Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

לומד קהילות חיידקים doi: 10.3791/53218 Published: January 13, 2016

Abstract

לימוד אינטראקציה מארח הפתוגן מאפשר לנו להבין את המנגנון הבסיסי של פתוגניות במהלך זיהום חיידקים. הפרוגנוזה של המארח תלוי במעורבות של תגובה חיסונית מותאמת נגד הפתוגן 1. תגובה חיסונית היא מורכבת ותוצאות מהאינטראקציה של פתוגנים וכמה סוגים חיסוניים תאיים או אי-חיסון 2. מחקרים במבחנה לא יכולים לאפיין אינטראקציות אלה ולהתמקד באינטראקציות תא-הפתוגן. יתר על כן, בדרך הנשימה 3, במיוחד בחולים עם מחלת ריאות כרונית מוגלתית או בחולי מאוורר מכאני, קהילות polymicrobial נמצאים ולסבך אינטראקציה מארח הפתוגן. אלביקנס Pseudomonas aeruginosa וקנדידה שניהם הבעיה פתוגנים 4, לעתים קרובות מבודדת מדגימות tracheobronchial, ו קשורים לזיהומים חמורים, במיוחד ביחידה לטיפול נמרץ 5. יש אינטראקציות חיידקיםדווח בין פתוגנים אלה במבחנה, אך ההשפעה הקלינית של אינטראקציות אלה נותרה 6 לא ברורים. כדי לחקור את יחסי הגומלין בין C. אלביקנס ופ aeruginosa, מודל עכברי של ג קולוניזציה אלביקנס דרכי הנשימה, ואחריו פ דלקת ריאות חריפה בתיווך aeruginosa- בוצעה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מודלים של בעלי חיים, בעיקר עכברים, נעשו שימוש נרחב כדי לחקור את תגובה חיסונית נגד פתוגנים. למרות חסינות מולדת ונרכשת שונה בין מכרסמים ובני האדם 7, הקלות בגידול והפיתוח של knockouts לגנים רבים, להפוך עכברי מודל מצוין ללמוד תגובות חיסוני 8. התגובה החיסונית היא מורכבת ותוצאות מהאינטראקציה של הפתוגן, (תאי האפיתל, תאי האנדותל) צמחיית תושב חיידקים וכמה (לימפוציטים, נויטרופילים, מקרופאגים) חיסוניים ואינם חסינים סוגים סלולריים 2. במבחנה אינה מאפשרות התבוננות אינטראקציות המורכבות אלה ומתמקדים בעיקר באינטראקציות התא-פתוגן ייחודיים. בעוד מודלים של בעלי חיים יש להשתמש בזהירות ובמוגבלת לשאלות מאוד ספציפיות ורלוונטיות, מודלים עכבר מספקים תובנה טובה לתגובה החיסונית יונק in vivo ויכולים להתייחס לחלקים של שאלות קליניות חשובות 7.

"Jove_content"> בדרכי הנשימה, קהילת החיידקים היא מורכבת שיוך מספר גדול של מיקרואורגניזמים שונים 6. בעוד מה שמהווה Microbiome "נורמלי" בדרכי נשימה עדיין לא נקבע, קהילות תושב לעתים קרובות polymicrobial, ומקורן ממקורות אקולוגיים מגוונים. חולים עם מחלת ריאות כרונית מוגלתית (סיסטיק פיברוזיס, bronchectasis) או חולי מאוורר מכאני התערוכה צמחייה מסוימת בשל התישבות של דרכי הנשימה על ידי מיקרואורגניזמים לסביבה שנרכשו-9. אלביקנס Pseudomonas aeruginosa וקנדידה שניהם הבעיה פתוגנים 5, לעתים קרובות מבודדת יחד מדגימות tracheobronchial , ואחראי לזיהום אופורטוניסטי חמור בחולים אלה, במיוחד ביחידה לטיפול הנמרצת (ICU) 4.

בידוד של מיקרואורגניזמים אלה בדלקת ריאות חריפות בתוצאות טיפול נמרץ בטיפול אנטי-מיקרוביאלי נגד פ aeruginosa בשמרי ut בדרך כלל לא נחשבים פתוגניים באתר זה 5. במבחנה אינטראקציות בין פ aeruginosa וג אלביקנס כבר דווח בהרחבה, והראה כי מיקרואורגניזמים אלה יכולים להשפיע על הצמיחה וההישרדות של אחד את השני, אבל מחקרים לא הצליחו להסיק אם נוכחותם של ג אלביקנס הוא מזיק או מועיל למארח 10. מודלים העכבר פותחו כדי לטפל בזה רלוונטי של פ aeruginosa וג אלביקנס in vivo, אבל האינטראקציה בין מיקרואורגניזמים לא הייתה נקודת המפתח. ואכן, המודל הוקם כדי להעריך את מעורבותו של ג אלביקנס בתגובה מארח חיסוני, ותוצאה.

דגם קודם שנקבע על ידי רו et al כבר השתמש התישבות ראשונית עם ג אלביקנס אחרי דלקת ריאות חריפה הנגרמת על ידי פ ' aeruginosa. שימוש במודל שלהם, החוקרים מצאו תפקיד מזיק של prior ג אלביקנס קולוניזציה 11. עם זאת רו et al משמש עומס גבוה של ג אלביקנס במודל שלהם עם 2 x 10 6 CFU / עכבר במהלך 3 ימים רצופים. הקמנו מודל 4 ימים של ג קולוניזציה בדרכי הנשימה אלביקנס, או בהתמדה לפחות ללא פגיעת ריאות, במודל זה ג אלביקנס אוחזר עד 4 ימים לאחר החדרה יחידה של 10 5 CFU לכל עכבר (איור 2) 12,13. לאחר 4 ימים, אין עדות לגיוס דלקתי תא, ייצור ציטוקינים דלקתי ולא נזק אפיתל נצפתה. ב24 - 48 שעות, בנוכחות השיא של ג אלביקנס, למרות שתגובה חיסונית מולדת סלולרית וציטוקינים נצפתה, לא היה עדות לפגיעת ריאות. באופן מפתיע, עכברים וכך יישבו עם ג אלביקנס 48 שעות לפני intranasal החדרה של פ aeruginosa שנחלש זיהום בהשוואה לעכברים עם פ זיהום aeruginosa לבד. אניndeed, עכברים הציגו פציעת ריאות פחותה וירידה בניטל חיידקי 12,13.

