Selvfølgelig skal inddrypning udføres i et niveau 2-biosikkerhed kabinet.
Indsamling af prøver forudsætter Certifed små dyr kirurgisk uddannelse af operatøren. På hvert trin skal prøverne placeres på is for at undgå cellelysering og bevare proteiner fra denaturering. Grundlæggende kirurgiske instrumenter er påkrævet (figur 4A). De skal til at blive steriliseret ved autoklavering før anvendelse. Det anbefales, at forskellige kirurgiske instrument sæt anvendes til abdominal og thorax kirurgiske trin, undgå krydskontaminering af lunge prøver. De forskellige kritiske trin i kirurgisk dissektion præsenteres (figur 5A-5E). Position i det murine er kritisk; dyret skal immobiliseres fladt på det tilbage hoved modsat fra operatøren og lige. Ethanol bør rundhåndet anvendes til prep før den første indsnit for at undgå spredning af hår i prøverne og potentiel bakteriel kontaminering fra huden. Skin er godt vaskulariseret og skal trækkes forsigtigt for at undgå blødning (figur 5A).
Derefter brystkassen er tilbagelænet efter en lateral bryst snit hvorunder brystkassen skal konstant holdes i pincet greb for at undgå skade på hjertet og lungerne under snittet. Lunge og hjerte er udsat (figur 5B). Uinficerede lunge hvidlig (figur 5B). Dissektion af cervikale område udsætter luftrør og en sutur er bilefully placeret bag den øvre luftrør (figur 5C). Kanylering luftrøret skal udføres med forsigtighed. Brug ikke en overdimensioneret kanyle (maksimal størrelse er 20 G). En lille forreste indsnit i membranagtige luftrøret mellem to bruskspidserne ringe tillader indsætning af kanylen. Når kanylen er observeret af gennemsigtighed gennem luftrøret over carina (figur 5D), er suturen stramt bundet omkring trachea fastgør den omkring kanylen (fig 5E). Kanylen er forbundet til en 3-vejs Luer-lock ventil med 2 sprøjter forbundet til de kvindelige havne. En sprøjte indeholder iskold PBS for bronchoalveolær lavage; den anden er tom til at trække BAL-væsken. Disse sprøjter skal chaged mellem grupperne.
Afslutningsvis priming før akut lungeskade model er en relevant og kraftfuld model til at undersøge in vivo værtsmedierede interaktioner mellem patogener. Anvendelsen af dyr erstørste begrænsning og bør nøje afvejes mod de oplysninger fås i vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sevorane, Sevoflurane | Abott | 05458-02 | 250 ml plastic bottle |
| Fluorescence Reader Mithras LB940 | Berthold Technologies | reference in first column | no comment |
| Bromo-cresol purple agar | Biomerieux | 43021 | 20x per unit |
| Pentobarbital sodique 5.47% | CEVA | 6742145 | 100 ml plastic bottle |
| 2-headed valve | Distrimed | 92831 | no comment |
| Sterile inoculation loop 10 µl | Dutscher | 10175 | x1,000 conditioning |
| Insuline syringes 1 ml | Dutscher | 30003 | per 100 conditioning |
| 2 positions Culture tube 8 ml | Dutscher | 64300 | no comment |
| Ultrospec 10 | General Electric life sciences | 80-2116-30 | no comment |
| Hemolysis tubes 13 x 75 mm | Gosselin | W1773X | per 100 |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life technologies | 10010023 | packaged in 500 ml |
| amikacin 1 g | Mylan | 62516778 | per 10 |
| Heparin 10,000 UI in 2 ml | Pan pharma | 9128701 | 10x per unit |
| RAL 555 coloration kit | RAL Diagnostics | 361550 | 3 flacons of 100 mL |
| 1.5 ml microcentrifuge tube | Sarstedt | 55.526.006 | x 1000 |
| Transparent 300 µl 96-well plate | Sarstedt | 82 1581500 | no comment |
| Yest-peptone-Dextrose Broth | Sigma | 95763 | in powder |
| FITC-albumin | Sigma | A9771 | in powder |
| Luria Bertani Broth | Sigma | L3022 | in powder |
| 25-gauge needle | Terumo or unisharp | A231 | x 100 conditioning |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | no comment |
References
- Casadevall, A., Pirofski, L. -A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).
- Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. , (2012).
- Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).
- Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
- Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).
- Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).
- Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. , (2013).
- Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
- Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).
- Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
- Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. , 1-33 (2009).
- Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
- Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).
- Faure, E., Mear, J. -B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
