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Immunology and Infection

미생물 커뮤니티를 공부 doi: 10.3791/53218 Published: January 13, 2016

Abstract

호스트 병원체 상호 작용을 공부하는 것은 미생물 감염시 병원성의 기본 메커니즘을 이해하기 위해 우리가 할 수 있습니다. 호스트의 예후는 병원균 1에 대한 적응 면역 반응의 참여에 따라 달라집니다. 면역 반응은 병원체 및 여러 면역 또는 비 면역 세포 유형 2의 상호 작용에서 복잡하고 결과입니다. 시험관 연구는 이러한 상호 작용의 특성과 세포 - 병원균 상호 작용에 초점을 맞출 수 없습니다. 또한, 특히 화농성 만성 폐 질환 또는 기계적 환기 환자에서 환자의기도 3에서는 polymicrobial 커뮤니티 존재 및 호스트 병원균 작용을 복잡. 녹농균칸디다 알비 칸스 모두 문제가 자주 기관지 샘플로부터 단리 4 병원균되고 특히 중환자 5, 심각한 감염과 연관된. 미생물 상호 작용이체외에서 이러한 병원체 사이에보고하지만, 이러한 상호 작용의 임상 적 영향은 6 불분명 남아되었다. C. 알비 칸스과 경찰 사이의 상호 작용을 연구하는 애 루기 노사, C.의 뮤린 모델 P. 다음에 알비 칸스기도의 식민지, aeruginosa- 매개 급성 폐 감염을 행 하였다.

Introduction

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동물 모델, 특히 마우스는 병원체에 대해 광범위 면역 반응을 조사하는 데 사용되어왔다. 타고난 및 획득 면역은 설치류와 인간 (7) 사이에 차이가 있지만, 번식의 용이성과 다양한 유전자 녹아웃의 개발, 면역 반응 (8)을 연구하기 위해 쥐에게 훌륭한 모델을합니다. 면역 반응은 복잡하고 병원균의 상호 작용의 결과, 상주 미생물 식물과 여러 면역 (림프구, 호중구, 대 식세포) 및 비 면역 (상피 세포, 내피 세포) 세포 유형 2. 시험 관내 연구는 관찰 허용하지 않습니다 이러한 복잡한 상호 작용은 주로 독특한 세포 병원체의 상호 작용에 초점을 맞추고있다. 동물 모델 사용할 때는주의 매우 특이적이고 중요한 문제로 제한해야하지만, 마우스 모델은 생체 내에서 포유 동물의 면역 반응에 대한 우수한 통찰력을 제공하고 중요한 임상 문제 (7)의 일부를 해결할 수있다.

(6)의 다수 관련 복잡하다. 무엇 "정상"기도 마이크로 바이 옴을 구성하는 결정 남아 있지만, 주민 커뮤니티 자주 polymicrobial 있으며, 다양한 생태의 원본. 화농성 만성 폐 질환 (낭포 성 섬유증, bronchectasis) 환자 또는 기계적 통풍 환자가 환경 취득 미생물 9 인해기도의 식민지로 특정 식물을 나타낸다. 녹농균칸디다 알비 칸스 모두 문제가 자주 기관지 샘플에서 함께 고립, 5 병원균이다 , 특히 중환자 실 (ICU) 4, 이러한 환자에서 심각한 기회 감염의 책임.

피에 대한 항균 치료에 ICU 결과 급성 폐렴 동안 이들 미생물의 분리 녹농균의 B유타 효모는 일반적으로이 사이트에 5에서 병원성 간주되지 않습니다. (P) 사이의 체외 상호 작용을 녹농균C 알비 널리보고하고 이러한 미생물 성장과 서로의 생존에 영향을 미칠 수 있지만, 연구가 종결 수 없다는 것을 보여 주었다 되었다면 C. 존재 알비 칸스 (Candida albicans)는 호스트 (10)에 대한 악영향이나 유리하다. 마우스 모델은 P.의 관련성을 해결하기 위해 개발 된 녹농균C 생체 내 알비 있지만 미생물 사이의 상호 작용은 핵심 아니었다. 사실,이 모델은 C의 참여를 평가하기 위해 설립되었다 호스트 면역 반응, 그리고 결과에 알비 칸스.

등에 의해 설립 이전 모델은 이미 함께 초기 식민지를 사용 알비 칸스은 P.에 의해 유도 된 급성 폐 감염 다음 녹농균은. 자신의 모델을 사용하여, 저자는 P의 해로운 역할을 발견대한 뛰어난 다 알비 칸스 11 군체. 그러나 루 등은 C.의 높은 부하를 사용 연속 3 일 동안 2 × 106 CFU / 마우스로 자신의 모델에 알비 칸스. 우리는 C.의 -4- 일 모델을 확립 알비 칸스기도 식민지, 또는이 모델 C에서 폐 손상없이 적어도 지속성에 알비 칸스 마우스 (그림 2B) 12, 13105 CFU의 단일 점안 후 사일까지 검색되었습니다. 사일 후 염증 세포의 모집, 염증성 사이토 카인 생성이나 상피 손상의 증거는 관찰되지 않았다. C의 피크의 존재에 48 시간, - (24) 알비 칸은 세포 및 사이토 카인 선천성 면역 반응이 관찰되었다하더라도, 폐 손상의 증거가 없었다. 놀랍게도, 마우스, 따라서 (C)와 식민지 P.의 점안을 비강에 알비 칸스 48 시간 전 녹농균은 피와 쥐에 비해 감염을 감쇠했다 혼자 녹농균 감염. 나는ndeed는, 마우스는 작은 폐 손상을 전시하고 세균 부담 12,13 감소했다.

