Abstract
Studieren Wirt-Pathogen-Interaktion ermöglicht es uns, die zugrunde liegenden Mechanismen der Pathogenität bei mikrobiellen Infektion zu verstehen. Die Prognose der Host davon abhängt, dass einer angepassten Immunantwort gegen das Pathogen 1. Immunantwort ist komplex und Ergebnisse aus der Interaktion der Erreger und verschiedene Immun- oder Nicht-Immunzelltypen 2. In-vitro-Studien kann nicht zeichnen diese Interaktionen und konzentrieren sich auf die Zell-Pathogen-Interaktionen. Darüber hinaus ist in dem Atemweg 3, besonders bei Patienten mit eitrigen chronischen Lungenerkrankungen oder bei beatmeten Patienten, vorliegen polymicrobial Gemeinden und komplizieren Wirt-Pathogen-Interaktion. Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans sind beide Probleme Pathogene 4, häufig tracheobronchial Proben isoliert, und bis schweren Infektionen, insbesondere in der Intensivstation 5. Mikrobielle Interaktionenzwischen diesen Erregern in vitro berichtet worden, aber die klinische Bedeutung dieser Wechselwirkungen bleibt unklar 6. Die Wechselwirkungen zwischen C. Albicans und P. studieren aeruginosa, ein Mausmodell der C albicans airways Kolonisierung, gefolgt von einem P. aeruginosa- vermittelten akuten Lungeninfektion durchgeführt wurde.
Introduction
Tiermodelle, vor allem Mäuse, wurden ausgiebig verwendet, um Immunantworten gegen Pathogene zu erkunden. Obwohl angeborenen und erworbenen Immunität unterscheiden zwischen Nagern und Menschen 7, die Leichtigkeit in der Züchtung und der Entwicklung von Knockouts für zahlreiche Gene, stellen Mäusen ein hervorragendes Modell, um Immunantworten 8 studieren. Die Immunreaktion ist komplex und resultiert aus der Wechselwirkung eines Erregers, die ansässigen mikrobiellen Flora und mehrere Immun (Lymphozyten, Neutrophilen, Makrophagen) und nicht-immune (Epithelzellen, Endothelzellen) Zelltypen. 2 In vitro-Untersuchungen erlauben nicht beobachtet Diese komplexen Interaktionen und vor allem auf einmalige zell Pathogen-Interaktionen. Während Tiermodelle müssen mit Vorsicht verwendet und auf sehr spezifische und relevante Fragen beschränken, bieten Mausmodellen einen guten Einblick in den Säuger-Immunantwort in vivo und können Teile der wichtigen klinischen Fragen 7 anzugehen.
6. Während, was eine "normale" Atemwegs microbiome noch bestimmt werden, ansässig sind Gemeinden häufig polymikrobiellen, und stammen aus verschiedenen ökologischen Quellen. Patienten mit eitriger chronischer Lungenerkrankung (zystische Fibrose, bronchectasis) oder beatmeten Patienten weisen eine besondere Flora aufgrund der Besiedelung der Atemwege durch umwelt erworbene Mikroorganismen 9. Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans sind beide Problemerreger 5, häufig tracheobronchial Proben zusammen isoliert und verantwortlich für schwere opportunistische Infektion bei diesen Patienten, insbesondere in der Intensivstation (ICU) 4.
Isolation dieser Mikroorganismen während einer akuten Lungenentzündung auf der Intensivstation führt antimikrobielle Behandlung gegen P. aeruginosa but Hefe werden normalerweise nicht an dieser Stelle 5 als pathogen angesehen. In vitro Wechselwirkungen zwischen P. aeruginosa und C. albicans wurden weithin berichtet und gezeigt, dass diese Mikroorganismen das Wachstum und das Überleben von einander beeinflussen, aber Studien konnte nicht schließen, wenn die Anwesenheit von C. albicans ist schädlich oder nützlich für den Host 10. Mausmodelle wurden entwickelt, um dieses Relevanz von P. Adresse aeruginosa und C. albicans in vivo, aber die Wechselwirkung zwischen Mikroorganismen war nicht der entscheidende Punkt. In der Tat wurde das Modell etabliert, um die Beteiligung von C. bewerten albicans in Wirtsimmunantwort und Ergebnis.
Eine Vorgängermodell von Roux et al fest bereits eine erste Besiedlung mit C eingesetzt albicans, gefolgt von einer akuten Lungeninfektion durch P. induzierte aeruginosa. Mit ihrem Modell, fanden die Autoren eine schädliche Rolle von prior C. albicans Kolonisation 11. Allerdings verwendet Roux et al eine hohe Belastung von C. albicans in ihrem Modell mit 2 × 10 6 CFU / Maus während 3 aufeinanderfolgenden Tagen. Wir haben eine 4-Tage-Modell der C albicans Atemwege Kolonisierung oder zumindest Persistenz ohne Lungenverletzung, in diesem Modell C. albicans wurde bis zu 4 Tage nach einer einzelnen Instillation von 10 5 CFU pro Maus (2B) 12,13 abgerufen. Nach 4 Tagen wurden keine Beweise von entzündlichen Zellrekrutierung, entzündliche Zytokin-Produktion noch Epithelschädigung beobachtet. Bei 24 - 48 h, auf dem Höhepunkt Vorhandensein von C. albicans, obwohl eine zelluläre und Zytokin angeborenen Immunantwort beobachtet wurde, gab es keine Anzeichen einer Lungenverletzung. Überraschenderweise Mäusen so mit C. kolonisiert albicans 48 h vor dem Einträufeln der P. intranasale aeruginosa-Infektion hatte abgeschwächt im Vergleich zu Mäusen, die mit P. aeruginosa-Infektion allein. ichndeed zeigten Mäuse geringere Lungenschädigung und verminderte Bakterienlast 12,13.