כמה השערות יכולות להסביר השפעה חיובית זו של התישבות מוקדמת עם ג אלביקנס על פ aeruginosa בתיווך דלקת ריאות חריפה. ראשון, שיחה בין-interspecies מעורב כל מיקרואורגניזמים מערכות חישת מניין, פ מבוסס homoserinelactone מערכת aeruginosa וג מבוסס פרנסול מערכת אלביקנס, הוערכה. שנית, ג אלביקנס פועל כמטרה "דמה" לפ aeruginosa הסטת הפתוגן מתאי האפיתל ריאות נחקר. שני ההשערות ביטלו (נתונים שלא פורסמו). ההשערה השלישית הייתה של "תחול" של מערכת החיסון המולדת על ידי ג אלביקנס האחראי לתגובה מולדת הבאה משופרת נגד פ aeruginosa. ההשערה האחרונה זו אושרה. אכן ג קולוניזציה אלביקנס הובילה ליחול חסינות מולדת throuGH IL-22, בעיקר מופרש על ידי תאי הלימפה מולדים, וכתוצאה מכך אישור חיידקים גדל ומופחת פגיעת ריאות 12.

לסיכום, המארח הוא שחקן מרכזי ביחסי הגומלין בין מיקרואורגניזמים ויסות התגובה חיסונית המולדת ומעורבים סוגי תאים דלקתיים שונים. בעוד שניתן גזור אינטראקציות חיסוני המורכבות אלה במבחנה ניתן לספק השערות הראשוניות רק על ידי מתאים בדגמי vivo. הפרוטוקול הבא מספק דוגמא למחקר vivo של אינטראקציה הפתוגן בתיווך מארח שעשוי להיות מותאם למייקרו-אורגניזמים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הוועדה המחוזית האתיקה האזורית לניסויים בבעלי החיים אישרה בשיטה זו, בהתאם לטיפול בבעלי חיים לאומי ובינלאומי ושימוש בקווי מנחים מחקר ניסיוניים.

אוסף 1. לדוגמא

  1. אחסון מדגם
    1. לאסוף את כל הדגימות ומייד לאחסן ב-- 20 מעלות צלזיוס או על קרח עד אחסון במקפיא, כדי למנוע הידרדרות. הנח פוספט סטרילי שנאגרו (PBS) על קרח כדי לשפר lavages סימפונות מכתשי ביצועים (BAL).
  2. כִּירוּרגִיָה
    1. לעקר את כל הציוד כירורגי באמצעות החיטוי.
      הערה: במידת האפשר, מומלץ להשתמש בשתי קבוצות שונות של מכשירים לצעדי בטן ובית חזה, כדי למנוע זיהום צולב. ציוד לנתיחה חובה מפורט באיור 4 א

2. עכברים, זני חיידקים ושמרים

  1. עכברי בית בעמידה בשימוש מקומי של בעלי חיים מחדשהנחיות ועדת איתור במעמד מאוורר ללא עולה על 5 עכברים לכלוב, במזון ובמים lib מודעה, במתקן דיור ברמת בטיחות ביולוגית 2 עקב השימוש של 2 מיקרו-אורגניזמים ברמת בטיחות ביולוגית: פ aeruginosa וג אלביקנס.
  2. שמור את זני החיידקים ב -80 ° C ב -40% בינוניים גליצרול.
    1. להוסיף חיידקים ישירות ממניות קפוא לתוך צינור תרבות המכיל 3 מיליליטר של המרק לוריא-Bertani סטרילי באמצעות חיסון לולאת 10 μl. השאר O ​​/ N ב 37 מעלות צלזיוס עם (סל"ד 400) רועד מסלולית היום לפני החדרה.
    2. חיידקי קציר על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות.
    3. לשאוב supernatant לסילוק פסולת הביולוגי מסוכן סגור מתאים. שים לב גלולה חסיד לבנה בחלק התחתון של צינור התרבות.
    4. לשטוף ולהשעות את גלולה באמצעות 5 מיליליטר של PBS.
    5. חזור על השלבים 2.2.2 ל2.2.3 בפעם שנייה כדי לבצע שטיפה שנייה.
    6. Resuspend חיידקי pelleted באמצעות 1 מיליליטר של PBSוvortexing הקצר.
    7. לקבוע את צפיפות הבידוד באמצעות מדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר באמצעות מד צפיפות אופטי. צפיפות של 0.9 מתאים 10 9 CFU / ml לPAO1, לדלל בהתאם.
      הערה: תוצאה זו יש כדי להתקבל לכל זן בשימוש על ידי קביעת צפיפות של דילולים רצופים של הבידוד מכויל.
    8. ודא הבידוד על ידי דילולים לוגריתמים סידוריים וצלחת של דילול כל 100 μl על bromocresol צלחות אגר סגול (BCP) ותרבות O / N. לנהל כל עכבר 50 intranasally μl של התמיסה המכילה 1 x 08-02 אוקטובר x10 8 CFU למ"ל (5 x 06-01 אוקטובר x10 7 CFU לכל עכבר).
  3. השימוש ג אלביקנס SC5314 כזן התייחסות. לשמר את המתח ב- 40% בינוניים גליצרול ב -80 ° C.
    1. תוספת מרק שמרים-Peptone דקסטרוז עם אמיקצין 0.015%, כדי למנוע זיהום בקטריאלי ולהקל ספירה נוספת.
    2. להוסיף שמרים באמצעות 10 ו# 181; חיסון לולאת l לYPD-מרק מוכן להשלים עם O אמיקצין / N על 37 מעלות צלזיוס.
    3. שמרי קציר על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות.
    4. הסר supernatant לסילוק פסולת bioharzard מתאים. גלולה חסיד לבנה יש לשים לב שבתחתית צינור התרבות.
    5. לשטוף ולהשעות את חיידקי pelleted באמצעות 5 מיליליטר של PBS וvortexing הקצר.
    6. חזור על השלבים 2.2.2 ל2.2.3 בפעם שנייה כדי לבצע שטיפה שנייה.
    7. Resuspend גלולה באמצעות 1 מיליליטר של PBS וvortexing הקצר.
    8. לקבוע את הגודל של הבידוד על ידי סומך על hematocytometer Mallassez באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי ב40X הגדלה.
      הערה: ריכוז (בCFU / ml) מתקבלת באמצעות הנוסחא הבאה: (מספר השמרים x 10 5) / (מספר המלבנים רשת לספור על hematocytometer Mallassez).
    9. ודא ידי דילול לוגריתמים סידורי 10 -5 ו -10 -6 לאשר פתרון המכיל 2 x 10 6 CFU / ml.
    10. צלחת על צלחות אגר YPD בתוספת אמיקצין 0.015%.