몇 가지 가설 C.와 이전 식민지의 유익한 효과를 설명 할 수 피에 알비 칸스 녹농균은 급성 폐 감염을 매개 성. 첫째, 각 미생물 정족수 감지 시스템, homoserinelactone 기반 P.를 포함 종간 크로스 토크 (cross-talk) 녹농균 시스템 및 파네 솔 기반 C. 알비 시스템, 평가 하였다. 둘째, C. 폐 상피 세포에서 병원균을 전환 녹농균에 대한 "미끼"대상의 역할 알비 칸스이 연구되었다. 두 가설 (게시되지 않은 데이터) 무효화되었다. 세 번째 가설은 C.에 의한 선천성 면역 시스템의 "마중물"의를했습니다 피에 대한 강화 된 이후 타고난 응답에 대한 책임 알비 칸스 녹농균. 이 가설은 최근 확인되었다. 실제로 C. 알비 칸스의 식민지는 선천성 면역의 프라이밍 throu 주도GH IL-22은 주로 박테리아 증가 클리어런스 결과 선천성 림프계 세포에 의해 분비 폐 손상 (12)를 감소시켰다.

결론적으로, 호스트는 선천성 면역 반응을 조절 및 다른 염증 세포 유형을 포함하는 미생물의 상호 작용에서 중심 배우이다. 이들 복잡한 상호 작용이 시험 관내 면역 해부 될 수있는 반면, 초기 가설은 생체 내 모델에서 적절한 의해 제공 될 수있다. 다음 프로토콜은 다른 미생물에 적응 될 수있다 호스트 매개 병원체의 생체 내 상호 작용 연구의 예를 제공한다.

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Protocol

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동물 실험에 대한 지역 윤리 지역위원회는 임상 연구 지침에 국내 및 국제 동물 보호 및 사용에 따라,이 방법을 승인했다.

1. 샘플 컬렉션

  1. 샘플 저장
    1. 저하를 방지하기 위해 냉동 저장 될 때까지 20 ° C 또는 얼음에 -에 저장 즉시 모든 샘플을 수집하고. 기관지 폐포 세척액 (BAL) 성능을 향상시키기 위해 얼음 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 배치했다.
  2. 외과
    1. 오토 클레이브를 사용하여 모든 수술 장비 소독.
      참고 : 가능하면이 교차 오염을 방지하기 위해 복부 및 흉부 단계는 악기의 두 가지 세트를 사용하는 것이 좋습니다. 필수 해부 장비는도 4a에 자세히 설명되어 있습니다

2. 마우스, 세균과 효모 균주

  1. 다시 동물의 지방의 사용을 준수 하우스 마우스때문에 바이오 안전성 레벨 2 미생물의 사용으로 바이오 안전성 레벨 2 주택 시설, 음식과 물을 적량으로, 케이지 당 5 마우스를 초과하지 않고 통풍이 랙에서 검색위원회 지침 : P. 녹농균C 알비 칸스.
  2. 40 % 글리세롤 배지에서 -80 ° C에 보관 균주.
    1. 10 μL 접종 루프를 사용하여 멸균 루리아 - 베르 타니 국물 3 ㎖를 포함하는 문화 튜브에 냉동 재고에서 직접 박테리아를 추가합니다. 궤도 흔들림 (400 RPM)와 37 ° C 점안 전날에 O / N를 남겨주세요.
    2. 원심 분리하여 수확 박테리아 5 분 2,000 XG에.
    3. 적절한 폐쇄 생물 학적 폐기물 처리에 뜨는을 대기음. 문화 튜브의 바닥에 흰색 부착 된 펠렛을 준수하십시오.
    4. 세척하고 5 ㎖의 PBS를 사용하여 펠렛을 중지.
    5. 반복 두 번째 세척을 수행하는 두 번째 시간을 2.2.3 2.2.2 단계를 반복합니다.
    6. 1 ㎖의 PBS를 사용하여 세균 펠렛을 재현 탁그리고 간단한 텍싱.
    7. 광학 밀도 측정기를 사용하여 600 nm에서 광 농도계를 사용하여 접종 밀도를 결정합니다. 0.9의 밀도 PAO1 대 109 CFU / ㎖에 대응하고, 따라서 희석.
      주 :이 결과는 교정 접종원 연속 희석액의 농도를 결정함으로써, 각 사용 균주에 대해 획득되어야한다.
    8. 시리얼 로그 희석하여 접종을 확인하고 브로 모 크레졸 퍼플 한천 (BCP) 접시와 O / N 문화에 각 희석 100 μl를 접시. 각 마우스에게 ml의 당 1 × 10 8 8 X10 2 CFU (마우스 당 5 × 10 6 7 X10 1 CFU)를 포함하는 용액의 비강 50 μl를 관리합니다.
  3. 사용 C. 기준 변형으로 알비 칸스 SC5314. -80 ℃에서 40 % 글리세롤 배지에서 균주를 보존.
    1. 세균 오염을 방지하고 더 수를 용이하게하기 위해 0.015 %의 아 미카 신으로 효모 - 펩톤 - 덱스 트로 오스 국물을 보충합니다.
    2. & 10을 사용하여 효모 추가# 181; 37 ° C에서 아 미카 신에 O / N 보충 준비 YPD-국물에 L 접종 루프.
    3. 5 분 2,000 XG에서 원심 분리하여 수확 효모.
    4. 적절한 bioharzard 폐기물 처리에 뜨는을 제거합니다. 화이트 부착 펠릿 문화 튜브의 바닥에서 관찰되어야한다.
    5. PBS 세척하고 간단한 텍싱 5 mL를 이용하여 세균 펠렛을 중단하고.
    6. 반복 두 번째 세척을 수행하는 두 번째 시간을 2.2.3 2.2.2 단계를 반복합니다.
    7. PBS 및 간단한 텍싱 1 ㎖를 사용하여 펠릿을 재현 탁.
    8. 40 배 배율에서 표준 현미경을 사용하여 Mallassez의 hematocytometer를 믿고 의해 접종의 크기를 결정합니다.
      주 : (효모의 개수 × 105) / (Mallassez의 hematocytometer를 계산에 그리드 사각형의 수) : 농축 (CFU / ㎖)에 다음 식을 이용하여 얻어진다.
    9. 해당 솔루션에 포함 된 확인 10-510-6 직렬 로그 희석 확인 2 × 10 6 CFU / ㎖.
    10. YPD 한천 플레이트 접시는 0.015 %의 아 미카 신 보충.

