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Immunology and Infection

Etudier communautés microbiennes doi: 10.3791/53218 Published: January 13, 2016

Abstract

Étude de l'interaction hôte-pathogène nous permet de comprendre les mécanismes sous-jacents de la pathogénicité lors d'une infection microbienne. Le pronostic de l'hôte dépend de l'implication d'une réponse immunitaire adaptée contre l'agent pathogène 1. Réponse immunitaire est complexe et les résultats de l'interaction des pathogènes et plusieurs types cellulaires immunitaires ou non immuns 2. Des études in vitro ne peuvent pas caractériser ces interactions et de se concentrer sur les interactions cellulaires-pathogène. En outre, dans les voies respiratoires 3, en particulier chez les patients atteints de maladie pulmonaire chronique purulente ou chez les patients ventilés mécaniquement, communautés polymicrobiennes sont présents et compliquent l'interaction hôte-pathogène. Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans sont à la fois problème pathogènes 4, fréquemment isolés à partir d'échantillons trachéo-bronchique, et associée à des infections graves, en particulier en unité de soins intensifs 5. Microbiens ont interactionsété signalés entre ces agents pathogènes in vitro, mais l'impact clinique de ces interactions reste incertaine 6. Pour étudier les interactions entre C. Albicans et P. aeruginosa, un modèle murin de C. albicans colonisation des voies respiratoires, suivi d'un P. infection pulmonaire aiguë aeruginosa- médiation a été effectuée.

Introduction

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Des modèles animaux, en particulier des souris, ont été largement utilisés pour étudier les réponses immunitaires contre des agents pathogènes. Bien que l'immunité innée et acquise diffèrent entre les rongeurs et les humains 7, la facilité pour la reproduction et le développement des ouvertures pour de nombreux gènes, font souris un excellent modèle pour étudier les réponses immunitaires 8. La réponse immunitaire est complexe et résulte de l'interaction d'un agent pathogène, la flore résidents microbiennes et plusieurs immunitaires (lymphocytes, les neutrophiles, les macrophages) et non-immunitaires (cellules épithéliales, cellules endothéliales) types cellulaires 2. Des études in vitro ne permet pas l'observation ces interactions complexes et se concentrent principalement sur les interactions uniques cellules pathogènes. Alors que les modèles animaux doivent être utilisés avec prudence et limitées à des questions très précises et pertinentes, des modèles de souris fournissent un bon aperçu de la réponse immunitaire des mammifères in vivo et peuvent porter sur des parties de 7 questions cliniques importantes.

6. Alors que ce qui constitue un microbiome des voies respiratoires "normale" reste à déterminer, les communautés résidentes sont souvent polymicrobiennes, et proviennent de diverses sources écologiques. Les patients atteints de maladie chronique suppurée pulmonaire (fibrose kystique, bronchectasies) ou les patients ventilés mécaniquement présentent une flore particulière en raison de la colonisation des voies aériennes par des microorganismes de l'environnement acquises 9. Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans sont à la fois problème pathogènes 5, souvent isolé ensemble à partir d'échantillons trachéo , et responsable d'infections opportunistes graves chez ces patients, en particulier dans l'unité de soins intensifs (USI) 4.

Isolement de ces micro-organismes lors de la pneumonie aiguë dans les résultats de l'USI dans le traitement anti-microbienne contre P. aeruginosa but levure sont généralement pas considérés pathogène sur ce site 5. interactions in vitro entre P. aeruginosa et C. albicans ont été largement publiées et a montré que ces micro-organismes peuvent affecter la croissance et la survie de l'autre, mais les études ne pouvaient pas conclure si la présence de C. albicans est nuisible ou bénéfique pour l'hôte 10. Des modèles de souris ont été développés pour répondre à cette pertinence de P. aeruginosa et C. albicans in vivo, mais l'interaction entre les microorganismes n'a pas été le point clé. En effet, le modèle a été créé pour évaluer l'implication de C. albicans dans la réponse immunitaire de l'hôte, et le résultat.

Un modèle précédent établi par Roux et al déjà utilisé une colonisation initiale avec C. albicans suivie par une infection pulmonaire aiguë induite par P. aeruginosa. Grâce à leur modèle, les auteurs ont trouvé un rôle délétère de prieur C. albicans colonisation des 11. Cependant Roux et al ont utilisé une charge élevée de C. albicans dans leur modèle avec 2 x 10 6 UFC / souris pendant 3 jours consécutifs. Nous avons établi un modèle de 4 jours de C. albicans voies respiratoires colonisation, ou du moins sans la persistance des lésions pulmonaires, Dans ce modèle C. albicans a été récupéré jusqu'à 4 jours après l'instillation d'une seule de 10 5 UFC par souris (figure 2B) 12,13. Après 4 jours, aucune preuve de recrutement de cellules inflammatoires, production de cytokines inflammatoires, ni altération de l'épithélium a été observée. À 24 - 48 h, à la présence de pic de C. albicans, même si une réponse immunitaire innée cellulaire et cytokine a été observée, il n'y avait aucune preuve de lésions pulmonaires. De manière surprenante, les souris ainsi colonisés par C. albicans 48 h avant l'instillation intranasale de P. aeruginosa avait atténué l'infection par rapport à des souris avec P. aeruginosa infection seul. jen fait, les souris exposées lésion pulmonaire moindre et une diminution de la charge bactérienne 12,13.