3. איירווייס התיישבות על ידי ג אלביקנס

הערה: לאחר הסתגלות סביבתית, עכברים הם שקלו פעמיים ביום.

  1. מתחת למכסת מנוע קטר, 500 μl הפקדת sevoflurane על 4 סנטימטרים X 4 סנטימטר גזה (טכניקה פתוחה שחרר) 14.
    1. מייד למקם את הגזה על הרצפה של תא כ 750 מיליליטר אינדוקציה. מייד למקם את הפלטפורמה העלתה רשת מעל הגזה, כדי למנוע מגע ישיר בין בעלי החיים והגזה.
    2. סגירת מכסה אטום ולחכות 1 עד 2 דקות, כדי לאפשר דיפוזיה של sevoflurane בתא.
    3. העבר את העכבר מכלוב לרשת פלטפורמה וקרובה מיכסה. הרדמה אור עם נשימה ספונטנית שימור צריכה להיות מושגת ב30 עד 45 שניות.
    4. לפקח על hypotonia על ידי התבוננות אובדן ליישר רפלקס שבו נקודת העכבר ניתן להסיר FROM התיבה והחדיר.
  2. החדרת intranasal (ניתן לבצע בשניות 10 על ידי מפעיל מיומן).
    1. החזק את העכבר אחד בידיים שוכנות על גבה זקוף (איור 4).
    2. בעזרת אצבע, תומך בראש ולהשתמש באגודל כדי לשמור על הלסת סגורה כדי למנוע יריקה (איור 4C).
    3. כפי שתואר בשלב 2.3.8, להבטיח כי ג מוכן פתרון אלביקנס מכיל 2 x10 6 CFU למ"ל לμl 50 החדיר נפח.
      הערה: הנקודה הקריטית השנייה היא הנפח החדיר. נפח נמוך מ -50 μl עלול לגרום לקולוניזציה מספיקה או החדרת הומוגניות של דרכי הנשימה, נפח גדול יותר עלול לגרום לטביעה / חנק ומוות.
    4. להחדיר את העכבר תוך מאנפף ידי מתקרב פיפטה לנחיריים.
    5. פיפטה ירידה של 50 μl יוצרת בועה המכילה את הפתרון בנחיריים, בשאיפה לאחר מכן על ידי spontaneouslעכבר נשימת y.
    6. מקום עכבר באזור התאוששות (למשל, כלוב חשוף מוגזים היטב גדול עם מנורת חימום מעל). עכברים חייבים להיות במעקב עד התעוררות מלאה. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על כיבה sternal ורפלקס ליישר. בשלב זה, העכבר ניתן להחזיר לכלוב דיור רגיל.

4. פ הזיהום חריף ריאות -induced aeruginosa

הערה: עכברים הם שקלו במהלך ארבעה הימים הבאים. בדרך כלל, עכברים לעלות במשקל במהלך ג קולוניזציה תיווך אלביקנס בדרכי הנשימה (איור 2 א).

  1. הכן את ההשעיה מכילה פ aeruginosa היום של החדרה לאחר O / צמיחת N (סעיף 2.2).
  2. הרדימי בקצרה באמצעות שאיפת sevoflurane כפי שתואר לעיל (סעיף 3.1).
    הערה: כדי לבצע דלקת ריאות חריפה, מומלץ נטל חיידקים הם הציעו בטבלת 1.
  3. להחדיר את העכבר כפי שתואר לעיל (סעיף 3.2) עם תשומת לב מיוחדת להתאוששות שלאחר החדרה.