Mehrere Hypothesen könnte diese positive Wirkung von vor Besiedlung mit C. erklären albicans auf P. aeruginosa vermittelten akuten Lungeninfektion. Zunächst wird eine Interspezies-Übersprechen mit jeweils Mikroorganismen Quorum-Sensing-Systeme, die homoserinelactone basierte P. aeruginosa-System und das Farnesol basierten C. albicans System wurden ausgewertet. Zweitens C. albicans als "Lockvogel" Ziel für P. aeruginosa Umleitung des Erregers aus Lungenepithelzellen handeln untersucht. Beide Hypothesen (unveröffentlichte Daten) für ungültig erklärt. Die dritte Hypothese war, dass der "Priming" des angeborenen Immunsystems durch C. albicans für eine verbesserte Folge angeborenen Antwort gegen P. verantwortlich aeruginosa. Diese letzte Hypothese wurde bestätigt. Tatsächlich C. albicans Kolonisierung führte zu einem Priming der angeborenen Immunität through IL-22, vor allem von angeborenen lymphoiden Zellen sezerniert wird, was zu einer erhöhten bakteriellen Clearance und einer verminderten Lungenverletzung 12.
Zusammenfassend ist der Host ein zentraler Akteur in der Interaktion zwischen Mikroorganismen Modulation der angeborenen Immunantwort und die verschiedene Entzündungszelltypen. Während diese komplexe Immun Wechselwirkungen können in vitro präpariert werden die anfänglichen Hypothesen kann nur durch geeignete In-vivo-Modellen zur Verfügung gestellt werden. Das folgende Protokoll zeigt ein Beispiel der in vivo-Untersuchung von Wirt-Pathogen-vermittelte Wechselwirkung, um andere Mikroorganismen angepasst werden kann.
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Protocol
Die regionale Ethik-Regionalkomitee für Tierversuche hat diese Methode zugelassen, in Übereinstimmung mit nationalen und internationalen Tierpflege und die Verwendung in experimentellen Forschungs Richtlinien.
1. Probenentnahme
- Probenlagerung
- Sammeln Sie alle Proben und sofort speichern bei - 20 ° C oder auf Eis, bis Tiefkühllagerung, um eine Verschlechterung zu vermeiden. Platzieren steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf Eis zu bronchoalveoläre Lavage (BAL) Leistung zu verbessern.
- Chirurgie
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Geräten unter Verwendung eines Autoklaven.
HINWEIS: Wenn möglich, empfiehlt es sich, zwei verschiedene Sätze von Instrumenten für die Bauch- und Brust Schritte verwenden, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Erforderlich Dissektion Ausrüstung ist in 4A detailliert
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Geräten unter Verwendung eines Autoklaven.
2. Mäuse, Bakterien- und Hefestämmen
- Hausmäuse unter Beachtung der örtlichen Verwendung von Tieren in reFindungsausschuss Richtlinien in einem belüfteten Rack, ohne mehr als 5 Mäuse pro Käfig mit Futter und Wasser ad lib, in einer biologischen Sicherheitsstufe 2 Gehäuse Anlage durch den Einsatz von Biosicherheitsstufe 2 Mikroorganismen: P. aeruginosa und C. albicans.
- Halten die Bakterienstämme bei -80 ° C in 40% Glycerin-Medium.
- In Bakterien direkt aus der Tiefkühllagerung in Kulturröhrchen mit 3 ml sterilem Luria-Bertani-Brühe unter Verwendung einer 10 & mgr; Impföse. Lassen Sie O / N bei 37 ° C mit kreisförmigem Schütteln (400 rpm) am Tag vor dem Einträufeln.
- Ernte Bakterien durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min.
- Den Überstand aspirieren in einen geeigneten geschlossenen biohazard Abfallentsorgung. Beobachten weißen haft Pellet am Boden des Kulturröhrchen.
- Waschen und das Pellet mit 5 ml PBS suspendieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2, ein zweites Mal, um einen zweiten Waschführen 2.2.3.
- Resuspendieren der pelletierten Bakterien unter Verwendung von 1 ml PBSund kurzem Vortexen.
- Bestimmen Sie die Inokulumdichte mit optischen Densitometer bei 600 nm unter Verwendung eines optischen Dichtemessgerät. Eine Dichte von 0,9 entspricht 10 9 CFU / ml für PAO1, verdünnter entsprechend.
Hinweis: Dieses Ergebnis ist für jede verwendete Stamm durch Bestimmen der Dichte von aufeinanderfolgenden Verdünnungen einer kalibrierten Impfkultur erhalten werden. - Stellen Sie sicher, das Inokulum durch serielle logarithmische Verdünnungen und Platte 100 ul jeder Verdünnung auf Bromkresolpurpur Agar (BCP) Platten und O / N-Kultur. Verwalten jeder Maus intranasal 50 ul der Lösung, die 1 x 8-02 Oktober x10 8 CFU pro ml (5 × 10 6, um 1 × 10 7 KBE pro Maus).
- Verwenden C. albicans SC5314 als Referenzstamm. Erhaltung der Spannung in 40% Glycerin-Medium bei -80 ° C.
- Ergänzen Hefe-Pepton-Dextrose-Brühe mit 0,015% Amikacin, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden und erleichtern die weitere Zählung.
- In Hefe unter Verwendung von 10 &# 181; l Impföse in vorbereitete YPD-Brühe mit Amikacin O / N ergänzt bei 37 ° C.
- Ernte Hefe durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min.
- Überstand entfernen, in einen geeigneten bioharzard Abfallentsorgung. Weiße haft Pellet sollte im Boden des Kulturröhrchen zu beobachten.
- Waschen und suspendieren die pelletierten Bakterien unter Verwendung von 5 ml PBS und kurzem Vortexen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2, ein zweites Mal, um einen zweiten Waschführen 2.2.3.
- Das Pellet mit 1 ml PBS und kurzem Vortexen.
- Bestimmen Sie die Größe des Inokulums durch Zählen auf einem Mallassez Zählkammer mit einem Standard-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung.
HINWEIS: (Anzahl der Hefe x 10 & sup5;) / (Anzahl der gezählten Gitterrechtecke auf der Mallassez Zählkammer): Konzentration (in KBE / ml) wird mit der folgenden Formel erhalten. - Stellen Sie sicher, durch serielle logarithmische Verdünnung auf 10 -5 und 10 -6 zu bestätigen, dass Lösung enthält 2 x 10 6 CFU / ml.
- Platte auf YPD-Agarplatten mit 0,015% Amikacin ergänzt.
3. Airways Colonization von C. albicans
HINWEIS: Nach der Umweltanpassung werden die Mäuse zweimal täglich gewogen.