C. 3. 항공 식민 알비 칸스

참고 : 환경에 적응 한 후, 마우스는 하루에 두 번 무게가있다.

  1. 흄 후드에서, 4cm X 4cm 가제 (오픈 드롭 기술) (14) 상 세보의 보증금 500 μL.
    1. 즉시 약 750 ml의 유도 챔버의 바닥에 거즈를 놓습니다. 즉시 동물과 거즈 사이의 직접 접촉을 방지하기 위해 거즈 위에 메쉬 제기 플랫폼을 배치합니다.
    2. 밀폐 뚜껑을 닫고 챔버 세보의 확산을 허용하는 1 분 2를 기다립니다.
    3. 플랫폼과 가까운 뚜껑을 메쉬 케이지에서 마우스를 전송합니다. 보존자가 호흡 빛 마취는 30-45 초에 달성해야한다.
    4. 마우스가 f를 제거 할 수있는 점에서 반사를 바로 잡고의 손실을 관찰하여 근력 저하에 대한 모니터링상자와 주입을 ROM.
  2. 비강 내 점적 주입은 (훈련 된 작동에 의해 10 초에서 수행 될 수있다).
    1. 똑바로 세워 그 뒷면 (그림 4B)에 자리 잡고 하나 - 손으로 마우스를 잡고.
    2. 집게 손가락을 사용하여, 헤드를지지하고 유지하는 턱의 손가락을 사용 객담 (도 4C)을 방지하기 위해 폐쇄.
    3. 단계 2.3.8에서 설명 된 바와 같이, 준비된 C. 있도록 알비 칸스 솔루션은 볼륨을 심어 50 μl를위한 ㎖의 당 2 X10 6 CFU가 포함되어 있습니다.
      참고 : 두 번째 중요한 점은 점안 한 볼륨입니다. 보다 낮은 50 μL가 불충분 한 식민지 또는기도의 불 균질 점안을 초래할 수있는 볼륨은 더 큰 볼륨이 익사 / 질식 사망을 야기 할 수 있음.
    4. 콧 구멍에 피펫에 접근하여 내 비강 마우스를 한 방울 씩 떨어 뜨 리다.
    5. 콧 구멍에 용액을 함유하는 버블을 형성하는 50 μL 강하 피펫이어서 spontaneousl 의해 흡입Y 호흡 마우스.
    6. 복구 영역에 넣어 마우스 (예를 들어, 오버 헤드 가열 램프와 대형 잘 탄산 베어 케이지). 마우스는 완전한 각성 할 때까지 모니터링해야합니다. 이 흉골 드러 누움 및 바로 잡고 반사를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 이 시점에서, 마우스는 정상 하우징 케이지로 복귀 할 수있다.

4. P. 녹농균 유도 된 급성 폐 감염

참고 : 마우스는 네 다음 일 동안 무게가있다. 통상, 마우스는 C. 동안 체중 알비 칸스 - 매개기도 식민지 (그림 2A).

  1. P.를 함유하는 현탁액을 제조 aeruginosa의 O / N 증가율 (2.2 절) 후 점안의 날.
  2. (3.1) 전술 한 바와 같이 간단히 마취하는 것은 세보를 흡입하여.
    주 : 급성 폐 감염을 수행하기 위해 제안되는 세균 부담을 권장표 1.
  3. 후 점안 복구에 특히주의와 (3.2) 전술 한 바와 같이 마우스를 한 방울 씩 떨어 뜨 리다.