5. מדוד של ריאות פגיעה אינדקס

  1. הכן תמיסה המכילה אלבומין FITC שכותרתו. הזרק פתרון HR 2 זה לפני המתת חסד של בעלי החיים.
    1. שוקל 0.2 מ"ג של אלבומין-FITC עם הציוד המתאים.
    2. להוסיף 0.2 מ"ג למ"ל PBS 1. בקצרה מערבולת. אם לא נעשה שימוש באופן מיידי, למקם את הפתרון בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור הסביבה.
    3. להזריק תוך-peritoneally 200 μl של פתרון אלבומין FITC שכותרתו לכל עכבר.
  2. המתת חסד
    1. לשקול את העכברים לנתונים במשקל האחרונים.
    2. להרדים עכבר אחת בהתאם לשימוש מקומי של בעלי חיים בהנחיות ועדת מחקר באמצעות זריקה אחת תוך הצפק ממנת יתר קטלני של pentobarbital: 300 μl של pentobarbital 5.47%.
    3. הסר עכבר מהכלוב ומקבל lהזרקת ethal על ידי מפעיל.
    4. לאחר הזרקה, להעביר את העכבר לבד לכלוב אחר, נסתר מכל בעלי חיים אחרים. שים לב לעכבר עד היעדר התנועה. מוות הוא לאשר בהיעדר התנועה, תנועה במיוחד בדרכי הנשימה, חוסר הדופק.
    5. לבצע איסוף של דגימות כירורגית על חיות מתות, ולכן ללא הרדמה ולא משככי כאבים.
  3. אוסף כירורגי מדגם: שלב בית חזה.
    הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים, כל הניתוח מתבצע תוך שימוש בציוד סטרילי בסביבת רמת בטיחות ביולוגית 2.
    1. החל אתנול לעור. לבצע חתך בעור קו האמצע מעצם החזה ועד אמצע בטן עם מספריים. לַחתוֹך קו האמצע לאורך בית החזה משני הצדדים. מקפלים בחזרה את העור בכל צד של בית החזה כדי להמחיש את כלוב הצלעות.
    2. בצע חתך אנכי של בית החזה משני הצדדים הולכים לכיוון עצם הבריח כדי שתוכל להישען על קיר החזה הקדמי כולו עם שטרןאממ מאפשר הדמיה המושלמת של לב וריאות (איור 5 א, 5).
    3. איסוף דם באמצעות מזרק מראש heparined על ידי ניקוב הלב ליד עורק interventricular. למשוך מינימום של 500 μl להשיג פלזמה לפחות 100 μl. מניחים את דגימת הדם על קרח.
    4. לבצע חתך בצוואר הרחם קו האמצע כדי להמחיש את קנה הנשימה (איור 5 ב ו -5 ג). זהירות לנתח את fascia סביב קנה הנשימה. מניחים תפר מאחורי קנה הנשימה (איור 5 ג ו5D). בהמשך לכך התפר ייסגר סביב מחט cannulating כדי להבטיח שטיפה נאותה.
    5. קטטר קנה הנשימה באמצעות מחט 20-G שונה gavage (איור 5D ו4A). לקשור קשר כירורגית סביב קנה הנשימה cannulated עם התפר ממוקם בעבר.
    6. כדי לבצע lavages רונכואלוואולרית (BAL), בעדינות ובהדרגה להזריק ולצייר 500 μl של PBS קר כקרח ל/ מהריאות. מניחים את המדגם עלייce להימנע תמוגה הסלולרית.
    7. חזור על שלב 5.3.6, 3 פעמים כדי לקבל סך של 1,500 דגימות μl נוזל BAL ושטיפת בריכה לתוך צינור צנטריפוגות 2 מיליליטר (איור 5E).
    8. הסר את הריאות מהחזה. הנח קטע ריאה (גודל צריך להתאים למחצית מריאה אחת או אונה) לתוך 1.5 מיליליטר צינור צנטריפוגות ולאחסן במהירות ב-- 80 מעלות צלזיוס.
    9. הנח קטע ריאות בצינור המוליזה שקל מראש המכיל PBS לקבוע נטל חיידקים ולמקם אותו על קרח.
  4. אוסף כירורגי מדגם: שלב בטן.
    1. לבצע חתך נוסף בצד השמאל של הבטן. שים לב לטחול דרך הצפק.
    2. הסר את הטחול ואת המקום לתוך צינור שני המוליזה המכיל 1 מיליליטר PBS ומניחים על קרח.
  5. מדד פציעת ריאות
    הערה: חדירות קרום מכתשי-נימים מוערכת על ידי מדידת FITC שכותרתו-אלבומין דליפה מהתא של כלי הדם למכתשים-interstתא itial.
    1. מדגם צנטריפוגה דם ונוזל BAL במשך 10 דקות ב 1500 x גרם. לאסוף את supernatants לתוך צינורות צנטריפוגות חדשים. כדורים מתאים לתאי פלזמה או BAL גויסו וצריכים להיות ממוקם על קרח.
    2. להוסיף כל supernatant דם (פלזמה, צהובה) או supernatant BAL 100 μl לצלחת 96-היטב שקופה (300 בארות μl). מניחים נייר כסף על הצלחת אם לא נעשה שימוש באופן מיידי.
    3. למדוד את רמות הקרינה בפלזמה וsupernatants BAL באמצעות קורא microplate פלואורסצנטי (עירור, 487 ננומטר; פליטה, 520 ננומטר).
    4. לקבוע את מדד פציעת ריאות על ידי חישוב יחס הקרינה [(supernatant supernatant / דם BAL) x 100].
  6. ספירת רונכואלוואולרית שטיפה (BAL) תא ההפרש.
    הערה: השתמש בתא גלולה שהתקבל מצנטריפוגה של נוזל BAL בשלב 5.5.1.
    1. במידת הצורך, להשתמש במאגר תמוגה האדום-תא. הוסף 500 μl של חיץ תמוגה אדום תאים לתוך צינור צנטריפוגות מכיל celגלולה l. מערבולת ובקצרה להשאיר 10 דקות על קרח. הוסף 500 μl PBS להפסיק תמוגה האדום-תא.
    2. קציר תאים על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב 1500 x גרם. הסר supernatant ולהשעות את התא גלולה ל1 מיליליטר של PBS סטרילי. ספירת תאים בhematocytometer Mallassez. באמצעות hemacytometer לספירת תאים. להתרכז תאים בשקופית עם cytospin.
    3. תאי כתם באמצעות ערכת צבעים המאפשרת זיהוי וספירת תאים (מקרופאגים, לימפוציטים, נויטרופילים).
  7. נטל חיידקי ריאות והפצת חיידקים
    הערה: כדי להעריך נטל ריאות חיידקית והפצת חיידקים, ריאות וטחול נאספו בהתאמה ומאוחסנות לתוך צינורות המוליזה-שקל מראש המכילים 1 מיליליטר של PBS (צעד 5.3.9).
    1. לשקול צינורות המוליזה המכילים 1 מיליליטר PBS וגם ריאות או טחול. Homogenize הדגימות עם homogenizer רקמות להשיג homogenates ריאות והטחול homogenates.
    2. הפקדה של הומו רקמה 100 μlgenates לתוך צינורות צנטריפוגה המכילים 900 μl של PBS סטרילי כדי להשיג דילולים לוגריתמים סידוריים.
    3. צלחת שתי דוגמאות האחרונות המתאימות מדוללות (10 -3 ו -10 -2) משני BCP-אגר לפ aeruginosa או YPD-אמיקצין-בתוספת אגר לג אלביקנס ריאות ונחישות נטל טחול.
    4. דגירה צלחות O / N על 37 מעלות צלזיוס. למחרת, למנות את המושבות על צלחות.
    5. מדד התוצאה למשקל ריאות להשיג CFU לגרם של ריאות. גודל מדגם ריאות הם לא אותו הדבר, התוצאה היה צריך לבוא לידי ביטוי בCFU לגרם של ריאות.
      נוסחה למדד היא: [CFU] x [משקל של צינור המוליזה וריאות] - [משקל של צינור המוליזה].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כפי שניתן לראות בעבר בתיאור הפרוטוקול, הניסוי צריך 5 ימים כדי להשלים (איור 1: ציר זמן ניסוי). מפעיל אחד שידל במשך כל הריצה של הניסוי ויכול להתמודד עם התהליכים עד למקסימום של 10 עכברים. אם יותר בעלי חיים נדרשים, שני אנשים נדרשים במיוחד עבור אוסף מדגם כירורגית. ואכן כל הדגימות יש לאסוף בתחת 2 שעות, כדי למנוע דליפת מכתשי-נימים פסיביות מוגברת של אלבומין FITC שכותרתו בעכברים שעבר.