- Unter einer Abzugshaube, Kaution 500 ul Sevofluran auf einen 4 cm x 4 cm Gaze (open-Drop-Technik) 14.
- Sofort platzieren die Gaze auf dem Boden eines etwa 750 ml Induktionskammer. Unmittelbar danach ist ein maschen erhöhten Plattform oberhalb der Gaze, um direkten Kontakt zwischen dem Tier und der Gaze zu vermeiden.
- Schließen luftdicht verschlossen, und warten Sie 1 bis 2 min, um die Diffusion von Sevofluran in der Kammer zu ermöglichen.
- Übertragen Sie die Maus von Käfig zu Plattform und Deckel schließen Netz. Licht Anästhesie mit konservierten Spontanatmung ist in 30 bis 45 Sekunden erreicht werden.
- Monitor für Hypotonie durch Beobachtung Verlust des Stellreflexes, an welchem Punkt die Maus f entfernt werdenROM Die Box und eingeflößt.
- Intranasale Instillation (Kann in 10 Sekunden von einem geschulten Bediener durchgeführt werden).
- Halten Sie die Maus einer Hand auf dem Rücken aufrecht gehalten (4B) gelegen.
- Verwendung Zeigefinger, unterstützen den Kopf und verwenden Sie den Daumen, um den Kiefer geschlossen zu halten, um Auswurf (4C) zu vermeiden.
- Wie es in Schritt 2.3.8 beschrieben ist, sicherzustellen, dass die hergestellte C. albicans Lösung enthält 2 x10 6 KBE pro ml für eine 50 & mgr; eingeflößt Volumen.
HINWEIS: Der zweite kritische Punkt ist die eingeträufelten Volumen. Ein Volumen von weniger als 50 & mgr; l könnte zu einer unzureichenden Besiedelung oder inhomogene Einträufeln von Atemwegs Ergebnis kann ein größeres Volumen Ertrinken / Ersticken und Tod verursachen. - Vermitteln die Maus intranasal durch Annäherung an die Pipette, um die Nasenlöcher.
- Pipettieren von 50 ul Tropfen bildet eine Blase, die die Lösung auf die Nasenlöcher, anschließend vom spontaneousl inhalierty Atmung Maus.
- Bewegen Sie die Maus in einem Recovery-Bereich (zB eine große, gut belüftet nackten Käfig mit einem Overhead-Wärmelampe). Mäuse müssen bis zum vollständigen Aufwachen überwacht werden. Haben ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend Bewusstsein Brustlage und Aufrichtungsreflexes aufrechtzuerhalten wiedererlangt. An dieser Stelle können Sie die Maus auf eine normale Gehäusekäfig zurückgebracht werden.
4. P. aeruginosa induzierten akuten Lungenentzündung
HINWEIS: Die Mäuse werden während der vier folgenden Tagen gewogen. Normalerweise Mäuse an Gewicht während C. albicans -vermittelte Atemwege Kolonisierung (2A).
- Bereiten Sie die Suspension, die P. aeruginosa der Tag der Instillation nach O / N-Wachstum (Abschnitt 2.2).
- Kurzzeitig betäuben Verwendung inhaliert Sevofluran, wie oben (Abschnitt 3.1) beschrieben.
WICHTIG: Um akute Lungenentzündung durchzuführen, empfiehlt bakterielle Belastung in vorgeschlagenTabelle 1. - Vermitteln die Maus wie oben (Abschnitt 3.2) mit besonderem Augenmerk auf post-Instillation Recovery beschrieben.
5. Messen der Lungenschädigung Index
- Bereiten Sie eine Lösung, die FITC-markierten Albumin. Spritzen Sie diese Lösung 2 h vor der Einschläferung.
- Man wiegt 0,2 mg Albumin-FITC mit der entsprechenden Ausrüstung.
- In 0,2 mg in 1 ml PBS. Vortexen. Wenn es nicht sofort verwendet wird, legen Sie die Lösung in der Folie, um die Exposition gegenüber Umgebungslicht zu vermeiden.
- Injizieren intraperitoneal 200 ul FITC-markiertem Albumin-Lösung in jede Maus.
- Euthanasie
- Wiegen der Mäuse für die letzte Gewichtsdaten.
- Euthanize eine einzige Maus in Übereinstimmung mit den örtlichen Einsatz von Tieren in der Forschung Ausschuss Leitlinien mit einer intraperitonealen Injektion einer tödlichen Überdosis Pentobarbital: 300 ul 5,47% Pentobarbital.
- Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und nimmt lEthal Injektion durch Bediener.
- Nach der Injektion, übertragen Sie die Maus alleine an einen anderen Käfig, von anderen Tieren versteckt. Beachten Sie die Maus, bis Abwesenheit von Bewegung. Tod zu bestätigen ist durch Abwesenheit von Bewegung, vor allem Atembewegung, mangelnde Impuls.
- Chirurgische Entnahme von Proben auf tote Tiere, also ohne Betäubung oder Schmerzmittel.
- Chirurgische Probensammlung: Thoracic Bühne.
WICHTIG: Um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden alle Operationen durchgeführt unter Verwendung von sterilen Geräten in einem biologischen Sicherheitsstufe 2 Umwelt.- Gelten Ethanol zu der Haut. Führen Sie eine Mittellinie Hautschnitt vom Brustbein bis Mitte Leib mit einer Schere. Von der Mittellinie incise entlang der Brustkorb auf beiden Seiten. Klappen Sie die Haut auf beiden Seiten des Brustkorbes, den Brustkorb zu visualisieren.
- Führen Sie eine vertikale Inzision des Brustkorbs auf beiden Seiten hinauf in Richtung der Schlüsselbeine, um in der Lage, den gesamten vorderen Brustwand mit dem Heck zurücklehnen seinum so die perfekte Visualisierung von Herz und Lunge (Abbildung 5A, 5B).
- Blutentnahme mit einem Pre-heparined Spritze durch Punktieren das Herz neben dem interventrikulären Arterie. Zurückzuziehen mindestens 500 & mgr; l auf mindestens 100 & mgr; l Plasma zu erhalten. Legen Sie die Blutprobe auf Eis.