Plusieurs hypothèses pourraient expliquer cet effet bénéfique de la colonisation avant avec C. albicans sur P. aeruginosa médiée infection pulmonaire aiguë. D'abord, une diaphonie interspécifique impliquant chacun des microorganismes des systèmes de détection de quorum, le P. base homoserinelactone- et le système aeruginosa basé farnesol C- système albicans, ont été évalués. Deuxièmement, C. albicans agissant comme une cible "leurre" pour P. aeruginosa détourner l'agent pathogène à partir de cellules épithéliales pulmonaires a été étudiée. Les deux hypothèses ont été invalidés (données non publiées). La troisième hypothèse est celle d'un "amorçage" du système immunitaire inné de C. albicans responsable d'une réponse innée subséquente accrue contre P. aeruginosa. Cette dernière hypothèse a été confirmée. En effet C. albicans colonisation a conduit à un amorçage de l'immunité innée through IL-22, principalement sécrétée par les cellules lymphoïdes innées, ce qui entraîne une augmentation de la clairance bactérienne et réduit les lésions pulmonaires 12.

En conclusion, l'hôte est un acteur central dans l'interaction entre les microorganismes modulant la réponse immunitaire innée et impliquant différents types de cellules inflammatoires. Bien que ces interactions immunitaires complexes peuvent être disséqués in vitro les hypothèses de départ ne peuvent être fournis par des mesures appropriées de modèles in vivo. Le protocole suivant fournit un exemple d'étude in vivo de l'agent pathogène interaction hôte-médiation qui peut être adapté à d'autres micro-organismes.

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Protocol

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Le comité régional d'éthique régional pour l'expérimentation animale a approuvé cette méthode, en conformité avec soin et l'utilisation des animaux national et international dans les lignes directrices de recherche expérimentaux.

Collection 1. Echantillon

  1. Stockage des échantillons
    1. Recueillir tous les échantillons et immédiatement stocker à - 20 ° C ou sur de la glace jusqu'à ce que l'entreposage au congélateur pour éviter la détérioration. Placez phosphate stérile saline tamponnée (PBS) sur la glace pour améliorer lavages broncho-alvéolaire (LBA) performance.
  2. Chirurgie
    1. Stériliser tous les équipements chirurgicale en utilisant un autoclave.
      NOTE: Si possible, il est recommandé d'utiliser deux ensembles différents d'instruments pour les étapes abdominale et thoracique pour éviter la contamination croisée. Équipement de dissection requise est détaillée dans la figure 4A

2. Les souris, bactéries et de levures Souches

  1. Les souris domestiques en conformité avec l'utilisation locale des animaux dans reGuide du comité de recherche dans un rack ventilé sans dépasser 5 souris par cage, avec de la nourriture et de l'eau ad lib, dans un centre d'hébergement de biosécurité de niveau 2 en raison de l'utilisation de niveau de biosécurité 2 micro-organismes: P. aeruginosa et C. albicans.
  2. Conserver les souches bactériennes à -80 ° C dans du milieu de glycérol à 40%.
    1. Ajouter bactéries directement à partir de stock congelé dans le tube de culture contenant 3 ml de bouillon Luria-Bertani stérile en utilisant une boucle d'inoculation de 10 pi. Laissez O / N à 37 ° C avec agitation orbitale (400 rpm) le jour avant l'instillation.
    2. Récolte bactéries par centrifugation à 2000 g pendant 5 min.
    3. Aspirer le surnageant dans une élimination des déchets biologiques dangereux fermé approprié. Observer blanc adhérent culot au fond du tube de culture.
    4. Laver le culot et suspendre l'aide de 5 ml de PBS.
    5. Répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.3 un deuxième temps d'effectuer un second lavage.
    6. Remettre en suspension les bactéries en culot à l'aide de 1 ml de PBSet une brève vortex.
    7. Déterminer la densité de l'inoculum en utilisant un densitomètre optique à 600 nm en utilisant un compteur de densité optique. Une densité de 0,9 correspond à 10 9 CFU / ml pour PAO1, diluer en conséquence.
      Remarque: Ce résultat doit être obtenu pour chaque souche utilisée en déterminant la densité des dilutions successives d'un inoculum calibré.
    8. Vérifiez l'inoculum par dilutions logarithmiques série et plaque 100 pi de chaque dilution sur agar pourpre de bromocrésol (BCP) plaques et O / N culture. Administrer par voie intranasale chaque souris 50 ul de la solution contenant 1 x 10 8 à 8 x 10 deux UFC par ml (5 x 10 6 à 1 x 10 7 CFU par souris).
  3. Utiliser C. albicans SC5314 comme une souche de référence. Conserver la souche en milieu de glycérol à 40% à -80 ° C.
    1. Supplément bouillon de levure-peptone-dextrose avec 0,015% amikacine pour éviter la contamination bactérienne et faciliter davantage compte.
    2. Ajouter la levure en utilisant 10 &# 181; l inoculation boucle dans YPD-bouillon préparé complété avec l'amikacine O / N à 37 ° C.
    3. Levure récolte par centrifugation à 2000 g pendant 5 min.
    4. Retirer le surnageant dans une élimination des déchets de bioharzard appropriée. Blanc pastille adhérente doit être observée dans le fond du tube de culture.
    5. Laver et suspendre les bactéries en culot à l'aide de 5 ml de PBS et brève vortex.
    6. Répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.3 un deuxième temps d'effectuer un second lavage.
    7. Reprendre le culot en utilisant 1 ml de PBS et brève vortex.
    8. Déterminer la taille de l'inoculum en comptant sur un hématocytomètre Mallassez l'aide d'un microscope standard à un grossissement de 40x.
      REMARQUE: Concentration (en UFC / ml) est obtenue en utilisant la formule suivante: (nombre de levure 5 x 10) / (nombre de rectangles de la grille sur la comptées hématocytomètre Mallassez).
    9. Vérifier par dilution en série logarithmique à 10 -5 et 10 -6 pour confirmer que solution contenant 2 x 10 6 UFC / ml.
    10. Plate sur des plaques de gélose YPD additionné de 0,015% de l'amikacine.