הצעד הראשון הוא הכנת ג הבידוד אלביקנס והחדרה תוך-האף להשיג קולוניזציה דרכי הנשימה על ידי ג אלביקנס. מודל 4 ימים-התמדה מתקבל על ידי החדרת intranasal של 5 x 10 5 CFU של ג אלביקנס לכל עכבר (איור 2). במהלך 4 ימים אלה, עכברים במשקל (איור 2 א) והחדרה של 5x10 5 CFU לא לגרום lפציעת ung (איור 2 ג). למרות ג אלביקנס יכול להימשך עד 4 ימים במודל זה, עומס יורד לאחר 48 שעות. לכן, פ דלקת הריאות החריפה -induced aeruginosa היא מעודה ב 48 שעות של ג התמדת אלביקנס.

PAO1 מתח פ aeruginosa הוא זן מעבדה במידה רבה אפיין מרכיב את גורם אלימות הגדול, המערכת של שלוש הפרשת הסוג (T3SS), כב -75% מריאות קליניות מבודדים 15. מסיבות תזות, PAO1 הוא זן רלוונטי במודלים של בעלי חיים של דלקת ריאות חריפה. פציעת ריאות מוערכת באמצעות alveolo קַפִּילָאר-חדירות שנמדדו על ידי דליפת חלבון מהתא של כלי הדם לתוך דרכי הנשימה מתבטאת במדד פציעת ריאות. עליות ריאות פציעה עם הבידוד (איור 3 א). כאן אנו מדווחים קינטיקה של רכיב פגיעת ריאות החריף של המודל שלנו נגרם על ידי מתח PAO1 (5x10 6 CFU / עכבר) (איור 3 ב-3F) לבד בלי לפניג albicans- תחול בתיווך. בהתאם כמובן מתח והשעה של המודל, הבחירה של פ הראשוני הבידוד aeruginosa נדון בסעיף הבא, והוא הציע בטבלה 1.

חמישה עכברים לכל קבוצה היו בשימוש. מדד ריאות פציעה (איור 3), נטל חיידקים בריאה (איור 3 ג), נטל חיידקים בטחול, המשקף הפצת חיידקים (איור 3D), cellularity BAL (איור 3E) וספירת תאי ההפרש (איור 3F) נקבעו כל 12 שעות. פציעת ריאות הייתה מקסימלי בין 24 שעות ו -36 שעות לאחר ההדבקה (איור 3). נטל חיידקים הראה 1-log CFU / ml להקטין כל שעה 24 (איור 3 ג). הפצת חיידקים מצטבר הוערכה על ידי תרבויות homogenate טחול גדלה בכל יום (איור 3D). לבסוף, בעוד cellularity BAL בעכברים נגוע מורכב בעיקר (90%) oמקרופאגים ו מכתשי, בBAL מעכברים נגועים, נויטרופילים גויסו באופן נרחב וספירת תאי ההפרש הראו 90% נויטרופילים ומקרופאגים 10% וימפוציטים (איור 3E, 3F).

איור 1
ציר זמן של איור 1. חריף ריאות הפגיעה הדגם לחקור אינטראקציה בתיווך בין מארח ג אלביקנס ופ aeruginosa.
ייצוג גרפי של ההליך כולו. הצעד הראשון הוא הסתגלות סביבתית של עכברי מתקן הדיור. הצעד השני הוא ג אלביקנס תיווך קולוניזציה בדרכי הנשימה. לבסוף, בשלב השלישי הוא דלקת הריאות החריפה בתיווכו של פ aeruginosa. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.


איור 2. ג אלביקנס דרכי הנשימה התיישבות.
(A, B) עכברים החדירו intranasally עם 10 5 CFU ג אלביקנס (SC5314 מתח). עכברים במשקל במהלך ג קולוניזציה תיווך אלביקנס בדרכי הנשימה (). קולוניזציה של דרכי הנשימה יכולה להיות ממושכת ל3-4 ימים עם רק אחד החדרה ראשונית. במחקר קודם, תחול חסינות מולדת מתרחש בין 24 ו -48 שעות. (N = 5 לכל קבוצה), ברים שגיאה מייצגים אמצעי ± SD. 5 עכברים (C, D) הם החדירו intranasally x 10 5 או 5 x 10 6 CFU של ג אלביקנס. מדד ריאות פציעה (ג) הוערך על ידי חדירות מחסום נימי מכתשי ב 24 שעות. עלייה במשקל (ד ') הביע כאחוז ממשקל ההתחלתי (n = 5 לכל קבוצה).ברים שגיאה מייצגים אמצעי ± SD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. דגם של ריאות חריפות פגיעה הנגרם על ידי aeruginosa P.
() C57Bl / 6J עכברים תוך מאנפף נגועים עם המון גובר של פ aeruginosa (מ -1 x 10 x 6 5 10 7 CFU לכל עכבר) (n = 5 לכל קבוצה), ברים שגיאה מייצגים אמצעי ± SD. עכברים מורדמים בשעה 24. מדד פציעת ריאות מוערך על ידי חדירות מחסום מכתשי-נימים שמגדילות באופן יחסי עם נטל חיידקים. השוואה של מדד פציעת ריאות שהושגה באמצעות שיטה ישנה עם supernatants ריאות homogenates (פסים שחורים) ושילוב-שיטה חדשה באמצעות supernatants שטיפה ברונכואלוואולרית (בר אפורעכברי ים) (BF) נגועים תוך מאנפף עם 5 x10 6 CFU לכל עכבר. עכברים מורדמים כל 12 עד 48 שעות לקינטיקה מודל פציעה האקוטית. פציעת ריאות (ב '), נטל ריאות חיידקית (C), נטל טחול חיידקים (ד'), cellularity שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) (E) וספירת תאי ההפרש BAL (F) גם העריכו. (N = 5) לכל קבוצה, ברים שגיאה מייצגים אמצעי ± SD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. ציוד כירורגי וintranasal החדרה.
()   ציוד כירורגי נדרש לבצע מודל פציעה אקוטי ושטיפה ברונכואלוואולרית. הנה צינורית לקנה נשימה (20המזרקים G) ושני 1 מיליליטר מחוברים לשסתום 3-דרך Luer נעילה. מזרק אחד להזריק מים לריאות, אחד לצייר את נוזל רונכואלוואולרית בחזרה החוצה מהריאות. (B, C)   מיקום של העכבר ביד כדי לבצע את החדרה תוך-האף. בתמונה זו, האגודל מתחת ללסת מבטיח פה סגור במהלך החדרה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. ניתוח ושטיפת סימפונות מכתשי.
החזה נפתח באופן נרחב (), וכלוב צלעות נפתח רוחבי, כדי למנוע פגיעה בלב (B). בעקבות איסוף דם, אזור צוואר הרחם הוא גזור לחשוף את קנה הנשימה (C). חוט דנטלי משמש כתפר ועובר מאחורי קנה הנשימה (C, D). קנה הנשימה אז cannulated עם צינורית G-20 בשילוב (ד) רכובה על המזרק ושסתום 3-דרך. קנה הנשימה צריכה להיות מאובטחת בחוזקה סביב הצינורית על ידי קשירת קשר כירורגית באמצעות התפר במקום מאחורי קנה הנשימה. לבסוף 500 μl של PBS הם החדירו בעדינות את הריאות ולאחר מכן BAL נמשך החוצה בעדינות. ריאות-החדיר נוזלים (E). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