- Führen Sie eine Mittellinie Hals-Schnitt, um die Luftröhre (5B und 5C) zu visualisieren. Sorgfältig sezieren die Faszie rund um die Luftröhre. Legen Sie eine Naht hinter der Luftröhre (Abbildung 5C und 5D). Anschließend wird das Nahtmaterial wird rund um die Kanülierung Nadel geschlossen werden, um die ordnungsgemäße Spülung zu gewährleisten.
- Katheterisieren die Luftröhre mit Hilfe der 20-G modifizierten Sondennadel (5D und 4A). Binden Sie einen chirurgischen Knoten um den kanülierten Luftröhre mit dem zuvor platzierten Naht.
- Um BAL (BAL) durchzuführen, sanft und progressiv zu injizieren und zeichnen 500 ul eiskaltem PBS in die / aus der Lunge. Legen Sie die Probe auf ice, zelluläre Lyse zu vermeiden.
- Wiederholen Sie Schritt 5.3.6, 3-mal, um insgesamt 1500 ul BAL-Flüssigkeit und Pool Spülungsproben in ein 2 ml-Zentrifugenröhrchen (5E) zu erhalten.
- Entfernen Sie die Lunge aus der Brust. Legen Sie ein Lungensegment in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen (Größe sollte auf die Hälfte der eine Lunge oder eine Keule entsprechen) und schnell speichern bei - 80 ° C.
- Legen Sie ein Lungensegment in ein vorher gewogenes Hämolyse Röhrchen mit PBS, um bakterielle Belastung zu bestimmen, und legen Sie es auf Eis.
- Chirurgische Probensammlung: Bauch Bühne.
- Erneute Einschnitt auf der linken Seite des Bauches. Beachten Sie die Milz durch das Peritoneum.
- Entfernen Sie die Milz und in einen zweiten Hämolyse Röhrchen mit 1 ml PBS und auf Eis.
- Lungenschädigung Index
HINWEIS: Alveolar-Kapillar-Membrandurchlässigkeit wird durch Messung beurteilt FITC-markierten Albuminverlust aus dem Gefäßraum in den Alveolar-interstentbindet Fach.- Centrifuge Blutprobe und BAL-Flüssigkeit für 10 Minuten bei 1500 x g. Sammeln Sie die Überstände in neue Zentrifugenröhrchen. Die Pellets entsprechen rekrutiert Plasma oder BAL-Zellen und sollte auf Eis gelegt werden.
- Zugabe von 100 ul von jeder Blutüberstand (Plasma, gelb) oder BAL Stand bis zu einer 96-Well-transparente Platte (300 ul wells). Legen Sie eine Folie auf der Platte, wenn es nicht sofort verwendet.
- Messen Fluoreszenzwerte im Plasma und BAL Überständen unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät (Anregung 487 nm; Emission, 520 nm).
- Bestimmen Sie die Lungenschädigung Index durch die Berechnung der Fluoreszenzverhältnis [(BAL Stand / Blutüberstand) x 100].
- Bronchiallavage (BAL) Differentialzellzählung.
HINWEIS: Verwenden Sie das Zellpellet aus der Zentrifugation der BAL-Flüssigkeit erhalten in Schritt 5.5.1.- Verwenden Sie bei Bedarf roten Zelllysepuffer. Gib 500 ul Erythrozyten Lysepuffer in das Zentrifugenröhrchen, das die cell Pellets. Vortexen und lassen Sie 10 Minuten auf Eis. Fügen Sie 500 ul PBS bis rot-Zell-Lyse zu stoppen.
- Ernten der Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 1.500 x g. Überstand entfernen und die Aussetzung der Zellpellet in 1 ml sterilem PBS. Aufzuzählen Zellen auf einem Mallassez Zählkammer. Mit einem Hämacytometer um Zellen zu zählen. Konzentrat-Zellen auf einem Objektträger mit einer Cytospin.
- Stain-Zellen unter Verwendung Färbung Kit ermöglicht Zellidentifikation und count (Makrophagen, Lymphozyten, Neutrophile).
- Lung bakterielle Belastung und bakteriellen Verbreitung
ANMERKUNG: Um Lungen bakterielle Belastung und Verbreitung von Bakterien, Lunge und Milz zu beurteilen, wurden jeweils aufgefangen und in vorgewogene Hämolyseröhrchen mit 1 ml PBS (Schritt 5.3.9) gespeichert.- Wiegen Hämolyse Röhrchen mit 1 ml PBS und entweder Lunge oder Milz. Homogenisierung der Proben mit einem Gewebe-Homogenisator, um Lungenhomogenaten und Milz Homogenaten zu erhalten.
- Zahlen Sie 100 ul Gewebe homogenates in Zentrifugenröhrchen mit 900 ul sterilem PBS bis zur Serien logarithmische Verdünnungen erhalten.
- Platte die beiden letzten geeigneten verdünnten Proben (10 -3 und 10 -2) entweder auf BCP-Agar für P. aeruginosa oder YPD-Amikacin-Agar ergänzt für C. albicans Lunge und Milz Belastung Bestimmung.
- Die Platten O / N bei 37 ° C. Am folgenden Tag, aufzuzählen, die Kolonien auf Platten.
- Index das Ergebnis zu Lungengewicht, um eine CFU pro Gramm Lungen erhalten. Lungenprobe Größen nicht gleich sind, die Ergebnisse sind in CFU pro Gramm Lungen ausgedrückt werden.
Formel für den Index: [CFU] x [Gewicht der Hämolyse Röhre und der Lunge] - [Gewicht der Hämolyse Rohr].
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Representative Results
Wie während der Protokollbeschreibung zuvor gesehen, muss das Experiment 5 Tage auf (Abbildung 1: Experiment Timeline) zu vervollständigen. Ein Bediener während der gesamten Lauf des Experiments angeforderter und die Prozesse bis zu einem Maximum von 10 Mäusen Griff nach oben. Wenn mehrere Tiere erforderlich ist, werden zwei Personen besonders für chirurgische Probennahme erforderlich ist. In der Tat alle Proben müssen in weniger als 2 Stunden gesammelt werden, um eine erhöhte passive alveolären Kapillaren Auslaufen von FITC-markiertem Albumin in den letzten Mäusen zu vermeiden.
Der erste Schritt ist die Herstellung von C albicans Inokulum und intranasale Instillation um die Atemwege Kolonisierung durch C zu erhalten albicans. A 4 Tage-Persistenz-Modell wird durch intranasale Instillation von 5 x 10 5 KBE C erhalten albicans pro Maus (2B). Während dieser 4 Tage, Mäuse an Gewicht (2A) und Applikation von 5x10 5 CFU nicht l veranung Verletzungen (Abbildung 2C). Obwohl C. albicans kann andauern bis zu 4 Tage in diesem Modell, nach 48 h verringert Belastung. Daher P. aeruginosa induzierten akuten Lungeninfektion in 48 h C. perfomed albicans Beharrlichkeit.
P. aeruginosa Stamm PAO1 ist ein weitgehend gekennzeichnet Laborstamm, das die wichtigsten Virulenzfaktoren, die Art Drei-Sekretionssystem (T3SS), wie es in 75% der klinischen Isolate Lungen 15. Für Thesen Gründen ist PAO1 eine relevante Belastung in Tiermodellen des akuten Lungeninfektion. Lungenschädigung durch alveolo-kapillare Durchlässigkeit durch Protein Leck aus dem Gefäßraum in die Atemwege wie Lungenschäden Index ausgedrückt gemessen beurteilt. Lungenschädigung steigt mit dem Inokulum (3A). Kinetik der akute Lungenschädigung Bestandteil unseres Modells durch PAO1 Stamm (5x10 6 CFU / Maus) (3B-3F) induzierte Hier berichten wir allein ohne vorherigeC. albicans- vermittelte Priming. Je nach Belastung und Zeitverlauf des Modells, der Wahl der Anfangs P. aeruginosa Inokulum wird im nächsten Abschnitt diskutiert und ist in Tabelle 1 vorgeschlagen.
Fünf Mäuse pro Gruppe wurden verwendet. Lungenschädigung Index (3B), Bakterienlast in der Lunge (3C), bakterielle Belastung in der Milz, was Bakterienverbreitung (3D), BAL Zellularität (3E) und Differentialzellzählung (3F) wurden alle 12 bestimmt hr. Lungenschädigung war maximal zwischen 24 h und 36 h nach der Infektion (3B). Bakterielle Belastung zeigte eine 1-log CFU / ml alle 24 Stunden (3C) zu verringern. Kumulative Bakterienverbreitung von Milz Homogenat Kulturen beurteilt erhöht jeden Tag (3D). Schließlich, während BAL Zellularität in nicht infizierten Mäusen ist hauptsächlich zusammengesetzt (90%) of Alveolarmakrophagen, in BAL von infizierten Mäusen wurden Neutrophile breit rekrutiert und Differentialzellzählung ergab 90% Neutrophilen und 10% Makrophagen und Lymphozyten (Abbildung 3e, 3f).
Abbildung 1. Zeitleiste des Acute Lung Injury Modell zu erkunden Host-vermittelte Wechselwirkung zwischen C. albicans und P. aeruginosa.
Grafische Darstellung des gesamten Verfahrens. Der erste Schritt ist Umweltanpassung von Mäusen das Gehäuse Möglichkeiten. Der zweite Schritt ist C albicans vermittelte Atemwege Kolonisierung. Schließlich ist der dritte Schritt der akuten Lungeninfektion durch P. vermittelte aeruginosa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. C. albicans Atemwegs Colonization.
(A, B) Mäuse intranasal mit 10 5 CFU C eingeträufelt albicans (Stamm SC5314). Mäuse an Gewicht während C. albicans -vermittelte Atemwege Kolonisierung (A). Besiedlung der Atemwege kann zu 3-4 Tage mit nur einem Anfangs Instillation verlängert werden. In einer früheren Studie, Grundieren der angeborenen Immunität zwischen 24 und 48 Stunden stattfindet. (n = 5 pro Gruppe), Fehlerbalken stellen Mittelwerte ± SD. (C, D) die Mäuse intranasal instilliert 5 x 10 5 bis 5 x 10 6 KBE von C. albicans. Lungenschädigung Index (C) durch alveolare Kapillarsperre Permeabilität bei 24 Stunden beurteilt. Gewichtszunahme (D), ausgedrückt als Prozent des Anfangsgewicht (n = 5 pro Gruppe).Fehlerbalken stellen Mittelwerte ± SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Modell des akuten Lungenversagens durch P. aeruginosa induziert.
(A) C57BL / 6J Mäuse intranasal mit zunehmender Belastungen von P. infiziert aeruginosa (von 1 × 10 6 bis 5 × 10 7 KBE pro Maus) (n = 5 pro Gruppe), Fehlerbalken stellen Mittelwerte ± SD. Mäuse werden nach 24 Stunden getötet. Lungenschädigung Index wird durch alveolare-Kapillar-Schranken-Permeabilität, die proportional mit der bakteriellen Belastung erhöht beurteilt. Vergleich der Lungenschädigung Index mit alten Methode mit Lungenhomogenaten Überstände (schwarze Balken) und neue kombinierte Verfahren unter Verwendung von Bronchiallavage-Überstände (grauer Balken erhaltene) (BF) Mäuse intranasal mit 5 x10 6 CFU pro Maus infiziert. Mäuse eingeschläfert alle 12 bis 48 Stunden, um akute Verletzungsmodell Kinetik. Lungenversagen (B), der Lunge Bakterienlast (C), Milz bakterielle Belastung (D), bronchoalveoläre Lavage (BAL) Zellularität (E) und BAL Differentialzellzahl (F) werden ebenfalls untersucht. (n = 5) pro Gruppe, Fehlerbalken stellen Mittelwerte ± SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Chirurgische Ausrüstung und intranasale Instillation.
(A) Chirurgische Geräte erforderlich, um akute Verletzung Modell und Bronchiallavage durchführen. Hier Trachealkanüle (20G) und die zwei 1 ml Spritzen sind mit einem Luer-Lock-3-Wegeventil angeschlossen ist. Eine Spritze, um Wasser in die Lunge zu injizieren, eines, um den bronchoalveolären Flüssigkeit wieder aus den Lungen zu ziehen. (B, C) Position der Maus in der Hand, um die intranasale Instillation durchzuführen. In diesem Foto der Daumen unter dem Kiefer sorgt für einen geschlossenen Mund während Einträufeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Chirurgie und bronchoalveoläre Lavage.
Die Brust ist weit geöffnet (A) und Brustkorb seitlich geöffnet werden, um Verletzungen des Herzens (B) zu vermeiden. Nach der Blutentnahme ist das Halsbereich seziert, um die Luftröhre (C) aussetzen. Zahnseide ist als verwendetNahtmaterial und ist hinter der Luftröhre (C, D) geleitet. Die Luftröhre wird dann mit dem 20-G-Kanüle in Kombination (D) eine Kanüle auf die Spritze und 3-Wege-Ventil angebracht ist. Die Luftröhre sollte eng um die Kanüle durch Binden eines chirurgischen Knoten mit der Naht in Position hinter der Luftröhre zu sichern. Schließlich 500 ul PBS werden sanft in die Lunge eingeimpft und dann die BAL wird vorsichtig herausgezogen. (E) Flüssig-eingeflößt Lunge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Minimal eingeflößt Burden | Maximal eingeflößt Burden | |
| T3SS- | 5 x 10 & sup7; | 1 x 10 & sup8; |
| T3SS + | 5 x 10 & sup6; | 1 x 10 & sup7; |
| T3SS + ExoU + | 5 x 10 | 1 x 10 & sup5; | |
Tabelle 1 P. aeruginosa Inokula in Acute Lung Infection Modelle.
Empfohlene optimale intranasale Konzentrationen von Inokula an akutem Lungenversagen nach Stämme zu induzieren.
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Discussion
Tiermodelle, insbesondere Säugetieren, nützlich sind, um komplexe Mechanismen der Wirt-Pathogen-Wechselwirkung in den Bereichen Immunität aufzuklären. Natürlich ist der Informationsbedarf, erhältlich nur aus Tiermodellen müssen wesentlich sein; Andernfalls muss die Verwendung von Tieren durch In-vitro-Modelle ersetzt werden. Dieses Tiermodell zeigt die Erkenntnis, dass nur von einem Tiermodell zur Verfügung gestellt werden kann, da die Wechselwirkung zwischen Pathogene wird durch Reaktion eines mehrkomponentigen Host vermittelt werden. Mäuse derzeit verwendet, um dieses Wirt-Pathogen-Interaktion zu studieren sind junge Erwachsene im Alter von 6 bis 10 Wochen mit einer reifen und unverändert Immunantwort. Wenn sich auf der angeborenen Immunantwort, werden bevorzugt C57Bl6 / J Mäusen Hintergrund. Um einen Effekt von Sex und hormonellen Zyklus (insbesondere Östrogen) auf die Immunantwort zu vermeiden, sind daher Männchen die beste Wahl. Um eine statistische Signifikanz zu erreichen, müssen Gruppen von mindestens 5 Personen am Ende des Versuchs, aber die von allen Tier experimen vorgeschlagenentation Leitlinien sollte die Zahl der verwendeten Tiere reduziert werden und verfeinert, um ein striktes Minimum.
Transport vom Züchter die Bereitstellung der Tiere in die Forschungseinrichtung induziert Stress bei Mäusen. Die Folge ist eine erhöhte Sekretion von inflammatorischen Zytokinen, die nachfolgenden Experimenten wie der unsrigen verändern kann. Darüber hinaus ist eine neue Umgebung und neue "Käfiggenossen", um Stress beitragen. Folglich muss Mäusen über mindestens sieben Tage vor der in ihrem neuen Wohnumfeld zu studieren akklimatisiert werden. Das Wohnumfeld muss kontrolliert werden und bietet Standard-Futter und Wasser ad-lib, eine Tag / Nacht-Zyklus, und geeignete stabile Luftfeuchtigkeit und Temperatur.
Beide Lungen Kolonisation und Infektion der Lunge Modelle erfordern Übung und Fingerfertigkeit. Instillation können intranasal oder intra tracheal durchgeführt werden. Letzteres ist schwieriger und erfordert mehr Know-how durch Ausbildung aufgrund einer hohen Gefahr von anoxischen Herzstillstand. Tatsächlich ist die procedure erfordert eine Maus erfolgreich intubieren in weniger als 15 sec und erforderte daher tiefer Anästhesie. Unsere Wahl intranasale Instillation ist einfacher durchzuführen, da der Weg der Verabreichung zugänglich ist, weniger riskant erfordert leichtere Anästhesie und ist besser reproduzierbar.
Boutoille et al bereits unseren akutem Lungenversagen-Modell, vor allem die Beurteilung der Lungenschädigung durch Messung alveoläre-Kapillar-Schranken-Permeabilität mit FITC-markiertem Albumin 16 beschrieben. Um die Anzahl von Mäusen pro Experiment zu reduzieren, wurde dieses Verfahren angepasst und verbunden mit bronchoalveoläre Lavage (BAL). In den Studien von Boutoille et al verwendeten wir den Vergleich zwischen der Fluoreszenz von FITC-markiertem Albumin im Lungenhomogenat Überständen und Blutüberstände 17.
Um diesen Vergleich zu vollführen, werden die Hämoglobinwerte und Hämatokrit-Werte erforderlich. Dieses Verfahren wurde angepasst, um allow die gleichzeitige Analyse der Immunantwort des Wirtes durch die Bereitstellung von einer Lunge zu einer Homogenisierung und Beurteilung der Lungenverletzung und die andere Spülung und Untersuchung der Wirtsantwort. In der Tat kann BAL-Flüssigkeit verwendet werden, um Cytokinspiegel, Protein-Sekretion und Zellrekrutierung zu bewerten. Unsere Anpassung bietet weitere Ergebnisse aus einer Tierversuch, die Senkung der Kosten und die erforderliche Anzahl von Mäusen, insbesondere bei Verwendung von Knock-out-Mäusen, 17, wie in Tierversuchen Richtlinien empfohlen. Darüber hinaus wird ein Teil der Lunge bei -80 ° C gehalten, um die Gesamt-RNA-Extraktion und quantitative Polymerasekettenreaktion oder histologische Analyse durchzuführen. Vergleich zwischen der vorherigen und der neuen Methode angepaßtes Verfahren, gekoppelt mit BAL zeigt vergleichbare Ergebnisse (3A) Lungenverletzung Index zu beurteilen.
