Summary

微生物群集を学びます<em>インビボ</em>:ホスト間の媒介の相互作用のモデル<em>カンジダ</em>と<em>緑膿菌</em>航空で

Published: January 13, 2016
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Summary

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Abstract

宿主 – 病原体相互作用を研究することは、微生物感染の間に病原性の根底にあるメカニズムを理解することを可能にしています。ホストの予後は、病原体1に対する適応免疫応答の関与に依存します。免疫応答は複雑であり、病原体およびいくつかの免疫または非免疫細胞型2との相互作用の結果である。in vitro試験は、これらの相互作用を特徴付けるおよび細胞-病原体相互作用に焦点を当てることはできません。また、特に化膿性慢性肺疾患を有するか、機械的に換気患者の患者における気道3に 、複数菌のコミュニティが存在しており、宿主-病原体相互作用を複雑にする。 緑膿菌及びカンジダ・アルビカンスは、両方の問題が頻繁に気管支サンプルから単離し、4病原体である、と特に集中治療 5に、重症感染症に関連します。微生物の相互作用が持っていますin vitroでこれらの病原体の間で報告されたが、これらの相互作用の臨床的影響は不明6のままされて。 C。アルビカンスPとの間の相互作用を研究するために、 緑膿菌 、CのマウスモデルP.続いアルビカンス気道の植民地化、 aeruginosa-媒介急性肺感染を行いました。

Introduction

動物モデル、特にマウスは、広範囲の病原体に対する免疫応答を探索するために使用されています。自然免疫と獲得免疫は、げっ歯類およびヒト7との間で異なるが、繁殖の容易かつ多数の遺伝子のためのノックアウトの開発は、免疫応答8を研究するためにマウスに優れたモデルを作ります。免疫応答は複雑であり、病原体の相互作用の結果、常駐微生物叢およびいくつかの免疫(リンパ球、好中球、マクロファージ)および非免疫(上皮細胞、内皮細胞)細胞の種類は2。 インビトロ研究は、観察ができませんこれらの複雑な相互作用は、主にユニークな細胞 – 病原体相互作用に焦点を当てています。動物モデルは、注意して使用し、非常に具体的で関連の質問に限定されなければならないが、マウスモデル 、in vivoでの哺乳類の免疫応答に優れた洞察力を提供し、重要な臨床的な質問7の一部に対処することができます。

<p class=「jove_contentは">気道では、微生物群集は異なる微生物6の多数を関連付ける複雑です。構成するもの "通常の"気道microbiomeが決定されていないものの、居住者のコミュニティは、しばしば複数菌であり、多様な生態系のソースに由来します。化膿性慢性肺疾患(嚢胞性線維症、bronchectasis)の患者や人工呼吸器患者が環境に獲得した微生物9による気道の植民地に特定の植物相を示す。 緑膿菌及びカンジダ・アルビカンスは、両方の問題が頻繁に気管支サンプルから一緒に分離され、5病原体であります、特に集中治療室(ICU)4で、これらの患者における重篤な日和見感染症の責任。

P.に対する抗微生物処理におけるICU結果に急性肺炎の間にこれらの微生物の単離緑膿菌 BUT酵母は通常、このサイト5で病原性とはみなされません。Pとの間の インビトロ相互作用を緑膿菌C.アルビカンスは、広く報告され、これらの微生物が成長し、お互いの生存に影響を与えることができるが、研究は結論付けていないことを示したされている場合はCの存在アルビカンスは、有害なまたはホスト10のために有益です。マウスモデル 、Pのこの関連性に対処するために開発されました緑膿菌C. 生体内で アルビカンスが、微生物間の相互作用が重要なポイントではありませんでした。実際、このモデルはCの関与を評価するために設立されました宿主免疫応答、および結果でアルビカンス

ルーによって確立された以前のモデルは、すでにCで初期定着を使用しましたPによって誘発される急性肺感染が続くアルビカンス 緑膿菌は。彼らのモデルを使用して、著者らは、pの有害な役割を発見しましたrior C.アルビカンスは 11コロニー形成します。しかしルーらは、C 高負荷を使用しました3日間連続2×10 6 CFU /マウスで彼らのモデルでアルビカンス 。我々は、Cの 4日間のモデルを確立しアルビカンスは、このモデルCに、肺損傷せずに植民地化、または少なくとも持続気道アルビカンスは、マウス2B)12,13あたり10 5 CFUの単一点眼後4日までに取得されました。 4日後、炎症細胞補充、炎症性サイトカインの産生も上皮損傷の証拠は観察されませんでした。 48時間、Cのピーク存在で- 24時、細胞およびサイトカイン先天性免疫応答が観察されたにもかかわらず、肺損傷の証拠はアルビカンスなかったです。驚くべきことに、マウスは、このようにCで植民地化前Pの鼻腔内点滴注入にアルビカンス 48時間緑膿菌 、Pを用いたマウスに比べて感染を減弱していました単独の緑膿菌感染症 。私ndeed、マウスが少ない肺損傷を示し、細菌負荷12,13を減少させました

いくつかの仮説は、Cで前植民地のこの有益な効果を説明することができますP上 アルビカンス 緑膿菌は、急性肺感染症を媒介しました。まず、各微生物クオラムセンシングシステム、homoserinelactoneベースのPを含む種間のクロストーク緑膿菌システムとファルネソールベースC.アルビカンスシステムは 、評価しました。第二に、C。肺上皮細胞からの病原体を流用緑膿菌のための「おとり」のターゲットとして機能するアルビカンスを検討しました 。どちらの仮説は(未発表データ)無効化されました。第三の仮説 、Cによって先天性免疫系の「プライミング」のそれでしたP.に対する強化された後続の生得的応答を担うアルビカンス 緑膿菌 。この最後の仮定が確認されました。実際、C。アルビカンスのコロニー形成は、先天性免疫のプライミングthrouにつながりましたGH IL-22は、主に増加した細菌のクリアランスをもたらす、先天性リンパ系細胞によって分泌され、肺損傷12を減少させました。

結論として、ホストは、自然免疫応答を調節し、種々の炎症性細胞型が関与する微生物との間の相互作用の中心的俳優です。これらの複合体の免疫相互作用がインビトロで切開することができるが、最初の仮説は、in vivoモデルで適切によって提供され得ます。以下のプロトコルは、他の微生物に適合させることができる宿主媒介病原体相互作用 in vivo研究の例を提供します。

Protocol

動物実験のための地域の倫理委員会は、地域の治験研究指針における国内および国際的な動物のケアと用途に応じて、この方法を承認しました。 1.サンプルの採取試料保存劣化を避けるために、冷凍保存まで20℃または氷上で – で保存してすぐにすべてのサンプルを収集し。気管支肺胞洗浄液(BAL)の性能を向上させるために、氷上で滅菌リン酸緩衝食塩水…

Representative Results

プロトコル記述中に以前に見られるように、実験は、(:実験のタイムライン図1)を完了するために5日必要があります。一人のオペレータは、実験の全実行中に募集され、最大10匹のマウスの最大のプロセスを処理することができます。多くの動物が必要な場合は、二人は、特に外科用サンプル採取のために必要とされます。実際、すべてのサンプルは、最後のマウスでのFITC標…

Discussion

動物モデル、特に哺乳動物は、免疫の分野における宿主 – 病原体相互作用の複雑なメカニズムを解明するのに有用です。もちろん、唯一の動物モデルから得られる情報の必要性が不可欠である必要があります。そうでなければ、動物の使用 、in vitroモデルに置き換えなければなりません。この動物モデルは、病原体の間の相互作用が多成分宿主応答によって媒介されるので、唯一の?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the “Société de Pathologies Infectieuses de Langue Française” (SPILF).

Materials

Sevorane, Sevoflurane Abott 05458-02 250 mL plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940 Berthold Technologies reference in first column no comment
Bromo-cresol purple agar Biomerieux 43021 x20 per unit
Pentobarbital sodique 5,47% CEVA 6742145 100 mL plastic bottle
2-headed valve  Distrimed 92831 no comment
Sterile inoculation loop 10 µL Dutscher 10175 x1000 conditioning
Insuline syringes 1 mL Dutscher 30003 per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 mL Dutscher 64300 no comment
Ultrospec 10  General Electric life sciences 80-2116-30 no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm  Gosselin W1773X per 100
PBS – Phosphate-Buffered Saline Life technologies 10010023 packaged in 500 mL
amikacin 1g Mylan 62516778 per 10 
Heparin 10 000 UI in 2 mL Pan pharma 9128701 x 10 per unit
RAL 555 coloration kit RAL Diagnostics 361550 3 flacons of 100 mL
1,5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 55.526.006 x  1000
Transparent 300 µL 96-well plate Sarstedt 82 1581500 no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth Sigma 95763 in powder
FITC-albumin Sigma A9771 in powder
Luria Bertani Broth Sigma L3022 in powder
25-gauge needle Terumo or unisharp A231 x100 conditioning
Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 no comment

References

  1. Casadevall, A., Pirofski, L. -. A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).
  2. Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. , (2012).
  3. Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).
  4. Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
  5. Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).
  6. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).
  7. Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).
  8. Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. , (2013).
  9. Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).
  10. Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
  11. Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).
  12. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  13. Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. , 1-33 (2009).
  14. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
  15. Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
  16. Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).
  17. Faure, E., Mear, J. -. B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).
  18. Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).

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Cite This Article
Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).

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