נטל החדיר מינימאלי נטל מקסימאלי החדיר
T3SS- 5 x 10 7 1 x 10 8
T3SS + 5 x 10 6 1 x 10 7
+ + T3SS exoU 5 x 10 1 x 10 5

טבלת 1. פ aeruginosa inocula משמש במודלי זיהום חריפים ריאות.
ריכוזי intranasal אופטימליים הציעו של inocula לגרום לפציעת ריאות חריפה לפי זנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מודלים של בעלי חיים, במיוחד יונקים, שימושיים להבהיר מנגנונים מורכבים של אינטראקציה מארח הפתוגן בתחומי חסינות. כמובן, את הצורך במידע זמין רק ממודלים של בעלי החיים חייבים להיות חיוני; אחרת, שימוש בבעלי החיים חייב להיות מוחלף על ידי מודלים במבחנה. מודל חיה זה ממחיש את תובנה שיכולה להינתן רק על ידי מודל חיה מאז האינטראקציה בין פתוגנים מתווכת על ידי תגובת מארח מרובה רכיבים. עכברים המשמשים כיום ללמוד אינטראקציה מארח הפתוגן זה הם צעירים בגילים 6 עד 10 שבועות עם תגובה חיסונית בוגרת וללא שינוי. כאשר מתמקדים בתגובה החיסונית המולדת, עכברי רקע C57BL6 / J עדיפים. כדי למנוע השפעה של מין ומחזור הורמונלי (בעיקר אסטרוגן) בתגובה החיסונית, זכרים ולכן הבחירה הטובה ביותר. כדי להשיג מובהקות סטטיסטיות, חייבת להיות לפחות 5 קבוצות אנשים בסופו של הניסוי, אך כפי שהוצעו על ידי כל בעלי החיים experimenהנחיות tation, מספר בעלי החיים המשמשים צריכה להיות מופחתת ומעודן למינימום קפדן.

תחבורה ממגדל מתן החיות למתקן המחקר גורמת לחץ בעכברים. התוצאה היא הפרשה מוגברת של ציטוקינים דלקתיים שיכול לשנות ניסויים הבאים כמו שלנו. יתר על כן, סביבה חדשה ו" חבריהם לכלוב "חדשים תורמים ללחץ. כתוצאה מכך, עכברים יש התאקלמו לפחות שבעה ימים לפני ללמוד בסביבת המגורים החדשה שלהם. סביבת דיור זה חייבת להיות מבוקר, אספקת מזון סטנדרטי ומודעות-lib מים, מחזור היום / לילה, ולחות יציבה מתאימה וטמפרטורה.

שני קולוניזציה ריאות ודלקת ריאות מודלים דורשים תרגול ומיומנות. החדרה יכולה להתבצע תוך מאנפפת או תוך-tracheally. האחרון הוא קשה יותר ודורש מומחיות רבה יותר באמצעות אימון בשל סיכון גבוה לדום לב anoxic. ואכן, יחסי הציבורocedure דורש לצנתר בהצלחה עכבר בפחות מ -15 שניות והרדמה עמוקה יותר ולכן נדרשה. הבחירה של החדרה תוך-האף שלנו היא קלה יותר לביצוע, משום שהתוואי של ממשל הוא נגיש, הרדמה קלה הדורשת פחות מסוכנת ולכן יותר לשחזור.

Boutoille et al כבר תאר המודל שלנו חריף פציעת ריאות, במיוחד ההערכה של פגיעת ריאות באמצעות מדידת חדירות מחסום מכתשי-נימים באמצעות אלבומין FITC שכותרתו 16. כדי לצמצם את מספרם של עכברים בכל ניסוי, שיטה זו הותאמה ויחד עם שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL). במחקרים של אל Boutoille et, השתמשנו בהשוואה בין הקרינה של אלבומין FITC שכותרתו בsupernatants homogenate הריאות והדם supernatants 17.

כדי לבצע השוואה זו באופן מלא, רמות המוגלובין ורמות ההמטוקריט נדרשים גם. שיטה זו הותאמה להלw הניתוח במקביל לתגובת מארח ידי הקדשת ריאה אחת להומוגניזציה והערכה של פגיעת ריאות ואחרת לשטיפה ומחקר של תגובת מארח. ואכן, נוזל BAL יכול לשמש כדי להעריך רמות ציטוקינים, הפרשת חלבון וגיוס תא. ההסתגלות שלנו מספקת יותר תוצאות מניסוי בבעלי חיים יחיד, הפחתת העלות ואת המספר הדרוש של עכברים, במיוחד בעת שימוש בעכברי נוק-אאוט 17 כפי שהומלץ בהנחיות ניסויים בבעלי חיים. יתר על כן, חלק מהריאה נשמר ב -80 ° C כדי לבצע חילוץ כולל RNA ותגובת שרשרת של פולימראז כמותיים או ניתוח היסטולוגית. השוואה בין השיטה הקודמת והשיטה החדשה המותאמת בשילוב עם BAL מראה תוצאות דומות (איור 3 א) להעריך מדד פציעת ריאות.