Bei der Untersuchung von Mear et al, unter Verwendung derselben Verfahren, Durchflußzytometer Analyse wurde an BAL-Zellen durch Zentrifugation der BAL-Flüssigkeit erhalten wird durchgeführt. Ähnliche analyses wurden auf Gesamtlungenzellen aus der Lunge 12 durchgeführt. In diesem Fall kann die Lungenschädigung Bewertung mit FITC-markiertem Albumin nicht gleichzeitig durchgeführt werden, aufgrund von Artefakten durch FITC (gleichen Kanal als Green Fluorescence Protein) induziert. Deshalb, wenn der Durchflusszytometrie ist erforderlich, Versuche muss entsprechend geplant werden.
Der Zeitpunkt der Euthanasie ist kritisch. Ein Zeitverlauf der akuten Lungeninfektionsmodell über den ersten 72 Stunden vorgestellt Abbildung 3. In diesem Modell wird der Gipfel der Lungenschädigung und Wirtsreaktion findet zwischen 24 und 36 h (Abbildung 3). So wird in unserem Design der 24-Stunden-Endpunkt wurde als eine Auslese aus 3 Gründen entschieden: Erstens, ist es leicht, im Labor zu organisieren, zweitens, um den Verlust von Mäusen aufgrund der Mortalität zwischen 24 und 36 Stunden, und schließlich zu vermeiden, weil Wirtsantwort maximal war zu diesem Zeitpunkt.
Der erste Schritt unserer Interaktionsstudie ist die Besiedlung der Atemwege mit <em> C. albicans. Mit Hilfe eines Instillation von 10 5 CFU pro Maus wird ein 4-Tages-Persistenz-Modell ohne Lungenverletzung erhalten. Tatsächlich zugenommen Mäusen über den Zeitverlauf dieser Phase. Gewichtszunahme ist ein nützlicher Indikator für das Fehlen von Verletzungen im Einklang mit der Kolonisierung im Gegensatz zu Infektionen. Zwar eine erhöhte Anfangslast (mehr als 10 6 KBE pro Maus) induzierten Lungenverletzung (2C) und eine schädliche host-Reaktion weit über Priming, wobei Mäuse Gewicht verloren (2D). Im Gegenteil, mit einer geringeren Anfangslast (beispielsweise 10 & sup4; CFU je Maus), das einen Luftweg Persistenzmodell konnte nicht erhalten werden. Um somit die beobachtete Priming durch Mear et al 12 beschriebenen Wirtsimmunität zu erzielen, ist die Kalibrierung des instilliert Pilz Belastung entscheidend für den Erfolg und Überwachen des Gewichtskurve ist eine Schlüsselsteuerung.
Die gleiche Präzision ist für P. erforderlichen aeruginosa und P. induzieren aeruginosa wird schnell aus der Atemwege durch eine geeignete Wirtsantwort gelöscht. Mit Hilfe eines übermäßig hohen Anfangs P. aeruginosa übersteigt die Kapazitäten der Wirtsabwehr oder sogar induziert eine unangemessene und derleterious Antwort, was zu Last führt zu massiven akuten Verletzungen und Tod Löschen aller Unterschiede zwischen den Gruppen. Die optimale Inokulum akute Verletzung zu induzieren, hängt von der Anwesenheit eines funktionellen Typ-3-Sekretionssystem (T3SS) und die Produktion von Exotoxin U, einem Toxin vom T3SS transloziert in die Wirtszelle Zytoplasma. Diese beiden Stamm-spezifische Attribute müssen bei der Wahl der Ausgangskeimbelastung betrachtet werden. Ausgangskeimlasten werden in diesem Artikel vorgeschlagen, als Beispiele der unteren und oberen Grenzen zu einer akuten Lungenschädigung mit T3SS-negative oder positive Dehnung und Stämme, die Exotoxin-U ist oder nicht (Tabelle 1) zu induzieren. Bei der UntersuchungEinbeziehung T3SS weist Stamm gezüchtet werden O / N und mit neuen LB Medium 3 h wieder auf, bevor die Vorbereitung des Inokulums in optimale Aktivität T3SS erhalten.
Die Bestimmung der Bakterien- und Pilzbelastung 24 Stunden nach P. aeruginosa induzierten Lungenentzündung erfordert spezielle Überlegungen in diesem Abschnitt behandelt. In der Tat, wie gezeigt, wenn Mäuse mit 5 × 10 6 CFU T3SS-positive Stamm, bakterielle Belastung in der Lunge bei 24 Stunden infiziert sank um etwa 1 log (3C). Reihenverdünnungen von Proben sind bis zu 5-log-Verdünnung durchgeführt und auf BCP-Agarplatten werden. In Bezug auf C. albicans in der Lunge, bei 72 h, Pilzbelastung wird auf etwa 2 log verringert und Proben müssen auf YPD-Agar mit Amikacin ergänzt werden, um die Identifizierung zu erleichtern Kolonie plattiert werden. Schließlich kann die Bestimmung von Bakterienverbreitung durch Plattieren von 100 ul Blutprobe BCP-Agar oder durch Plattieren von 100 ul Milz h beurteiltomogenates auf dem gleichen Medium. Die zwei Verfahren wurden bereits verglichen und Milz Kultur scheint genauer zu sein. In der Tat ist die Milz ein Organ, das "Filter" Vollblut und kann "Konzentrat" und zur Erhaltung der Bakterien, die auf das Blut verbreitet. So, Milz Homogenate spiegeln die systemischen bakteriellen Verbreitung während der akuten Infektion der Lunge mit einer höheren Empfindlichkeit als Blut. Blutproben dar Verbreitung von Bakterien an einer ganz bestimmten vorgegebenen Zeit und möglicherweise nicht repräsentativ für das Phänomen der bakteriellen Verbreitung als Ganzes. Daher werden bevorzugt Milz Homogenat Kulturen.
Lungenschädigung Index ist ein empfindliches Beurteilung der Lungenschädigung vor einer Infektion und / oder die Reaktion unangemessen Host und der Wirkung von potentiellen Therapeutika für diese Elemente ergeben. Darüber hinaus ermöglicht diese in viv o-Modell der Sammlung von mehreren verschiedenen Proben Wirtsantwort zu untersuchen. Lunge zur RNA-Extraktion und Analyse verwendet werdender Gentranskription. Lungenproben können auch in Paraformaldehyd (PFA) zur weiteren histologischen Beobachtungen aufgestellt werden. BAL-Flüssigkeit kann zur Beurteilung der Proteinsekretion wie entzündliche Cytokine verwendet werden. Schließlich kann, wie oben diskutiert das Protokoll angepasst ist, um Proben für die Durchflußzytometrie-Analyse bereitzustellen.
Schließlich kann dieses Protokoll ausgelegt ist, C. modelize werden albicans- Mikroben Interaktion in Beatmungspneumonie beteiligt wie Staphylococcus aureus 18 oder Enterobakterien. Eine weitere Anpassung könnte Atemwege Kolonisierung werden unter Verwendung von Bakterien statt C. albicans um bakterielle Interaktion bei chronischen eitrigen Lungenerkrankung wie Bronchiektasie modelize. Zu diesem Zweck haben immungeschwächten Mäusen verwendet werden soll, weil bakterielle Clearance bei immunkompetenten Mäusen hat eine persistente Atemwegs Besiedelung nicht zulassen.
Zur Instillation, ist die Position der Hand, die das Tier crischen. Wie bereits im vorherigen Abschnitt unterstrichen, wenn intranasal Einträufeln die Maus muss der Betreiber dafür sorgen, dass den Mund ist perfekt geschlossen Auswurf der Lösung zu vermeiden. Der Daumen unterstützt die Backe und hält den Mund während des gesamten Verfahrens Instillation (4B) verschlossen ist. Dann wird mit der anderen Seite wird die Pipette über ein Nasenloch (4C) und die Lösung ohne Luftblasenbildung zu verhindern, schrittweise und sanft instilliert abgeschieden. Offensichtlich muss Instillation in einem Level 2-Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.
Entnahme von Proben erfordert certifed Kleintier-chirurgische Ausbildung des Bedieners. Bei jedem Schritt sind Proben auf Eis gestellt, um die Zelllyse zu vermeiden und die Proteine vor Denaturierung. Grund chirurgische Instrumente benötigt werden (4A). Sie müssen, um durch Autoklavieren vor Gebrauch sterilisiert werden. Es wird empfohlen, verschiedene chirurgische Instrument Sets für abdomina verwendet werdenl und Brustoperationsschritte, Kreuzkontamination von Lungenproben vermieden. Die verschiedenen kritischen Schritte von chirurgischen Dissektion vorgestellt (5A-5E). Position der Maus ist von entscheidender Bedeutung; das Tier sollte flach immobilisiert werden auf dem Rücken Kopf gegenüber dem Betreiber und gerade. Ethanol sollte großzügig auf prep vor dem ersten Schnitt verwendet werden, um die Ausbreitung von Haaren in den Proben und potentielle bakterielle Verunreinigung von der Haut zu vermeiden. Haut gut vaskularisiert und müssen sorgfältig zurückgezogen werden, um Blutungen (5A) zu vermeiden.
Dann wird der Brustkorb nach einer seitlichen Brusteinschnitt, in dem der Brustkorb sollte konstant in der Pinzette Griff gehalten werden, um eine Verletzung des Herzens und der Lunge während des Schnittes vermieden gelehnt. Lunge und Herz ausgesetzt sind (5B). Nicht infizierte Lunge erscheinen weißlich (5B). Dissektion der Halsbereich macht die Luftröhre und ein Nahtmaterial ist autoefully hinter der oberen Luftröhre (5C) angeordnet ist. Kanülierung die Luftröhre mit Vorsicht durchgeführt werden. Verwenden Sie keine übergroßen Kanüle (maximale Größe beträgt 20 G). Eine kleine Anteriorinzision des membranösen Trachea zwischen zwei Knorpelringe ermöglicht Einführen der Kanüle. Wenn die Kanüle durch die Transparenz durch die Luftröhre oberhalb der Carina (5D) beobachtet wird, wird das Nahtmaterial fest um die Trachea Befestigung um die Kanüle (5E) gebunden. Die Kanüle ist mit einem 3-Wege-Luer-Lock-Ventil mit 2 Spritzen zu den weiblichen Anschlüssen verbunden. Eine Spritze enthält eiskaltem PBS für Bronchiallavage; die andere ist leer, um die BAL-Flüssigkeit zurück zu ziehen. Diese Spritzen sollte zwischen Gruppen chaged werden.
Abschließend Grundierung vor akutem Lungenversagen-Modell ist eine relevante und leistungsfähiges Modell zu in vivo-Host-vermittelte Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern zu erkunden. Die Verwendung von Tieren ist dasHauptbegrenzung und sollte sorgfältig gegen die Auskunft in vitro abgewogen werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sevorane, Sevoflurane | Abott | 05458-02 | 250 ml plastic bottle |
| Fluorescence Reader Mithras LB940 | Berthold Technologies | reference in first column | no comment |
| Bromo-cresol purple agar | Biomerieux | 43021 | 20x per unit |
| Pentobarbital sodique 5.47% | CEVA | 6742145 | 100 ml plastic bottle |
| 2-headed valve | Distrimed | 92831 | no comment |
| Sterile inoculation loop 10 µl | Dutscher | 10175 | x1,000 conditioning |
| Insuline syringes 1 ml | Dutscher | 30003 | per 100 conditioning |
| 2 positions Culture tube 8 ml | Dutscher | 64300 | no comment |
| Ultrospec 10 | General Electric life sciences | 80-2116-30 | no comment |
| Hemolysis tubes 13 x 75 mm | Gosselin | W1773X | per 100 |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life technologies | 10010023 | packaged in 500 ml |
| amikacin 1 g | Mylan | 62516778 | per 10 |
| Heparin 10,000 UI in 2 ml | Pan pharma | 9128701 | 10x per unit |
| RAL 555 coloration kit | RAL Diagnostics | 361550 | 3 flacons of 100 mL |
| 1.5 ml microcentrifuge tube | Sarstedt | 55.526.006 | x 1000 |
| Transparent 300 µl 96-well plate | Sarstedt | 82 1581500 | no comment |
| Yest-peptone-Dextrose Broth | Sigma | 95763 | in powder |
| FITC-albumin | Sigma | A9771 | in powder |
| Luria Bertani Broth | Sigma | L3022 | in powder |
| 25-gauge needle | Terumo or unisharp | A231 | x 100 conditioning |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | no comment |
References
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