3. Airways colonisation par C. albicans

REMARQUE: après adaptation à l'environnement, les souris sont pesées deux fois par jour.

  1. Sous une hotte, dépôt de 500 pi de sévoflurane sur un 4 cm x 4 cm de gaze (technique ouverte-goutte) 14.
    1. Immédiatement placer la gaze sur le plancher d'une chambre d'environ 750 ml d'induction. Placer immédiatement une plate-forme de type à maille en relief au-dessus de la gaze pour éviter le contact direct entre l'animal et la gaze.
    2. Fermer le couvercle étanche à l'air et attendre 1 à 2 minutes pour permettre la diffusion de sévoflurane dans la chambre.
    3. Transférer la souris de cage en plate-forme et fermer le couvercle de maille. Légère anesthésie avec la respiration spontanée conservé devrait être atteint dans 30 à 45 sec.
    4. Surveiller les hypotonie en observant la perte du réflexe de redressement à quel point la souris peut être retiré felon la boîte et inculqué.
  2. Instillation intranasale (peut être réalisée en 10 secondes par un opérateur formé).
    1. Maintenez la souris d'une seule main nichée sur son dos tenir debout (figure 4B).
    2. Utilisation de l'index, soutenir la tête et utiliser le pouce pour maintenir la mâchoire fermée pour éviter l'expectoration (figure 4C).
    3. Comme décrit à l'étape 2.3.8, veiller à ce que le prêt C. albicans solution contient 2 x10 6 UFC par ml pour un volume de 50 ul inculquées.
      NOTE: Le deuxième point critique est le volume instillé. Un volume inférieur à 50 pi pourraient entraîner une colonisation insuffisante ou l'instillation inhomogène des voies aériennes, un volume plus important peut provoquer la noyade / suffocation et la mort.
    4. Instiller la souris par voie intranasale en approchant la pipette pour les narines.
    5. Introduire à la pipette une baisse de 50 ul formant une bulle contenant la solution sur les narines, ensuite inhalé par le spontaneously respiration souris.
    6. Placez la souris dans une zone de récupération (par exemple, une grande cage nue bien aérée avec une lampe de chauffage frais généraux). Souris doit être surveillé jusqu'à l'éveil complet. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal et réflexe de redressement. À ce stade, la souris peut être retourné à une cage de logement normal.

4. P. pulmonaire aiguë des infections de aeruginosa

NOTE: Les souris sont pesées pendant les quatre jours suivants. Normalement, les souris prennent du poids pendant C. la colonisation des voies respiratoires albicans (Figure 2A).

  1. Préparer la suspension contenant P. aeruginosa le jour après l'instillation de O / N croissance (section 2.2).
  2. Anesthésier brièvement utilisant inhalé sévoflurane comme décrit ci-dessus (section 3.1).
    Remarque: Pour effectuer une infection pulmonaire aiguë, recommandé charge bactérienne sont suggérésTableau 1.
  3. Instiller la souris comme décrit ci-dessus (section 3.2) avec une attention particulière à la récupération post-instillation.

5. Mesure de l'indice des blessures du poumon

  1. Préparer une solution contenant de l'albumine marquée au FITC. Injecter cette solution 2 h avant l'euthanasie de l'animal.
    1. Peser 0,2 mg d'albumine-FITC avec l'équipement approprié.
    2. Ajouter 0,2 mg dans 1 ml de PBS. Brièvement vortex. Si pas utilisé immédiatement, placer la solution dans une feuille d'éviter l'exposition à la lumière ambiante.
    3. Injecter par voie intraperitoneale de 200 ul de solution d'albumine marquée au FITC pour chaque souris.
  2. Euthanasie
    1. Peser la souris pour la dernière donnée de poids.
    2. Euthanasier un simple clic, conformément à l'usage local des animaux dans les lignes directrices du comité de recherche à l'aide d'une injection intra-péritonéale de une surdose mortelle de pentobarbital: 300 pi de 5,47% pentobarbital.
    3. Retirer la cage de la souris et reçoit lethal injection par l'opérateur.
    4. Après l'injection, transférer la souris uniquement à une autre cage, caché de tous les autres animaux. Observez la souris jusqu'à ce que l'absence de mouvement. Confirmer la mort est par l'absence de mouvement, le mouvement particulier respiratoires, manque d'impulsion.
    5. Effectuer la collecte d'échantillons sur chirurgicale animaux morts, donc sans anesthésiques ni antalgiques.
  3. La collecte de l'échantillon chirurgical: stade de thoracologie.
    REMARQUE: Pour maintenir des conditions stériles, toute la chirurgie est effectuée en utilisant du matériel stérile dans un environnement de biosécurité de niveau 2.
    1. Appliquer l'éthanol à la peau. Effectuer une incision cutanée médiane du sternum à la mi abdomen avec des ciseaux. De la ligne médiane incise le long de la cage thoracique de chaque côté. Rabattre la peau de chaque côté du thorax de visualiser la cage thoracique.
    2. Effectuer une incision verticale de la cage thoracique de chaque côté en remontant vers les clavicules afin d'être en mesure de se reposer toute la paroi antérieure de la poitrine avec la poupeum permettant la visualisation parfaite du cœur et des poumons (figure 5A, 5B).
    3. Prélever le sang en utilisant une seringue pré-hépariné par ponction du coeur à côté de l'artère interventriculaire le. Retirer un minimum de 500 pi pour obtenir au moins 100 ul de plasma. Placer l'échantillon de sang sur la glace.
    4. Effectuez une incision cervicale médiane de visualiser la trachée (figure 5B et 5C). Disséquer soigneusement le fascia autour de la trachée. Placez une suture derrière la trachée (Figure 5C et 5D). Ensuite la suture sera fermé autour de l'aiguille de cannulating pour assurer un lavage adéquat.
    5. Sonder la trachée en utilisant l'aiguille 20 G modifiée gavage (Figure 5D et 4A). Faire un nœud chirurgicale autour de la trachée canule avec la suture placé précédemment.
    6. Pour effectuer lavages broncho-alvéolaires (BAL), doucement et progressivement injecter et d'en tirer 500 pi de PBS glacé dans / à partir du poumon. Placez l'échantillon sur iCE pour éviter la lyse cellulaire.
    7. Répétez l'étape 5.3.6, 3 fois pour obtenir un total de 1500 échantillons ul BAL de fluides et d'une piscine lavage dans un tube de centrifugeuse de 2 ml (figure 5E).
    8. Retirez les poumons de la poitrine. Placez un segment du poumon (la taille doit correspondre à la moitié d'un poumon ou d'un lobe) dans 1,5 ml tube de centrifugeuse et stocker rapidement à - 80 ° C.
    9. Placez un segment du poumon dans un tube à hémolyse pré-pesée contenant PBS pour déterminer la charge bactérienne et le placer sur la glace.
  4. La collecte de l'échantillon chirurgical: stade abdominale.
    1. Lancer une autre incision sur le côté gauche de l'abdomen. Observez la rate à travers le péritoine.
    2. Retirer la rate et le placer dans un deuxième tube à hémolyse contenant 1 ml de PBS et placer sur la glace.
  5. Lung indice de blessures
    REMARQUE: alvéolo-capillaire perméabilité de la membrane est évaluée en mesurant marqué au FITC-albumine de fuite provenant du compartiment vasculaire au-alvéolaire interstcompartiment initiaux.
    1. Centrifugeuse échantillon de sang et de fluide BAL pendant 10 min à 1500 x g. Recueillir les surnageants dans de nouveaux tubes de centrifugation. Les pastilles correspondent aux cellules plasmatiques ou BAL recrutés et devraient être placés sur de la glace.
    2. Ajouter 100 pi de chaque surnageant de sang (plasma, jaune) ou BAL surnageant dans un plaque à 96 puits transparent (300 ul puits). Placez une feuille sur la plaque si non utilisé immédiatement.
    3. Mesurer les niveaux de fluorescence dans le plasma et les surnageants BAL en utilisant un lecteur de microplaques à fluorescence (excitation, 487 nm; émission, 520 nm).
    4. Déterminer l'indice de lésion pulmonaire en calculant le rapport de fluorescence [(BAL surnageant surnageant / sang) x 100].
  6. Un lavage broncho-alvéolaire (BAL) numération cellulaire différentielle.
    REMARQUE: Utilisez le culot cellulaire obtenu de la centrifugation du BAL à l'étape 5.5.1.
    1. Si nécessaire, utiliser un tampon de lyse des globules rouges. Ajouter 500 ul de tampon de lyse des globules rouges dans le tube de centrifugeuse contenant le cell culot. Brièvement vortex et laisser 10 min sur la glace. Ajouter 500 pi de PBS pour arrêter la lyse des globules rouges.
    2. Récolte des cellules par centrifugation pendant 10 min à 1500 x g. Retirer le surnageant et suspendre le culot cellulaire dans 1 ml de PBS stérile. Énumérer les cellules sur un hématocytomètre Mallassez. L'utilisation d'un Hémacytomètre à compter les cellules. Concentrez-cellules sur une lame avec un cytospin.
    3. Cellules tache en utilisant le kit de coloration permettant l'identification de la cellule et le nombre (macrophages, les lymphocytes, les neutrophiles).
  7. Charge bactérienne pulmonaire et la diffusion bactérienne
    NOTE: Pour évaluer la charge pulmonaire bactérienne et la diffusion bactérienne, les poumons et la rate ont été respectivement recueillies et stockées dans des tubes à hémolyse prépesées contenant 1 ml de PBS (étape 5.3.9).
    1. Peser des tubes à hémolyse contenant 1 ml de PBS et soit poumon ou de la rate. Homogénéiser les échantillons avec un homogénéisateur de tissu pour obtenir des homogénats de poumon et de rate homogénats.
    2. Dépôt de 100 pi de l'homo de tissusgenates dans des tubes de centrifugeuse contenant 900 pi de PBS stérile pour obtenir des dilutions logarithmiques série.
    3. Plaque les deux derniers échantillons dilués appropriés (10 -3 et 10 -2) de chaque BCP-agar pour P. aeruginosa ou de l'agar YPD-amikacine supplémenté pour C. albicans poumon et de la détermination de la charge de la rate.
    4. Incuber les plaques O / N à 37 ° C. Le lendemain, énumérer les colonies sur des plaques.
    5. Indice le résultat du poids du poumon pour obtenir un CFU par gramme de poumon. La taille des échantillons pulmonaires ne sont pas les mêmes, les résultats doivent être exprimés en CFU par gramme de poumon.
      Formule de l'indice est: [CFU] x [poids du tube à hémolyse et poumon] - [poids du tube à hémolyse].

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Representative Results

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Comme vu précédemment lors de la description de protocole, l'expérience a besoin de 5 jours pour compléter (Figure 1: expérience timeline). Un opérateur est sollicité pendant la course entière de l'expérience et peut gérer les processus jusqu'à un maximum de 10 souris. Si plus d'animaux sont tenus, deux personnes sont nécessaires notamment pour la collecte de l'échantillon chirurgicale. En effet tous les échantillons doivent être prélevés en moins de 2 heures pour éviter une fuite de alvéolo-capillaire passive accrue de l'albumine marquée au FITC dans les dernières souris.

La première étape est la préparation de C. albicans inoculum et l'instillation intra-nasale pour obtenir la colonisation des voies aériennes par C. albicans. Un modèle 4-jour persistance est obtenu par instillation intranasale de 5 x 10 5 CFU de C. albicans par souris (Figure 2B). Durant ces 4 jours, les souris prennent du poids (figure 2A) et l'instillation de 5x10 5 UFC ne pas provoquer lblessure ung (figure 2C). Bien que C. albicans peut persister jusqu'à 4 jours dans ce modèle, la charge diminue après 48 h. Par conséquent, P. infection pulmonaire aiguë de aeruginosa est perfomed à 48 h de C. persistance albicans.

P. aeruginosa souche PAO1 est une souche de laboratoire largement caractérisé comprenant le principal facteur de virulence, du type système à trois sécrétion (SST3), que dans 75% des isolats cliniques du poumon 15. Pour les thèses raisons, PAO1 est une souche pertinente dans des modèles animaux d'infection pulmonaire aiguë. Lésion pulmonaire est évaluée par alvéolo-capillaire perméabilité mesurée par la fuite de protéine à partir du compartiment vasculaire dans les voies respiratoires exprimé l'indice de lésion pulmonaire. Lésions pulmonaires augmente avec l'inoculum (figure 3A). Nous rapportons ici cinétique de la composante de lésion pulmonaire aiguë de notre modèle induit par la souche de PAO1 (5x10 6 UFC / souris) (figure 3B-3F) seul, sans préalableC. albicans- amorçage médiation. Selon la souche et le temps bien sûr du modèle, le choix de la première P. aeruginosa inoculum est discuté dans la section suivante et est suggéré dans le tableau 1.

Cinq souris par groupe ont été utilisés. Lung indice de blessures (figure 3B), la charge bactérienne dans les poumons (figure 3C), la charge bactérienne dans la rate, ce qui reflète la dissémination bactérienne (Figure 3D), BAL cellularité (Figure 3E) et la numération cellulaire différentielle (figure 3F) on détermine toutes les 12 heure. Lésion pulmonaire était maximale entre 24 h et 36 h après l'infection (figure 3B). La charge bactérienne a montré une 1-log UFC / ml diminuer toutes les 24 heures (figure 3C). La dissémination bactérienne cumulative évaluée par des cultures de broyat de la rate augmente chaque jour (figure 3D). Enfin, bien que la cellularité BAL chez les souris non infectées est composé principalement (90%) of, les macrophages alvéolaires dans le BAL de souris infectées, ont été largement neutrophiles recrutés et numération cellulaire différentielle ont montré 90% -10% de neutrophiles et macrophages et des lymphocytes (Figure 3e, 3f).

Figure 1
Figure 1. Chronologie de la lésion pulmonaire aiguë Modèle à Explorer l'interaction hôte intermédiaire entre C. albicans et P. aeruginosa.
Représentation graphique de la procédure. La première étape est l'adaptation de l'environnement de la souris, la facilité de logement. La deuxième étape est C. albicans médiation voies respiratoires colonisation. Enfin, la troisième étape est l'infection pulmonaire aiguë médiée par P. aeruginosa. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 2. C. albicans voies respiratoires colonisation.
(A, B) souris sont instillées par voie intranasale avec 10 5 UFC C. albicans (souche SC5314). Souris gain de poids pendant C. la colonisation des voies respiratoires albicans (A). La colonisation des voies aériennes peut être prolongée jusqu'à 3-4 jours avec une seule instillation initiale. Dans une étude précédente, l'amorçage de l'immunité innée a lieu entre 24 et 48 h. (n = 5 par groupe), les barres d'erreur représentent les moyennes ± SD. Souris (C, D) sont instillés par voie intranasale 5 x 10 5 ou 5 x 10 6 CFU de C. albicans. Lung indice de blessures (C) évalué par alvéolaire perméabilité de barrière capillaire à 24 h. Le gain de poids (D), exprimé en pour cent du poids initial (n = 5 par groupe).Les barres d'erreur représentent les moyennes ± SD. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Modèle de lésion pulmonaire aiguë induite par P aeruginosa.
(A) souris C57BL / 6J par voie intranasale sont infectées avec des charges croissantes de P. aeruginosa (de 1 x 10 6 à 5 x 10 7 CFU par souris) (n = 5 par groupe), les barres d'erreur représentent les moyennes ± SD. Les souris sont euthanasiés à 24 h. Lung indice de blessure est évaluée par alvéolo-capillaire perméabilité de la barrière qui augmente proportionnellement à la charge bactérienne. Comparaison de l'indice de lésion pulmonaire obtenu en utilisant la vieille méthode avec homogénats pulmonaires surnageants (barres noires) et nouvelle méthode combinée utilisant surnageants de lavage broncho-alvéolaire (barre grises) (BF) souris sont intra-nasale infecté par 5 x10 6 UFC par souris. Les souris sont euthanasiés chaque 12 à 48 h pour aigus cinétique de modèle de lésion. Lésion pulmonaire (B), la charge bactérienne pulmonaire (C), la charge bactérienne de la rate (D), lavage broncho-alvéolaire (LBA) cellularité (E) et BAL numération cellulaire différentielle (F) sont également évaluées. (n = 5) par groupe, barres d'erreur représentent la moyenne ± SD. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. équipement chirurgical et instillation intranasale.
(A)   Matériel chirurgical nécessaire pour effectuer modèle de lésion aiguë et lavage broncho-alvéolaire. Voici canule trachéale (20G) et les deux seringues de 1 ml sont reliées à un verrouillage de type Luer-vanne à 3 voies. Une seringue pour injecter de l'eau dans les poumons, l'un pour tirer le liquide broncho-retour à partir des poumons. (B, C)   Position de la souris dans la main pour effectuer l'instillation intra-nasale. Sur cette photo, le pouce sous la mâchoire assure une bouche fermée pendant l'instillation. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Chirurgie et lavage broncho-alvéolaire.
La poitrine est largement ouvert (A), et la cage thoracique est ouverte latéralement pour éviter de blesser le cœur (B). Après la collecte de sang, la zone cervicale est disséqué pour exposer la trachée (C). Fil dentaire est utilisé commeet suture est passée derrière la trachée (C, D). La trachée est canulée avec ensuite la canule 20-G combiné (D) monté sur la seringue et de la vanne à 3 voies. La trachée doit être solidement fixé autour de la canule en faisant un nœud en utilisant la suture chirurgicale en place derrière la trachée. Enfin 500 pi de PBS sont doucement instillé dans les poumons, puis le BAL est doucement étirés. (E) poumons Fluid-inculqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Fardeau inculqué Minimal Maximal inculqué Burden
T3SS- 5 x 10 7 1 x 10 8
SST3 + 5 x 10 6 1 x 10 7
SST3 + ExoU + 5 x 10 1 x 10 5

Tableau 1. P. aeruginosa Inoculums Utilisé en infection pulmonaire aiguë modèles.
Concentrations intranasale optimales suggérées inoculum pour induire des lésions pulmonaires aiguës selon les souches.

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Discussion

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Modèles animaux, en particulier les mammifères, sont utiles pour élucider les mécanismes complexes d'interaction hôte-pathogène dans les domaines de l'immunité. Bien sûr, le besoin d'information obtenue uniquement à partir des modèles animaux doivent être essentielles; par ailleurs, l'utilisation d'animaux doit être remplacé par des modèles in vitro. Ce modèle animal illustre l'idée qui ne peut être fourni par un modèle animal puisque l'interaction entre les agents pathogènes est médiée par une réponse de l'hôte à plusieurs composants. Souris actuellement utilisés pour étudier cette interaction hôte-pathogène sont de jeunes adultes âgés de 6 à 10 semaines avec une réponse immunitaire mature et inaltérée. En se concentrant sur la réponse immunitaire innée, les souris de fond C57BL6 / J sont préférées. Pour éviter un effet du sexe et de cycle hormonal (en particulier les œstrogènes) sur la réponse immunitaire, les hommes sont donc le meilleur choix. Pour atteindre une signification statistique, les groupes doivent avoir au moins 5 individus à la fin de l'expérience, mais comme il est suggéré par les animaux expériles lignes directrices de mise en, le nombre d'animaux utilisés doivent être réduites et raffiné à un strict minimum.

Transport de l'éleveur fournir aux animaux de l'installation de recherche induit un stress chez la souris. La conséquence est une augmentation de la sécrétion de cytokines inflammatoires qui peuvent modifier des expériences ultérieures comme la nôtre. En outre, un nouvel environnement et de nouveaux "compagnons de cage" contribuent au stress. Par conséquent, les souris doivent être acclimatés pendant au moins sept jours avant d'étudier dans leur nouvel environnement du logement. Cet environnement de logement doit être contrôlée, fournir de la nourriture et de l'eau norme ad-lib, un cycle jour / nuit, et de l'humidité et de la température stable appropriée.

Tant la colonisation du poumon et des modèles d'infection pulmonaires nécessitent la pratique et de la dextérité. L'instillation peut être effectuée par voie intranasale ou intra-trachéale. Ce dernier est plus difficile et exige une plus grande expertise par la formation en raison d'un risque élevé d'arrêt cardiaque anoxique. En effet, la procedure oblige à intuber avec succès une souris en moins de 15 secondes et l'anesthésie profondes donc nécessaires. Notre choix de l'instillation intra-nasale est plus facile à réaliser depuis la voie d'administration est accessible, moins risquée nécessitant une anesthésie plus légère et donc plus reproductible.

Boutoille et al déjà décrit notre modèle de lésion pulmonaire aiguë, en particulier l'évaluation des lésions pulmonaires par la mesure de la perméabilité de la barrière alvéolo-capillaire utilisant de l'albumine marquée au FITC 16. Pour réduire le nombre de souris par expérience, cette méthode a été adaptée et couplé avec lavage broncho-alvéolaire (BAL). Dans les études de Boutoille et al, nous avons utilisé la comparaison entre la fluorescence de l'albumine marquée au FITC dans les surnageants d'homogénat de poumon et les surnageants de 17 sang.

Pour remplir pleinement cette comparaison, le taux d'hémoglobine et de l'hématocrite sont également nécessaires. Cette méthode a été adaptée Allow l'analyse d'élément de réponse de l'hôte en dédiant une poumon à une homogénéisation et à l'évaluation de la lésion pulmonaire et l'autre au lavage et à l'étude de la réponse de l'hôte. En effet, le fluide BAL peut être utilisée pour évaluer les niveaux de cytokines, la sécrétion de protéines et le recrutement de cellules. Notre adaptation fournit plus de résultats à partir d'une expérimentation animale unique, réduisant le coût et le nombre requis de souris, en particulier lors de l'utilisation des souris knock-out 17 tel que recommandé dans les lignes directrices de l'expérimentation animale. De plus, une partie du poumon est maintenue à -80 ° C pour effectuer l'extraction de l'ARN total et quantitative réaction en chaîne par polymérase ou l'analyse histologique. Comparaison entre la méthode précédente et la nouvelle méthode adaptée couplé avec BAL montre des résultats comparables (figure 3A) afin d'évaluer l'indice de lésion pulmonaire.

Dans l'étude de Mear et al, utilisant les mêmes procédures, un cytomètre en flux analyse a été effectuée sur des cellules BAL obtenus par centrifugation du BAL. Un similairesnalyses ont été effectués sur des cellules pulmonaires totales des poumons 12. Dans ce cas, l'évaluation de la lésion pulmonaire avec de l'albumine marquée au FITC ne peut être effectuée de façon concomitante, en raison d'artefacts induits par FITC (même canal que la protéine de fluorescence verte). Par conséquent, si la cytométrie en flux est nécessaire, les expériences doivent être planifiées en conséquence.

Le moment de l'euthanasie est critique. Une évolution dans le temps du modèle d'infection pulmonaire aiguë au cours des premières 72 heures est présenté Figure 3. Dans ce modèle, le summum de la lésion pulmonaire et la réponse de l'hôte se produit entre 24 et 36 heures (Figure 3). Ainsi, dans notre conception de la 24 hr point final a été choisi comme lecture pour 3 raisons: d'abord, il est facile à organiser dans le laboratoire, en second lieu, pour éviter la perte de la souris en raison de la mortalité entre 24 et 36 heures, et enfin, car la réponse de l'hôte était maximale à ce point de temps.

La première étape de notre étude d'interaction est la colonisation des voies respiratoires avec <em> C. albicans. Utilisation d'une instillation de 10 5 UFC par souris, un modèle de persistance de 4 jours est obtenue sans aucune lésion pulmonaire. En fait, les souris ont pris du poids au cours du temps de cette phase. Le gain de poids est un indicateur utile de l'absence de préjudice en ligne avec la colonisation, par opposition à l'infection. En effet, une augmentation de la charge initiale (plus de 10 6 UFC par souris) une lésion pulmonaire induite (figure 2C) et une foule-réponse délétère bien au-delà d'amorçage, dans laquelle des souris de cas ont perdu du poids (figure 2D). Au contraire, en utilisant une charge initiale plus faible (par exemple 10 4 UFC par souris) un modèle de persistance des voies aériennes ne pouvait pas être obtenue. Ainsi, pour obtenir l'amorçage observée de l'immunité de l'hôte décrit par Mear et al 12, étalonnage de la charge fongique inculqué est essentiel à la réussite et le suivi de la courbe de poids est un contrôle clé.

La même précision est nécessaire pour P. aeruginosa et P. aeruginosa est rapidement éliminé des voies aériennes par un hôte-réponse appropriée. En utilisant une première P. trop haute aeruginosa surpasse les capacités de défense de l'hôte ou même induit une réponse inappropriée et derleterious résultant en charge conduit à une lésion aiguë massive et la mort d'effacer toutes les différences entre les groupes. L'inoculum optimal pour induire une lésion aiguë dépend de la présence d'un système fonctionnel de type 3 sécrétion (SST3) et la production d'exotoxine de U, une translocation de la toxine SST3 dans le cytoplasme de la cellule hôte. Ces deux attributs spécifiques à la souche doivent être considérés dans le choix de la charge bactérienne initiale. Charges bactériennes initiales sont proposées dans cet article comme des exemples de limites inférieures et supérieures pour induire une lésion pulmonaire aiguë avec SST3-négatif ou positif souche et les souches productrices exotoxine U ou non (tableau 1). En étudiantimplication des SST3, la souche doit être cultivées O / N et relancé par un nouveau milieu LB 3 heures avant la préparation de l'inoculum pour obtenir une activité optimale de SST3.

La détermination de la charge bactérienne et fongique 24 heures après P. l'infection pulmonaire de aeruginosa exige considérations spécifiques abordés dans cette section. En effet, comme le montre, lorsque les souris sont infectées par 5 x 10 6 CFU souche SST3 positif, la charge bactérienne dans les poumons à 24 h volonté diminué à environ 1 log (figure 3C). Dilutions en série des échantillons doivent être effectués jusqu'à 5 log dilution et étalées sur des plaques d'agar-BCP. Concernant C. albicans dans les poumons, à 72 h, la charge fongique est diminué à environ 2 log et les échantillons doivent être étalées sur YPD-agar supplémenté avec l'amikacine pour faciliter l'identification de la colonie. Enfin, la détermination de la dissémination bactérienne peut être évaluée par étalement de 100 ul de l'échantillon de sang sur la PCA-agar ou en étalant 100 ul de rate homogenates sur le même milieu. Les deux méthodes ont été déjà été comparées et la culture de la rate semble être plus précis. En effet, la rate est un organe qui "filtres" sang total et peut "se concentrer" et de conserver les bactéries ayant diffusés sur le sang. Ainsi, homogénats de rate reflètent la diffusion bactérienne systémique lors d'une infection pulmonaire aiguë avec une sensibilité plus élevée que dans le sang. Des échantillons de sang représentent la dissémination bactérienne à un moment donné très spécifiques et peuvent ne pas refléter vraiment le phénomène de diffusion bactérienne dans son ensemble. Par conséquent, les cultures d'homogénat de rate sont préférées.

Lung indice de blessure est une évaluation sensible de lésion pulmonaire résultant d'une infection et / ou de la réponse de l'hôte inapproprié et l'effet des agents thérapeutiques potentiels sur ces composants. En outre, cela dans viv o modèle permet la collecte de plusieurs échantillons différents pour étudier la réponse de l'hôte. Poumon peut être utilisé pour l'extraction et l'analyse d'ARNde la transcription génique. Échantillons pulmonaires peuvent également être placés dans paraformaldéhyde (PFA) à d'autres observations histologiques. BAL fluide peut être utilisé pour l'évaluation de la sécrétion de protéines tels que des cytokines inflammatoires. Enfin, comme indiqué ci-dessus le protocole peut être adapté pour fournir des échantillons pour analyse par cytométrie en flux.

Enfin, ce protocole peut être adapté pour modéliser C. microbes albicans- interaction impliqué dans la pneumonie associée à la ventilation telles que Staphylococcus aureus 18 ou entérobactéries. Une autre adaptation peut être colonisation des voies respiratoires en utilisant des bactéries au lieu de C. albicans de modéliser l'interaction bactérienne dans la maladie pulmonaire chronique suppurée comme bronchectasie. À cette fin, des souris immunodéprimées doivent être utilisés, car la clairance bactérienne chez les souris compétente immunitaire ne permet pas une colonisation des voies respiratoires persistante.

Pour l'instillation, la position de la main tenant l'animal est critique. Comme déjà souligné dans la section précédente, quand inculquer intra-nasale de la souris, l'exploitant doit veiller à ce que la bouche est parfaitement fermé pour éviter l'expectoration de la solution. Le pouce soutient la mâchoire et maintient la bouche fermée pendant la procédure d'instillation ensemble (figure 4B). Puis, avec l'autre main, la pipette est déposée sur une narine (Figure 4C) et une solution progressivement et doucement instillé sans air afin d'éviter la formation de bulles. De toute évidence, l'instillation doit être effectuée dans un niveau coffret 2-biosécurité.

Collection d'échantillons exige Certifed petits animaux formation en chirurgie de l'opérateur. A chaque étape, les échantillons doivent être placés sur de la glace pour éviter la lyse des cellules et la dénaturation de protéines préserver. Instruments chirurgicaux de base sont nécessaires (Figure 4A). Ils doivent être stérilisés par autoclavage avant utilisation. Il est recommandé que différents ensembles d'instruments chirurgicaux pour abdomina être utilisésl et chirurgicales thoraciques étapes, en évitant la contamination croisée des échantillons de poumon. Les différentes étapes critiques de la dissection chirurgicale sont présentés (figure 5A-5E). Position de la souris est critique; l'animal doit être immobilisé à plat sur son dos la tête à l'opposé de l'opérateur et de droite. Éthanol devrait être généreusement utilisé pour préparation avant la première incision pour éviter la propagation de cheveux dans les échantillons et la contamination bactérienne potentiel de la peau. La peau est bien vascularisé et doit être retiré avec soin pour éviter des saignements (figure 5A).

Puis la cage thoracique est incliné suivant une incision latérale de la poitrine au cours de laquelle la cage thoracique doit être maintenue en permanence sous l'emprise des pinces pour éviter de blesser le cœur et les poumons lors de l'incision. Pulmonaires et cardiaques sont exposés (figure 5B). Poumon non infecté semble blanchâtre (figure 5B). Dissection de la zone cervicale expose la trachée et une suture est la voitureefully placé derrière la trachée supérieure (Figure 5C). Cannulating la trachée doit être effectuée avec prudence. Ne pas utiliser une canule surdimensionné (taille maximale est de 20 G). Une petite incision antérieure de la trachée membraneuse entre deux anneaux cartilagineux permet l'insertion de la canule. Lorsque la canule est observé par transparence à travers la trachée au-dessus de la carène (figure 5D), la suture est étroitement liée autour de la trachée sa fixation autour de la canule (figure 5E). La canule est reliée à une soupape mâle Luer-lock à 3 voies avec 2 seringues connectés aux ports de sexe féminin. Une seringue contient du PBS glacé pour lavage broncho-alvéolaire; l'autre est vide reculer le fluide BAL. Ces seringues doivent être chaged entre les groupes.

En conclusion, l'amorçage avant aiguë modèle de lésion pulmonaire est un modèle pertinent et puissant pour explorer les interactions hôte-médiée in vivo entre les pathogènes. L'utilisation d'animaux est lelimitation principale et doit être soigneusement pesé contre l'information obtenue in vitro.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevorane, Sevoflurane Abott 05458-02 250 ml plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940 Berthold Technologies reference in first column no comment
Bromo-cresol purple agar Biomerieux 43021 20x per unit
Pentobarbital sodique 5.47% CEVA 6742145 100 ml plastic bottle
2-headed valve  Distrimed 92831 no comment
Sterile inoculation loop 10 µl Dutscher 10175 x1,000 conditioning
Insuline syringes 1 ml Dutscher 30003 per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 ml Dutscher 64300 no comment
Ultrospec 10  General Electric life sciences 80-2116-30 no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm  Gosselin W1773X per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline Life technologies 10010023 packaged in 500 ml
amikacin 1 g Mylan 62516778 per 10 
Heparin 10,000 UI in 2 ml Pan pharma 9128701 10x per unit
RAL 555 coloration kit RAL Diagnostics 361550 3 flacons of 100 mL
1.5 ml microcentrifuge tube Sarstedt 55.526.006 x 1000
Transparent 300 µl 96-well plate Sarstedt 82 1581500 no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth Sigma 95763 in powder
FITC-albumin Sigma A9771 in powder
Luria Bertani Broth Sigma L3022 in powder
25-gauge needle Terumo or unisharp A231 x 100 conditioning
Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 no comment

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Etudier communautés microbiennes<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle d&#39;interaction hôte intermédiaire Entre<em&gt; Candida albicans</em&gt; Et<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans les Airways
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Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).More

Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).

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