במחקר של Mear et al, באמצעות אותם ההליכים, cytometer זרימת הניתוח בוצעה על תאי BAL מתקבלים על ידי צנטריפוגה של נוזל BAL. דומהnalyses בוצעו על תאי ריאה כולל מהריאות 12. במקרה זה, להערכת פציעת ריאות עם אלבומין FITC שכותרתו לא ניתן לבצע במקביל, בשל חפצים הנגרמים על ידי FITC (אותו ערוץ מאשר חלבון הקרינה ירוק). לכן, אם נדרש cytometry זרימה, ניסויים חייבים להיות מתוכננים בהתאם.

העיתוי של המתת חסד הוא קריטי. במהלך מודל דלקת ריאות החריף על 72 שעות בפעם הראשונות מוצג איור 3. במודל זה, את פסגת פציעת ריאות ותגובת מארח מתרחשת בין 24 ו -36 שעות (איור 3). כך, בעיצוב שלנו נקודת סיום 24 שעות נבחרה כקריאת נתונים ל3 סיבות: ראשית, זה קל לארגן במעבדה, שני, כדי למנוע אובדן של עכברים עקב תמותה בין 24 ו -36 שעות, ולבסוף, בגלל תגובת מארח הייתה מקסימלי בנקודה זו בזמן.

הצעד הראשון של מחקר האינטראקציה שלנו הוא ההתיישבות של דרכי הנשימה עם <em> C. אלביקנס. באמצעות החדרה של 10 5 CFU לכל עכבר, מודל התמדה 4 ימים מתקבל ללא כל פגיעת ריאות. למעשה, עכברים עלו במשקל במהלך שלב זה הזמן. עלייה במשקל הוא אינדיקטור שימושי של היעדר פגיעה בקו אחד עם התישבות בניגוד לזיהום. ואכן, עומס מוגבר ראשוני (מעל 10 6 CFU לכל עכבר) פציעת ריאות מושרה (איור 2 ג) ומארח תגובה מזיקה הרבה מעבר תחול, ובמקרה עכברים ירדו במשקל (איור 2 ד). להיפך, באמצעות קטנה טעינה ראשונית (למשל 10 4 CFU לכל עכבר) לא ניתן היה לקבל מודל התמדה בדרכי נשימה. לכן, כדי להשיג תחול הנצפה של חסינות מארח שתוארה על ידי Mear et al 12, הכיול של הנטל פטרייתי החדיר הוא קריטי להצלחה ולמעקב אחר עקומת המשקל הוא שליטה מרכזית.

אותו הדיוק נדרש לפ aeruginosa ופ aeruginosa מנוקה במהירות מדרך הנשימה על ידי מארח-מענה הולם. באמצעות פ הראשוני גבוה מדי aeruginosa עולה יכולות הגנת מארח או אפילו גורם תגובה הולמת וderleterious וכתוצאה מכך העומס מוביל לפגיעה מסיבית חריפה ומוות מוחק את כל ההבדלים בין קבוצות. הבידוד האופטימלי כדי לגרום לפגיעה חריפה תלוי בנוכחות של מערכת פונקציונלית מסוג 3 הפרשה (T3SS) והייצור של exotoxin U, רעלן translocated ידי T3SS לתוך הציטופלסמה התא המארח. שתי תכונות זן ספציפי אלה צריכים להיחשב בבחירת נטל החיידקים הראשוני. נטל חיידקים ראשוני הציע במאמר זה כדוגמאות לגבול עליון ותחתון כדי לגרום לפציעת ריאות חריפה עם T3SS-שלילי או חיובי מתח, וזני ייצור U exotoxin או לא (טבלה 1). כאשר לומדיםמעורבות של T3SS, מתח צריכה להיות גדל O / N וקם לתחייה עם מדיום LB החדש 3 שעות לפני הכנת הבידוד להשיג פעילות אופטימלית של T3SS.

קביעת נטל חיידקים ופטריות 24 שעות לאחר פ דלקת ריאות -induced aeruginosa דורשת שיקולים ספציפיים שנדונו בסעיף זה. ואכן, כפי שמוצג, כאשר העכברים נגועים בזן 5 x 10 6 CFU T3SS-חיובי, נטל חיידקים בריאות ב 24 שעות רצון ירד לכ 1 יומן (איור 3 ג). דילולים סידוריים של דגימות חייבים להתבצע עד דילול 5-יומן ומצופים על צלחות BCP-אגר. בנוגע לג אלביקנס בריאות, בשעה 72, פטריית הנטל הוא ירד לכ -2 יומן ודגימות חייבים להיות מצופים בYPD-אגר בתוספת אמיקצין כדי להקל על זיהוי מושבה. לבסוף, נחישות של הפצת חיידקים ניתן להעריך על ידי ציפוי של דגימת דם על BCP-אגר 100 μl או על ידי ציפוי של h טחול 100 μlomogenates באותו המדיום. שתי השיטות היו כבר בהשוואה ונראה תרבות טחול להיות מדויקים יותר. ואכן, הטחול הוא איבר ש" מסננים "כל הדם ועלול" להתרכז "ולחסוך בחיידקים שהופצו על הדם. לפיכך, homogenates הטחול משקפת את הפצת חיידקים המערכתית בדלקת ריאות חריפה עם רגישות גבוהה יותר מדם. דגימות דם מייצגות הפצת חיידקים בזמן נתון מאוד ספציפי וייתכן שלא באמת משקפות את התופעה של הפצת חיידקים כולה. לכן תרבויות homogenate טחול עדיפות.

מדד פציעת ריאות הוא הערכה רגישה של פגיעת ריאות כתוצאה מזיהום ו / או תגובת מארח בלתי הולמת ואת ההשפעה של תרופות פוטנציאליות על רכיבים אלה. בנוסף, ביו מודל o זה מאפשר האיסוף של כמה מדגמים שונים כדי ללמוד תגובת מארח. ריאות יכולות לשמש להפקת RNA וניתוחשל שעתוק הגנים. יכולות גם להיות ממוקמות דגימות ריאה לparaformaldehyde (PFA) לתצפיות היסטולוגית נוספות. נוזל BAL יכול לשמש להערכת הפרשת חלבון כגון ציטוקינים דלקתיים. לבסוף, כפי שפורט לעיל בפרוטוקול יכול להיות מותאם כדי לספק דגימות לניתוח cytometry זרימה.