폐 손상 지수 5. 측정

  1. FITC 표지 된 알부민을 함유하는 용액을 제조 하였다. 동물 안락사 전에이 솔루션 2 시간을 주입한다.
    1. 적절한 장비와 알부민 - FITC 0.2 mg의 무게.
    2. 1 ml의 PBS에 0.​​2 mg을 추가합니다. 간단히 소용돌이. 즉시 사용하지 않을 경우, 주변 광에 대한 노출을 피해야 호일에 솔루션을 배치합니다.
    3. 각 마우스 FITC로 표지 된 알부민 용액을 복강 내 200 μl를 주입한다.
  2. 안락사
    1. 마지막 체중 데이터에 대한 마우스의 무게를.
    2. 5.47 % 펜토 바르 비탈의 300 μL : 펜 토바 비탈의 치명적인 과다 복용 한 복강 내 주사를 사용하여 연구위원회 지침에서 동물의 지역 사용에 따라 하나의 마우스를 안락사.
    3. 케이지에서 마우스를 제거하고 L를 수신운영자가 ethal 주입.
    4. 주입 후, 다른 동물 숨겨진 또 다른 케이지, 혼자 마우스를 전송합니다. 운동의 부재까지 마우스를 관찰합니다. 확인 죽음은 운동, 특히 호흡 운동, 펄스의 부족의 부재입니다.
    5. 따라서 마취제 나 진통제없이, 죽은 동물에 샘플의 수술 모음을 수행합니다.
  3. 외과 샘플 컬렉션 : 흉부 단계.
    참고 : 무균 상태를 유지하기 위해 모든 수술은 바이오 안전성 레벨 2 환경에서 멸균 장비를 사용하여 수행됩니다.
    1. 피부에 에탄올을 적용합니다. 가위로 중간 복부에 흉골에서 중간 선에 피부 절개를 수행합니다. 양쪽에있는 흉곽을 따라 중간 선 째다에서. 흉곽을 시각화하기 위해 흉부의 양쪽에 피부를 다시 접어.
    2. 위해 쇄골을 향해 올라가고 양쪽에있는 흉곽의 수직 절개를 수행하는 것은 선미와 전체 전방 흉벽을 기대 게 할 수음 심장과 폐 (그림 5A, 5B)의 완벽한 시각화를 허용한다.
    3. 심실 동맥 옆에있는 심장을 천공하여 사전 heparined 주사기를 사용하여 혈액을 수집합니다. 플라즈마의 적어도 100 μL를 얻기 500 μL의 최소 철회. 얼음에 혈액 샘플을 놓습니다.
    4. 기관 (그림 5B 및 5C)를 시각화하는 중간 선 자궁 절개를 수행합니다. 조심스럽게 기관 주위의 근막을 해부하다. 기관 (그림 5C 및 5D) 뒤에 봉합을 놓습니다. 그 후 봉합 적절한 세척을 보장하기 위해 cannulating 바늘 주위에 종료됩니다.
    5. 20-G 변성 위관 니들 (도 5d 및 4A)을 사용하여 기관을 카테 테르를 꽂다. 이전에 배치 봉합과 유관 기관 주위에 수술 매듭을 묶어.
    6. 기관지 세척술 (BAL)을 수행하려면, 부드럽게 점진적으로 주입과 폐에서 /에 얼음처럼 차가운 PBS 500 μl를 그립니다. i에서 샘플을 놓고CE는 세포의 용해를 방지 할 수 있습니다.
    7. 단계를 반복 5.3.6, 3 회 2 ㎖의 원심 분리 관 (그림 5E)에 1,500 μL 기관지 폐포 세척액과 풀 세척 샘플의 총을 얻었다.
    8. 가슴에서 폐를 제거합니다. 80 ° C - 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브에 (크기가 하나의 폐 또는 엽의 절반에 해당한다)과에서 빠르게 저장 폐 세그먼트를 배치합니다.
    9. 세균 부담을 결정하고 얼음에 배치하는 PBS를 함유하는 미리 칭량 용혈 튜브 폐 세그먼트를 배치했다.
  4. 외과 샘플 컬렉션 : 복부 단계.
    1. 복부의 왼쪽에 다른 절개를 수행합니다. 복막을 통해 비장을 준수하십시오.
    2. 비장을 제거하고 얼음에 두 번째 용혈 1 ml의 PBS를 포함하는 튜브를 제자리에 놓습니다.
  5. 폐 손상 지수
    주가 : 폐포 - 모세 혈관 막 투과성 측정하여 평가한다 FITC를 표지 알부민 누설을 혈관 구획에서에 폐포 - interstitial 함.
    1. 원심 분리기 혈액 샘플과 1,500 x g에서 10 분 동안 기관지 폐포 세척액. 새로운 원심 분리기 튜브에 상층 액을 수집합니다. 펠렛을 모집 플라즈마 또는 BAL 세포에 해당하고 얼음에 배치해야합니다.
    2. 96 웰 투명 판 (300 μL 우물)에 각각 혈액 뜨는 (플라즈마, 노란색) 또는 BAL 상층 액 100 μl를 추가합니다. 즉시 사용하지 않을 경우 접시에 호일을 놓습니다.
    3. 형광 혈장 농도와 형광 마이크로 플레이트 리더 (; 방출, 520 nm의 여기, 487 나노 미터)를 사용하여 BAL 상등액을 측정한다.
    4. 형광 비 산출함으로써 폐 손상 지수를 결정 [(BAL 상등액 / 혈액 상청액) X 100].
  6. 기관지 폐포 세척액 (BAL) 차동 세포 수.
    참고 : 단계 5.5.1에​​서 기관지 폐포 세척액의 원심 분리에서 얻은 세포 펠렛을 사용합니다.
    1. 필요하다면 적혈구 용해 완충액을 사용한다. CEL을 함유하는 원심 분리 관에 적혈구 용해 완충액 500 μL를 추가L 펠렛. 간단히 소용돌이와 얼음에 10 분을 둡니다. 붉은 세포 용해를 중지 500 μl의 PBS를 추가합니다.
    2. 1,500 X g에서 10 분 동안 원심 분리하여 수확 세포. 상등액을 제거하고 멸균 PBS 1 ㎖로 세포 펠렛을 중지. 세포를 계산하는 Hemacytometer 사용. Mallassez의 hematocytometer를에 세포를 열거합니다. cytospin와 슬라이드에 세포를 집중.
    3. 셀 식별 및 카운트 (대 식세포, 림프구, 호중구)을 허용 착색 키트를 사용하여 세포를 염색.
  7. 폐 세균 부담과 세균 보급
    주 : 폐 세균 및 세균 부담 보급, 폐와 비장을 평가하기 위해 각각 수집하고, PBS (단계 5.3.9) 1 ㎖를 함유하는 미리 칭량 용혈 튜브에 보관 하였다.
    1. 1 ml의 PBS 및 폐 또는 비장를 포함하는 용혈 튜브의 무게. 폐와 비장 균질 균질 물을 얻기 조직 균질기로 균질화 샘플.
    2. 조직 호모 100 μl를 입금시리얼 희석 대수를 구하는 멸균 PBS 900 μl를 함유하는 원심 분리 튜브에 genates.
    3. 피에 대한 BCP 한천 중 하나에있는 두 개의 마지막 적절한 희석 샘플 (10-310-2)를 플레이트 녹농균 또는 C에 대한 한천을 YPD - 아 미카 신 - 보충 알비 칸스 폐와 비장 부담 결정.
    4. 37 ° C에서 접시 O / N을 품어. 다음 날, 접시에 식민지를 열거합니다.
    5. 인덱스 폐 중량 결과는 폐의 그램 당 CFU를 얻었다. 폐 샘플 크기는 결과는 폐의 그램 당 CFU에서 발현되어야하며, 동일하지 않다.
      인덱스에 대한 공식은 다음과 같습니다 [CFU] × [용혈 튜브의 무게와 폐] - [용혈 튜브의 무게].

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Representative Results

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프로토콜 정보 중 미리 알 수있는 바와 같이, 실험 (: 실험 막대도 1)을 완성해야 오일. 하나의 오퍼레이터는 실험의 전체 동작 동안 권유되고 10 마우스의 최대 프로세스를 처리 할 수​​있다. 더 동물이 필요한 경우, 두 사람이 특히 수술 시료 채취를 위해 필요하다. 실제로 모든 샘플은 마지막 마우스에서 FITC 표지 된 알부민의 증가 패시브 폐포 모세 혈관 누출을 방지하기 위해 2 시간에 따라 수집되어야한다.

첫 번째 단계는 C.의 제조이다 알비 칸스 접종 물 및 비강 내 점적은 C. 의한기도 집락을 얻었다 알비 칸스. 4일 지속성 모델 C. 5 × 105 CFU의 비강 내 점적 주입에 의해 얻어진다 마우스 당 알비 칸스 (그림 2B). 이 사일 동안, 마우스는 L를 유도하지 않습니다 5 × 5 CFU 중량 (그림 2A) 및 점안을 얻을웅 부상 (그림 2C). C. 비록 이 모델은 4 일, 부하가 48 시간 후 감소까지 알비 칸스가 지속될 수 있습니다. 따라서, P. 녹농균 유도 된 급성 폐 감염은 C의 48 시간에서 perfomed됩니다 알비 칸스 지속성.

임상 폐의 75 %는 15에서와 같이 분리 녹농균 스트레인 PAO1는 주요 독성 인자 분비 형 3 시스템 (T3SS)를 포함하는 것을 특징으로 주로 실험실 균주이다. 논문 이유로 PAO1 급성 폐 감염의 동물 모델에서 중요한 균주이다. 폐 손상은 폐 손상 지수로 표현기도에 혈관 구획에서 단백질 누출에 의해 측정 alveolo-capillar 투과성을 통해 평가된다. 접종 (그림 3A)와 폐 손상이 증가한다. 여기에서 우리는 전에없이 혼자 PAO1 변형 (5 × 6 CFU / 마우스) (그림 3B-3F)에 의해 유도 된 우리의 모델의 급성 폐 손상 성분의 반응 속도를보고C를 매개 프라이밍을 albicans-. 모델의 변형 및 시간 과정 초기 P.의 선택에 따라 녹농균 접종은 다음 섹션에서 설명 표 1에 제시되어있다.

그룹당 다섯 생쥐를 사용 하였다. 폐 손상 지수 (도 3b),(도 3c) 세균성 보급 (도 3D), BAL의 세포 수 (도 3e) 및 차등 세포 수 (도 3f)을 반영 비장, 세균 부담 세균 부담은 매 12 결정 하였다 시간. 폐 손상은 24 시간, 36 시간 감염 후 (그림 3B) 사이에 최대였다. 세균 부담이 보여 1 로그인마다 24 시간 (그림 3C)를 감소 ㎖ / CFU를. 비장의 균질 문화에 의해 평가 누적 세균 보급 매일 (그림 3D)를 증가했다. 마지막으로, 감염되지 않은 마우스의 BAL에서 세포 수는 주로 (90 %)로 구성되어 있지만 O감염된 마우스의 BAL에서 F 폐포 대 식세포, 호중구 널리 채용하고 차등 세포 수는 호중구 90 %와 10 %의 림프구 및 대 식세포 (도 3E, 3F)을 보였다.

그림 1
급성 폐 손상 모델의 그림 1. 타임 라인 C. 사이의 호스트 매개 상호 작용을 탐구 알비 칸스 P. 녹농균.
전체 절차의 그래픽 표현입니다. 첫 번째 단계는 주택 설비 마우스의 환경 적응이다. 두 번째 단계 인 C. 알비 칸스는기도 식민지를 매개. 마지막 세 번째 단계는 P.에 의해 매개되는 급성 폐 감염은 녹농균은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 2. C. 알비 칸스기도 식민지.
(A, B) 마우스를 비내 105 CFU로 주입된다 C. 알비 칸스 (변형 SC5314). 마우스는 C. 중 체중 증가 알비 칸스 - 매개기도 식민지 (A). 기도의 집락 하나만 초기 점안 3-4 일 동안 연장 될 수있다. 이전 연구에서 선천성 면역의 프라이밍 24과 48 시간 사이에 발생한다. (N = 5 그룹 당), 오차 막대는 ± 표준 편차 수단을 나타냅니다. C.의 (C, D) 마우스를 비내 점적되어 5 × 105 또는 5 × 106 CFU 알비 칸스. 24 시간에서 폐포 모세 혈관 장벽 투과성 의해 평가 폐 손상 지수 (C). 체중 증가 (D)는 초기 체중의 퍼센트 (N = 5 그룹 당)를 표명했다.오류 바 SD ± 수단을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
급성 폐 손상의 그림 3. 모델 P의 녹농균에 의해 유도.
(A) C57BL / 6J 마우스에 비강 내-P. 부하의 증가에 감염된 녹농균 (마우스 당 1 × 6 7 × 10 5 CFU에서)는 (N = 5 그룹 당)는, 오차 막대는 ± 표준 편차 수단을 나타냅니다. 마우스는 24 시간에서 안락사된다. 폐 손상 지수 세균 부담이 비례하여 증가 폐포 모세 혈관 장벽 투과성에 의해 평가된다. 폐 손상 지수의 비교 (기관지 세척 상층 액을 사용하여 폐 균질 상층 액 (검은 막대)와 새로운 복합 방법 회색 막대를 이전 방법을 사용하여 획득S) (BF) 마우스 비강 내 마우스 당 5 X10 6 CFU로 감염된다. 마우스는 급성 손상 모델의 역학에 대한 모든 12-48 시간을 안락사된다. 폐 손상 (B), 폐 세균 부담 (C), 비장 세균 부담 (D), 기관지 폐포 세척액 (BAL) 세포 수 (E) 및 BAL 차등 세포 수 (F)도 평가된다. (N = 5) 그룹 당, 오차 막대는 ± 표준 편차 수단을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 수술 장비 및 비강 점적.
(A)   수술 장비 급성 손상 모델 및 기관지 폐포를 수행하는 데 필요한. 여기에 기관 캐뉼라 (20G) 및 두 1ml를 주사기 루어 락 3 방 밸브에 연결된다. 한 주사기는 폐에서 밖으로 다시 기관지 유체를 그릴, 폐에 하나를 물을 주입한다. (B, C)   손에서 마우스의 위치는 내 코 점안을 수행 할 수 있습니다. 이 사진에서 턱 아래에 엄지 손가락 점안 동안 닫힌 입을 보장합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. 수술 및 기관지 세척액.
가슴 널리 (A) 개방되고, 갈비뼈는 심장 (B)에 손상을 방지하기 위해 옆으로 열립니다. 채혈 후, 경추 영역은 기관 (C)을 노출시키기 위해 해부된다. 치실은로 사용된다봉합사와는 기관 (C, D) 뒤에 전달됩니다. 기관이어서 주사기 및 3- 웨이 밸브에 장착 (D) 합성 20-G 캐 뉼러로 캐 뉼러를 꽂는다. 기관은 단단히 기관 뒤에 자리에 봉합사를 이용하여 수술 매듭을 묶는하여 정맥 주위를 확보해야한다. 마지막으로 PBS 500 μL 부드럽게 폐에 주입 된 후 BAL 부드럽게 인출. (E) 유체 주입 폐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

최소 점안 부담 최대한 점안 부담
T3SS- 5 × 7 1 × 8
T3SS + 5 × 10 (6) 1 × 10 (7)
T3SS + exoU의 + 5 × 10 1 × 10 5

표 1. P. 급성 폐 감염 모델에서 사용 aeruginosa의 접종.
접종의 권장 최적의 비강 내 농도는 균주에 따라 급성 폐 손상을 유발합니다.

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Discussion

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동물 모델, 특히 포유 동물은 면역의 분야에서 호스트 병원체 상호 작용의 복잡한 메커니즘을 규명하는데 유용하다. 물론, 단지 필수적이어야 동물 모델에서 얻을 수있는 정보의 필요성; 그렇지 않으면, 동물의 사용은 체외 모델로 교체해야합니다. 이러한 동물 모델은 병원체 간의 상호 작용이 다 성분 호스트 응답에 의해 매개되기 때문에 단지 동물 모델에 의해 제공 될 수있는 통찰력을 나타낸다. 현재이 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는 데 사용 마우스는 성숙하고 변경되지 않은 면역 반응과 6~10주 세 젊은 성인입니다. 선천성 면역 반응에 집중하면, C57BL6 / J 마우스 배경이 바람직하다. 섹스와 면역 반응에 호르몬주기 (특히 에스트로겐)의 영향을 방지하기 위해, 남성은 따라서 최선의 선택입니다. 통계적 유의성을 달성하기 위해, 그룹이 실험의 끝에서 적어도 5 개인이 있지만, 모든 동물 experimen 의해 제안해야테이션 가이드가 사용 동물의 수는 엄격한 최소한으로 감소하고 정제한다.

연구 시설에 동물을 제공 개종에서 전송 쥐에 스트레스를 유도한다. 결과들은 우리로 후속 실험을 변경할 수 염증성 사이토 카인의 분비를 증가이다. 또한, 새로운 환경과 새로운 "케이지 동료는"스트레스에 기여한다. 따라서, 마우스는 새로운 주거 환경에서 공부하기 전에 적어도 7 일 동안 적응해야합니다. 이 하우징 환경은 표준 음식과 물 즉흥적, 주 / 야 사이클, 적절한 안정 습도와 온도를 제공하도록 제어 될 수있다.

모두 폐 식민지 폐 감염 모델은 연습과 손재주를 필요로한다. 점적은 비강 내 또는 인트라 tracheally 수행 될 수있다. 후자는 더 어렵 인해 무산소 심장 마비의 위험이 높은 훈련을 통해 더 많은 전문 지식이 필요합니다. 실제로, 홍보ocedure 성공적 미만 15 초 따라서 필요한 깊은 마취에 마우스를 삽관해야합니다. 투여 경로는 덜 위험이 필요한 가벼운 마취 액세스 할 수 있으며, 따라서 더 재현하기 때문에 내 코 점안 우리의 선택은 수행하기가 쉽습니다.

Boutoille 등은 이미 FITC 표지 된 알부민 (16)를 이용하여 폐포 모세 혈관 장벽 투과성 측정을 통해 급성 폐 손상 모델, 폐 손상, 특히 평가를 설명. 실험 당 마우스의 수를 줄이기 위해,이 방법은 적응 및 기관지 폐포 세척액 (BAL)에 결합시켰다. Boutoille 동부 등의 연구에서는 폐 파쇄 액 상등액에서 FITC 표지 된 알부민의 형광 및 혈액 상청액 (17) 사이의 비교를 사용했다.

완전히 이러한 비교를 수행하기 위해, 헤모글로빈 수치 및 적혈구 용적율 수준은 또한 요구된다. 이 방법은 동종하도록했다균질화 및 폐 손상의 평가 및 세척 및 호스트 응답의 연구에 다른 하나의 폐를 전용하여 호스트 응답의 병용 분석 승. 실제로, BAL 유체는 사이토 카인 수준, 단백질 분비 및 세포 모집을 평가하는데 사용될 수있다. 우리의 적응은 동물 실험 지침에서 권고 넉 - 아웃 마우스 (17)를 사용하여 특히, 비용 및 마우스의 필요 매수를 줄이는 하나의 동물 실험에서 결과를 더 제공한다. 또한, 폐의 부분은 총 RNA의 추출 및 정량 중합 효소 연쇄 반응 또는 조직 학적 분석을 위해 -80 ℃에서 유지된다. 이전 방법과 BAL과 함께 새로운 적응 방법의 비교는 비교 결과 (그림 3A)가 폐 손상 지수를 평가하는 방법을 보여줍니다.

동일한 절차를 사용 Mear 등의 연구에서, 분석은 유동 세포 계측기 BAL 유체를 원심 분리에 의해 얻어진 BAL 세포에서 수행 하였다. 유사nalyses는 폐 (12)으로부터 총 폐 세포에서 수행 하였다. 이 경우, FITC 표지 된 알부민과 폐 손상 평가 인해 FITC (녹색 형광 단백질보다 동일한 채널)에 의해 유도 된 인공물에, 병용 수행 될 수 없다. 유동 세포 계측법이 요구되는 경우, 따라서, 따라서 실험 계획되어야한다.

안락사의 타이밍이 중요하다. 처음 72 시간 동안 급성 폐 감염 모델의 시간 과정은 그림 3을 표시됩니다.이 모델에서 폐 손상 및 호스트 응답의 절정 (3도) 시간 24 사이 (36) 발생합니다. 따라서, 우리의 디자인에서 24 시간 종점 3 이유로 판독으로 선택되었다 : 첫째, 그것은 제 의한 마지막 24, 36 시간, 사이 사망률 마우스의 손실을 피하기 위해 실험실에서 정리하기 쉬운, 호스트 응답이 시점에서 최대 이었으므로.

우리의 상호 작용 연구의 첫 번째 단계는 함께기도의 식민지입니다 <EM> C. 알비 칸스. 마우스 당 105 CFU의 점안을 사용하여 4 일 지속성 모델은 폐 손상없이 얻어진다. 사실,이 마우스는 위상의 시간 경과에 걸쳐 체중을 얻었다. 감염 반대로 체중 증가 집락 맞춰 부상의 부재 유용한 지표이다. 사실, 증가 된 초기로드 (마우스 당 6 10 CFU)에 의한 폐 손상 (그림 2C)와 케이스 마우스 무게를 분실하는 지금까지 프라이밍 넘어 해로운 호스트 응답 (그림 2D). 반대로, 더 작은 초기 하중 (예를 들면, 마우스 당 104 CFU)기도 영속성 모델을 얻을 수 없었다를 사용. 따라서 Mear (12)에 의해 설명 된 숙주 면역 관측 프라이밍을 수득 얻은 진균 짐을 교정 성공에 매우 중요하고 중량 곡선을 모니터링하는 키 제어이다.

같은 정밀도 (P)가 필요합니다 녹농균 피를 유도하지 않습니다 aeruginosa에 신속하게 적절한 호스트 응답하여기도에서 지워집니다. 지나치게 높은 초기 P. 사용 녹농균은 숙주 방어의 능력을 능가 또는 부하의 결과로 부적절하고 derleterious 응답을 유도 그룹 사이의 모든 차이를 삭제 대규모 심각한 부상 및 사망에 이르게. 급성 손상을 유도하는 최적 접종 관능 형 -3- 분비 시스템 (T3SS) 및 외독소 U, 숙주 세포의 세포질에 의해 T3SS 전좌 독소 생산의 존재에 의존한다. 이 두 균주 관련 특성은 초기 세균 부담의 선택에서 고려되어야한다. 상한과 하한의 예는 T3SS 음성 또는 양성 균주 및 균주 외독소 U 생산 여부 (표 1) 급성 폐 손상을 유도하기로 초기 세균 부담이 문서에서 제안된다. 공부를 할 때T3SS의 참여, 변형 O / N을 성장 접종의 준비가 T3SS의 최적 활동을 얻기 전에 새로운 LB 배지 3 시간으로 부활되어야한다.

P. 후 세균 및 곰팡이 부담 24 시간의 결정 녹농균 유도 된 폐 감염은이 섹션에서 논의 할 사항이 필요합니다. 같이 실제로, 마우스가 24 시간 마음대로 폐에 5 × 106 CFU T3SS 양성 변형, 세균 부담에 감염되는 경우는 약 1 로그 (그림 3C)로 감소. 샘플의 일련 희석 5 로그 희석까지 수행 BCP 한천 플레이트에 도금해야합니다. C.에 관하여알비는 72 시간에, 진균 부담이 약 2 로그 감소 및 샘플 콜로니 식별을 용이하게하기 위해 아 미카 신으로 보충 YPD 한천에 도금 될한다. 끝으로, 세균 보급 판정 BCP 한천에 혈액 샘플을 100 μL를 도금 또는 비장 (H)의 100 μl를 도금함으로써 평가할 수있다같은 매체에 omogenates. 두 가지 방법이 이미 비교 비장 문화는 더 정확한 것 같다되어 있었다. 실제로, 비장은 "필터"전체 혈액과 "집중"과 박테리아를 보존 할 수는 혈액에 전파 갖는 기관이다. 따라서, 비장 균질 혈액보다 더 높은 감도와 급성 폐 감염시 전신 세균의 확산을 반영한다. 혈액 샘플은 매우 구체적인 주어진 시간에 박테리아 보급을 표현하고 진정으로 전체 박테리아 확산의 현상을 반영하지 않을 수 있습니다. 따라서 비장 균질 배양이 바람직하다.

폐 손상 지수는 감염 및 / 또는 부적절한 호스트 응답 및 이들 구성 요소에 대한 잠재적 치료제의 효과로 인한 폐 손상의 평가 민감하다. 또한,이에 VIV O 모델은 호스트 응답을 연구하는 여러 가지 샘플의 수집을 허용한다. 폐는 RNA 추출 및 분석을 위해 사용될 수있다유전자 전사의. 폐의 샘플은 추가로 조직 학적 관찰에 파라 포름 알데히드 (PFA)로 배치 될 수있다. BAL 유체는 염증성 사이토 카인의 분비 단백질의 평가를 위해 사용될 수있다. 마지막으로, 프로토콜 전술 한 바와 같이 유동 세포 계측법 분석을위한 샘플을 제공하도록 구성 될 수있다.

마지막으로,이 프로토콜은 C. modelize을하도록 구성 될 수있다 이러한 황색 포도상 구균 18 Enterobacteriae로 인공 호흡기 관련 폐렴에 참여 albicans- 미생물의 상호 작용. 또 다른 적응 박테리아를 사용하는 대신 C.기도의 식민지가 될 수 알비 칸스은 기관지 확장증 등 만성 화농성 폐 질환의 세균의 상호 작용을 modelize합니다. 면역 능력 마우스에 세균 여유가 지속적인기도 식민지를 허용하지 않기 때문에이를 위해, 면역 마우스는 사용할 수 있습니다.

점안 들어, 동물을 손으로 잡고의 위치이다 CRI광 케이블 (optical). 이미 이전 섹션에서 밑줄 내 비강 마우스를 주입 할 때, 운전자는 그 입이 완벽한 솔루션의 객담을 방지하기 위해 닫혀 있는지 확인해야합니다. 엄지 손가락은 전체 점안 절차 (그림 4B) 동안 폐쇄 입을 턱을 지원하고 유지합니다. 그 후, 다른 손으로, 피펫은 점진적 부드럽게 기포 형성을 방지하기 위해 공기를 주입하지 않고 비공 (도 4C) 및 용액 상에 증착된다. 물론, 점안은 레벨 2 - 바이오 안전성 캐비닛에 수행해야합니다.

샘플의 컬렉션은 운영자의 certifed 작은 동물 수술 훈련을 필요로한다. 각 단계에서, 샘플은 세포 용해를 방지로부터 변성 단백질을 보존하는 얼음에 배치되어야한다. 기본 수술 도구 (그림 4A)를해야합니다. 그들은 사용하기 전에 오토 클레이브 멸균 수로해야합니다. 그것은 다른 수술기구 세트 abdomina에 사용하는 것이 좋습니다L과 폐 샘플의 교차 오염을 방지 흉부 외과 단계. 수술 절개의 다른 중요한 단계는 (그림 5A-5E를) 제공됩니다. 마우스의 위치는 중요하다; 이 연산자와 직선에서 머리 반대가 돌아왔다에 동물 평면 고정되어야한다. 에탄올은 자유롭게 피부에서 샘플에서 머리의 확산 및 잠재적 인 세균 오염을 방지하기 위해 최초의 절개하기 전에 준비에 사용되어야한다. 피부는 물론 혈관과 출혈 (그림 5A)를 방지하기 위해주의 깊게 철회해야합니다.

그리고 흉곽은 흉곽이 지속적으로 절개하는 동안 심장과 폐에 손상을 방지하기 위해 핀셋 그립에서 유지되어야하는 동안 측면 가슴 절개 다음 경사된다. 폐와 심장 (그림 5B)에 노출되어 있습니다. 감염되지 않은 폐 희끄무레 (그림 5B)를 나타납니다. 자궁 경부 영역의 해부는기도를 노출하고 봉합 자동차입니다efully 상부 기관 (그림 5C) 뒤에 위치. 기관을 Cannulating하는주의 수행해야합니다. 대형 캐 뉼러를 사용하지 마십시오 (최대 크기는 20 G)입니다. 두 연골 고리 사이의 막질 기관의 작은 전방 절개 캐 뉼러를 삽입 할 수 있습니다. 캐 뉼러는 용골 (도 5d)을 통해 상기 투명 기관에 의해 관찰 될 때, 봉합 단단히 뉼러 (도 5E) 주위를 확보 기관 주위 묶여있다. 캐 뉼러는 암형 포트에 연결된 주사기 (2)와 3 방향 남성 루어 잠금 밸브에 연결된다. 한 주사기는 얼음처럼 차가운 PBS 기관지 세척을위한 포함, 다른 하나는 기관지 폐포 세척액을 다시 그릴 비어 있습니다. 이 주사기는 그룹간에 chaged해야합니다.

결론적으로, 급성 폐 손상 모델에 앞서 프라이밍 병원체 사이의 생체 호스트 매개 상호 작용을 탐구 할 수있는 적절하고 강력한 모델이다. 동물은 사용주요 제한 및주의 깊게 체외에서 얻을 수있는 정보를 비교 검토해야한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevorane, Sevoflurane Abott 05458-02 250 ml plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940 Berthold Technologies reference in first column no comment
Bromo-cresol purple agar Biomerieux 43021 20x per unit
Pentobarbital sodique 5.47% CEVA 6742145 100 ml plastic bottle
2-headed valve  Distrimed 92831 no comment
Sterile inoculation loop 10 µl Dutscher 10175 x1,000 conditioning
Insuline syringes 1 ml Dutscher 30003 per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 ml Dutscher 64300 no comment
Ultrospec 10  General Electric life sciences 80-2116-30 no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm  Gosselin W1773X per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline Life technologies 10010023 packaged in 500 ml
amikacin 1 g Mylan 62516778 per 10 
Heparin 10,000 UI in 2 ml Pan pharma 9128701 10x per unit
RAL 555 coloration kit RAL Diagnostics 361550 3 flacons of 100 mL
1.5 ml microcentrifuge tube Sarstedt 55.526.006 x 1000
Transparent 300 µl 96-well plate Sarstedt 82 1581500 no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth Sigma 95763 in powder
FITC-albumin Sigma A9771 in powder
Luria Bertani Broth Sigma L3022 in powder
25-gauge needle Terumo or unisharp A231 x 100 conditioning
Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 no comment

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References

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미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에
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Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).More

Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).

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