לבסוף, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לmodelize ג האינטראקציה חיידקים albicans- מעורבת בדלקת הריאות הקשורים למכונת הנשמה כמו Staphylococcus aureus 18 או Enterobacteriae. הסתגלות נוספת יכולה להיות קולוניזציה של דרכי הנשימה באמצעות חיידקים במקום ג אלביקנס לmodelize אינטראקציה חיידקים במחלת ריאות מוגלתית כרונית כגון bronchiectasis. לשם כך, יש כדי לשמש עכברי מדוכאי חיסון, כי אישור חיידקים בעכברים המוסמכים חיסוניים אינו מאפשר התישבות בדרכי נשימה מתמשכת.

להחדרה, העמדה של היד האוחזת בעלי החיים היא CRItical. כפי שכבר הדגיש בסעיף הקודם, כאשר תוך הקניית מאנפפת העכבר, המפעיל חייב להבטיח את הפה, כי הוא מושלם נסגר כדי למנוע יריקה של הפתרון. האגודל תומך לסת ושומר על הפה הסגור במהלך הליך החדרה השלם (איור 4). ואז, ביד השנייה, פיפטה מופקדת על נחיר (איור 4C) ופתרון בהדרגה ובעדינות החדיר בלי אוויר כדי למנוע היווצרות בועה. ברור, החדרה חייבת להתבצע בקבינט 2-רמת בטיחות ביולוגית.

איסוף דגימות דורש הכשרה כירורגית קטנה-חיה certifed של המפעיל. בכל שלב, דגימות חייבות להיות ממוקמות על קרח, כדי למנוע תמוגה תא ולשמר חלבונים מdenaturation. מכשירי ניתוח בסיסיים נדרשים (איור 4 א). הם חייבים להיות מעוקרים על ידי מעוקר לפני השימוש. מומלץ ערכות כלי ניתוח שונות לשמש לabdominal וצעדים כירורגית חזה, הימנעות זיהום צולב של דגימות ריאה. השלבים הקריטיים השונים של נתיחה כירורגית מוצגים (5A-5E איור). מיקום של העכבר הוא קריטי; בעלי החיים צריכים להיות משותקים שטוחים על זה בחזרה מול ראש מהמפעיל וישר. אתנול יש להשתמש בנדיבות על הכנה לפני החתך הראשון, כדי למנוע את ההתפשטות של שיער בדגימות וזיהום חיידקים פוטנציאלי מהעור. העור הוא גם כלי דם וחייב להיות חזר בזהירות כדי למנוע (איור 5 א) דימום.

אז בית החזה הוא שכב הבא חתך לרוחב חזה שבמהלכו בית החזה יש לשמור כל הזמן באחיזת פינצטה כדי למנוע פגיעה בלב והריאות בחתך. ריאות ולב חשופים (איור 5). ריאה נגוע מופיעה (איור 5) לבנבן. נתיחה של אזור צוואר הרחם חושפת את קנה הנשימה ותפר הוא מכוניתefully ממוקם מאחורי קנה הנשימה העליונה (איור 5 ג). Cannulating קנה הנשימה חייבת להתבצע בזהירות. אין להשתמש בצינורית גדולה (גודל מרבי הוא 20 G). חתך קדמי קטן של קנה הנשימה קְרוּמִי בין שתי טבעות סחוס מאפשר החדרה של הצינורית. כאשר הצינורית הוא נצפה על ידי שקיפות דרך קנה הנשימה מעל קארינה (איור 5D), התפר קשור בחוזקה סביב קנה הנשימה המאבטחת אותו סביב הצינורית (איור 5E). הצינורית מחוברת לשסתום Luer נעילת זכר 3-בדרך עם 2 מזרקים מחוברים לנקבה היציאות. מזרק אחד מכיל קר כקרח PBS לשטיפה ברונכואלוואולרית; האחרים ריק לצייר אחורי נוזל BAL. יש chaged מזרקים אלה בין קבוצות.

לסיכום, תחול לפני מודל פציעת ריאות חריף הוא מודל רלוונטי ורב עוצמה כדי לחקור באינטראקציות בתיווך מארח vivo בין פתוגנים. השימוש בבעלי החיים הואמגבלה העיקרית ויש לשקול בזהירות נגד המידע הזמין במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevorane, Sevoflurane Abott 05458-02 250 ml plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940 Berthold Technologies reference in first column no comment
Bromo-cresol purple agar Biomerieux 43021 20x per unit
Pentobarbital sodique 5.47% CEVA 6742145 100 ml plastic bottle
2-headed valve  Distrimed 92831 no comment
Sterile inoculation loop 10 µl Dutscher 10175 x1,000 conditioning
Insuline syringes 1 ml Dutscher 30003 per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 ml Dutscher 64300 no comment
Ultrospec 10  General Electric life sciences 80-2116-30 no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm  Gosselin W1773X per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline Life technologies 10010023 packaged in 500 ml
amikacin 1 g Mylan 62516778 per 10 
Heparin 10,000 UI in 2 ml Pan pharma 9128701 10x per unit
RAL 555 coloration kit RAL Diagnostics 361550 3 flacons of 100 mL
1.5 ml microcentrifuge tube Sarstedt 55.526.006 x 1000
Transparent 300 µl 96-well plate Sarstedt 82 1581500 no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth Sigma 95763 in powder
FITC-albumin Sigma A9771 in powder
Luria Bertani Broth Sigma L3022 in powder
25-gauge needle Terumo or unisharp A231 x 100 conditioning
Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 no comment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Casadevall, A., Pirofski, L. -A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1, (1), 17-24 (2003).
  2. Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. (2012).
  3. Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160, (4), 258-266 (2012).
  4. Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296, (5576), 2229-2232 (2002).
  5. Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37, (3), 1164-1166 (2009).
  6. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8, (1), 15-25 (2010).
  7. Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4, (2), 148-157 (2011).
  8. Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. (2013).
  9. Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369, (22), 2126-2136 (2013).
  10. Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8, (5), 340-349 (2010).
  11. Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37, (3), 1062-1067 (2009).
  12. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82, (1), 306-315 (2013).
  13. Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. 1-33 (2009).
  14. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53, (3), 299-302 (2012).
  15. Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406, (6799), 959-964 (2000).
  16. Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35, (4), 263-271 (2009).
  17. Faure, E., Mear, J. -B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189, (7), 799-811 (2014).
  18. Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8, (5), 340-349 (2010).
לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).More

Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter