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Immunology and Infection

Estudar comunidades microbianas doi: 10.3791/53218 Published: January 13, 2016

Abstract

Estudar interação patógeno-hospedeiro nos permite compreender os mecanismos subjacentes da patogenicidade durante a infecção microbiana. O prognóstico do hospedeiro depende do envolvimento de uma resposta imune contra o patógeno adaptado 1. A resposta imune é complexo e os resultados a partir da interação dos agentes patogénicos e vários tipos celulares imunes ou não imunes 2. Os estudos in vitro não pode caracterizar essas interações e foco em interações celulares-patógeno. Além disso, nas vias aéreas 3, particularmente em doentes com doença pulmonar crônica supurativa ou em pacientes sob ventilação mecânica, comunidades polimicrobianas estão presentes e complicar interação patógeno-hospedeiro. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans são tanto problema patógenos 4, freqüentemente isolado de amostras traqueobrônquicas, e associado a infecções graves, especialmente na unidade de cuidados intensivos 5. Interações microbianas temfoi relatado entre esses patógenos in vitro, mas o impacto clínico destas interações ainda não está claro 6. Para estudar as interações entre C. Albicans e P. aeruginosa, um modelo de murino de C. colonização albicans vias aéreas, seguido de um p infecção pulmonar aguda mediada aeruginosa- foi realizada.

Introduction

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Os modelos animais, especialmente ratinhos, têm sido extensivamente utilizados para explorar as respostas imunitárias contra os agentes patogénicos. Embora a imunidade inata e adquirida diferem entre roedores e humanos 7, a facilidade na criação e no desenvolvimento de nocautes para numerosos genes, fazer camundongos um excelente modelo para estudar as respostas imunes 8. A resposta imune é complexo e resulta da interacção de um agente patogénico, da flora residente microbianas e vários imune (linfócitos, neutrófilos, macrófagos) e não-imune (células epiteliais, células endoteliais) tipos celulares 2. Os estudos in vitro não permitem observar essas interações complexas e centrar-se principalmente nas interações célula-patógeno únicas. Enquanto modelos animais deve ser utilizado com precaução e limitada a questões muito específicas e relevantes, modelos de ratos proporcionam uma boa perspectiva sobre a resposta imune mamífero in vivo e pode dirigir peças de questões clínicas importantes 7.

6. Enquanto que constitui um microbiome "normal" via aérea continua a ser determinado, comunidades residentes são frequentemente polimicrobiana, e originam a partir de diversas fontes ecológicos. Os pacientes com doença crônica supurativa pulmonar (fibrose cística, bronchectasis) ou pacientes sob ventilação mecânica apresentam uma flora especial devido à colonização das vias aéreas por microrganismos ambientalmente adquiridos 9. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans são ambos problema patógenos 5, freqüentemente isolado em conjunto a partir de amostras traqueobrônquicos , e responsável de infecção oportunista grave nesses pacientes, especialmente na unidade de terapia intensiva (UTI) 4.

O isolamento desses microrganismos durante pneumonia aguda em resultados de UTI no tratamento anti-microbiano contra P. b aeruginosaut levedura geralmente não são considerados patogênicos neste local 5. in vitro interações entre P. aeruginosa e C. albicans têm sido amplamente relatado e mostraram que esses microrganismos podem afectar o crescimento e a sobrevivência de outro, mas estudos não foi possível concluir se a presença de C. albicans é prejudicial ou benéfica para o hospedeiro 10. Mouse modelos foram desenvolvidos para abordar esta relevância do P. aeruginosa e C. albicans in vivo, mas a interação entre microrganismos não foi o ponto-chave. De facto, o modelo foi estabelecido para avaliar o envolvimento da C. albicans na resposta imune do hospedeiro, e resultado.

Um modelo anterior estabelecida por Roux et ai já utilizada uma colonização inicial com C. albicans seguido de uma infecção pulmonar aguda induzida por P. aeruginosa. Usando seu modelo, os autores encontraram um papel deletério da prior C. albicans colonização 11. No entanto Roux et al utilizaram uma carga elevada de C. albicans em seu modelo com 2 x 10 6 CFU / rato durante 3 dias consecutivos. Nós estabelecemos um modelo de 4 dias de C. colonização das vias aéreas albicans, ou pelo menos persistência sem lesão pulmonar, Neste modelo C. albicans foi recuperado até 4 dias após uma única instilação de 10 5 CFU por ratinho (Figura 2B) 12,13. Após 4 dias, não se observou qualquer evidência de recrutamento de células inflamatórias, a produção de citoquinas inflamatórias, nem dano epitelial. Em 24-48 horas, na presença de pico de C. albicans, apesar de uma resposta imune inata celular e de citoquina foi observada, não houve evidência de lesão pulmonar. Surpreendentemente, os murganhos assim colonizada com C. albicans 48 horas antes da instilação intranasal de P. aeruginosa tinham infecção atenuada em comparação com ratinhos com P. aeruginosa infecção sozinho. Euom efeito, os ratinhos exibiram menor lesão pulmonar e diminuição da carga bacteriana 12,13.

Várias hipóteses poderiam explicar o efeito benéfico da colonização prévia com C. albicans em P. aeruginosa mediada por infecção pulmonar aguda. Primeiro, um cross-talk entre espécies envolvendo cada microorganismos sistemas de sensoriamento quorum, o P. baseada homoserinelactone sistema aeruginosa e C.-base de farnesol sistema albicans, foram avaliados. Em segundo lugar, C. foi estudada albicans agindo como um alvo "chamariz" para P. aeruginosa desviar o agente patogénico a partir de células epiteliais do pulmão. Ambas as hipóteses foram invalidados (dados não publicados). A terceira hipótese era a de um "priming" do sistema imune inato por C. albicans responsável por uma resposta inata subsequente reforçada contra P. aeruginosa. Esta última hipótese foi confirmada. Na verdade C. colonização albicans levou a uma iniciação da imunidade inata atraGH IL-22, segregada principalmente pelas células linfóides inatos, resultando num aumento da depuração bacteriana e reduziu a lesão pulmonar 12.

Em conclusão, o anfitrião é um ator central na interação entre microrganismos modulação da resposta imune inata e que envolvam diferentes tipos de células inflamatórias. Embora estas interacções imunes complexas podem ser dissecados in vitro as hipóteses iniciais só pode ser fornecida por adequado em modelos in vivo. O protocolo seguinte fornece um exemplo de estudo in vivo de interacção hospedeiro-patogénio mediada que pode ser adaptado a outros microrganismos.

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Protocol

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A ética regionais comitê regional de experimentos com animais aprovou este método, de acordo com atenção nacional e internacional de animais e uso de diretrizes de pesquisa experimentais.

Coleção 1. Amostra

  1. Armazenamento das amostras
    1. Colher todas as amostras e imediatamente armazenar a - 20 ° C ou em gelo até o armazenamento do congelador para evitar a deterioração. Coloque fosfato estéril tamponado salino (PBS) em gelo para melhorar lavagens bronco-alveolar desempenho (BAL).
  2. Cirurgia
    1. Esterilizar todos os equipamentos cirúrgico usando um autoclave.
      NOTA: Se possível, recomenda-se usar dois diferentes conjuntos de instrumentos para as etapas abdominal e torácica para evitar a contaminação cruzada. Equipamento de dissecção necessárias é detalhado na Figura 4A

2. Mice, bacterianas e de levedura Estirpes

  1. Os ratos domésticos em conformidade com a utilização de animais em locais reDirectrizes do comitê de pesquisa em um rack ventilado sem exceder 5 ratos por gaiola, com comida e água ad lib, em uma instalação de alojamento nível de biossegurança 2 devido ao uso de Nível de Biossegurança 2 microrganismos: P. aeruginosa e C. albicans.
  2. Manter as estirpes bacterianas a -80 ° C em 40% de meio de glicerol.
    1. Adicionar bactérias diretamente do estoque congelado em tubo de cultura contendo 3 ml de caldo de Luria estéril-Bertani usando um loop de inoculação de 10 ul. Deixar O / N a 37 ° C com agitação orbital (400 rpm) no dia antes da instilação.
    2. Colheita bactérias por centrifugação a 2000 xg durante 5 min.
    3. Aspirar o sobrenadante para uma eliminação de resíduos perigosos fechado apropriado. Observar aderente sedimento branco no fundo do tubo de cultura.
    4. Lavar e suspender o sedimento utilizando 5 ml de PBS.
    5. Repita os passos 2.2.2 a 2.2.3 uma segunda vez para efectuar uma segunda lavagem.
    6. Ressuspender as bactérias sedimentadas utilizando 1 mL de PBSe breve vórtice.
    7. Determinar a densidade de inoculo usando densitómetro óptica a 600 nm utilizando um medidor de densidade óptica. Uma densidade de 0,9 corresponde a 10 9 CFU / ml para PAO1, dilui-se em conformidade.
      NOTA: Este resultado tem que ser obtida para cada estirpe utilizada por determinação da densidade de diluições sucessivas de um inoculo calibrado.
    8. Verifique se o inóculo por diluições logarítmicas em série e placa 100 ul de cada diluição em agar roxo bromocresol (BCP) placas e cultura O / N. Administrar cada ratinho por via intranasal a 50 ul de solução contendo 1 x 10 8 para 2 x10 8 CFU por ml (5 x 10 6 para 1 x 10 7 CFU por ratinho).
  3. Use C. albicans SC5314 como uma estirpe de referência. Conserve a estirpe em 40% de meio de glicerol a -80 ° C.
    1. Suplemento caldo de levedura-peptona-Dextrose com 0,015% de amicacina para evitar a contaminação bacteriana e facilitar ainda mais a contagem.
    2. Adicione o fermento usando 10 &# 181; l laço inoculação em caldo preparado YPD-suplementado com amicacina O / N a 37 ° C.
    3. Levedura colheita por centrifugação a 2000 xg durante 5 min.
    4. Remover o sobrenadante em uma eliminação de resíduos bioharzard apropriado. Branco aderente sedimento deve ser observado na parte inferior do tubo de cultura.
    5. Lave e suspender as bactérias peletizadas usando 5 ml de PBS e breve vórtice.
    6. Repita os passos 2.2.2 a 2.2.3 uma segunda vez para efectuar uma segunda lavagem.
    7. Ressuspender o sedimento utilizando 1 mL de PBS e breve vórtice.
    8. Determinar o tamanho do inoculo pela contagem num hematocytometer Mallassez usando um microscópio padrão em ampliação de 40x.
      NOTA: A concentração (em UFC / ml) é obtido usando a seguinte fórmula: (número de levedura 5 x 10) / (número de rectângulos de grelha contados no hematocytometer Mallassez).
    9. Verifique por diluição em série logarítmica a 10 -5 e -6 10 para confirmar que a solução contém 2 x 10 6 CFU / mL.
    10. Placa em placas de YPD-agar suplementado com 0,015% de amicacina.

3. Airways Colonização por C. albicans

NOTA: Depois de adaptação ambiental, os ratos são pesados ​​duas vezes por dia.

  1. Sob um exaustor, para depósito de 500 mL de sevoflurano em um 4 cm x 4 cm de gaze (técnica-drop aberto) 14.
    1. Colocar imediatamente a gaze sobre o chão de uma câmara de aproximadamente 750 ml de indução. Imediatamente coloque uma plataforma elevada de malha acima da gaze para evitar o contato direto entre o animal ea gaze.
    2. Feche tampa hermética e esperar 1-2 min para permitir a difusão do sevoflurano na câmara.
    3. Transferir o mouse de gaiola em malha plataforma e feche a tampa. Anestesia leve com respiração espontânea conservado deve ser alcançado em 30 a 45 seg.
    4. Monitor para hipotonia, observando a perda do reflexo de endireitamento altura em que o rato pode ser removido from da caixa e incutiu.
  2. Instilação intranasal (pode ser realizada em 10 segundos por um operador treinado).
    1. Segure o mouse com uma mão situado em sua parte traseira em posição vertical (Figura 4B).
    2. Usando o dedo indicador, o apoio de cabeça e usar o polegar para manter a mandíbula fechada para evitar a expectoração (Figura 4C).
    3. Conforme descrito no passo 2.3.8, garantir que o preparado C. albicans solução contém 2 x10 6 CFU por ml durante 50 ul incutidos volume.
      NOTA: O segundo ponto crítico é o volume instilado. Um volume menor do que 50 ul poderia resultar em uma colonização insuficiente ou instilação não homogêneo de vias aéreas, um volume maior pode induzir afogamento / asfixia e morte.
    4. Incutir o mouse intra-nasal, abordando a pipeta para as narinas.
    5. Pipetar uma gota de 50 ul a formação de uma bolha contendo a solução sobre as narinas, posteriormente inalada pelo spontaneously do mouse respiração.
    6. Coloque o rato em uma área de recuperação (por exemplo, uma gaiola grande nu bem arejada com uma lâmpada de aquecimento em cima). Os ratos devem ser monitorizados até despertar completo. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal e reflexo de endireitamento. Neste ponto, o rato pode ser retornado para uma gaiola de habitação normal.

4. P. aeruginosa induzida por infecção pulmonar aguda

NOTA: Os ratos são pesados ​​durante os quatro dias seguintes. Normalmente, os ratos ganhar peso durante C. colonização das vias aéreas mediada albicans (Figura 2A).

  1. Preparar a suspensão contendo P. aeruginosa o dia da instilação depois de O crescimento / N (ponto 2.2).
  2. Anestesiar brevemente utilizando inalado sevoflurano como descrito acima (seção 3.1).
    NOTA: Para executar infecção pulmonar aguda, recomenda carga bacteriana são sugeridas emTabela 1.
  3. Incutir o rato como descrito acima (seção 3.2), com especial atenção à recuperação pós-instilação.

5. Meça do Índice de Lesão Pulmonar

  1. Prepara-se uma solução contendo albumina marcado com FITC. Injectar a solução 2 h antes de eutanásia animal.
    1. Pesar 0,2 mg de albumina-FITC com o equipamento apropriado.
    2. Adicionar 0,2 mg em 1 ml de PBS. Vortex brevemente. Se não for utilizado imediatamente, colocar a solução em papel alumínio para evitar a exposição à luz ambiente.
    3. Injectar intraperitonealmente 200 ul de solução de albumina marcada com FITC a cada rato.
  2. Eutanásia
    1. Pesa-se a ratinhos para o último os dados de peso.
    2. Euthanize um único rato de acordo com o uso local de animais em orientações do comitê de investigação que usam uma injeção intra-peritoneal de uma overdose letal de pentobarbital: 300 � de 5,47% pentobarbital.
    3. Remover rato da gaiola e recebe linjeção Ethal pelo operador.
    4. Após a injecção, transferir o mouse sozinho para outra gaiola, escondido de todos os outros animais. Observe o mouse até ausência de movimento. Confirmar a morte é por falta de movimento, movimento particularmente respiratória, falta de pulso.
    5. Realizar a coleta cirúrgica de amostras em animais mortos, portanto, sem anestesia nem analgésicos.
  3. Coleta de amostra cirúrgica: Estágio Torácica.
    NOTA: Para manter condições estéreis, toda a cirurgia é realizada utilizando equipamento estéril em um ambiente de nível de biossegurança 2.
    1. Aplicar etanol para a pele. Realize uma incisão na pele da linha média do esterno até meados abdômen com uma tesoura. De incise linha média ao longo da caixa torácica em ambos os lados. Dobra-se a pele de ambos os lados do tórax para visualizar a caixa torácica.
    2. Realizar uma incisão vertical da caixa torácica em ambos os lados subindo em direcção ao clavícula, a fim de ser capaz de reclinar a parede torácica anterior com toda a popaUM permitindo a visualização perfeita do coração e pulmões (Figura 5A, 5B).
    3. Recolha de sangue com uma seringa pré-heparined através de punção do coração próxima à artéria interventricular. Retirar um mínimo de 500 ul para se obter, pelo menos, 100 uL de plasma. Coloque a amostra de sangue no gelo.
    4. Realize uma incisão cervical na linha média para visualizar a traquéia (Figura 5B e 5C). Dissecar cuidadosamente a fáscia em torno da traquéia. Coloque um sutura atrás da traqueia (Figura 5C e 5D). Posteriormente, a sutura será fechada em torno da agulha canulação para assegurar a lavagem adequada.
    5. Cateterize a traqueia usando a 20-G modificado agulha de gavagem (Figura 5D e 4A). Dê um nó cirúrgico em torno da traqueia canulada com a sutura previamente colocado.
    6. Para executar lavagens broncoalveolares (LBA), suavemente e progressivamente injectar e extrair 500 ul de PBS gelado no / do pulmão. Colocar a amostra no ice para evitar a lise celular.
    7. Repetir o passo 5.3.6, 3 vezes para se obter um total de 1500 ul de fluido BAL e piscina amostras de lavagem para um tubo de centrífuga de 2 ml (Figura 5E).
    8. Remova os pulmões do peito. Coloque um segmento do pulmão (o tamanho que correspondem à metade de um pulmão ou um lóbulo) em 1,5 ml tubo de centrífuga e armazenar rapidamente a - 80 ° C.
    9. Coloque um segmento de pulmão em um tubo de hemólise pré-pesado contendo PBS para determinar a carga bacteriana e colocá-lo em gelo.
  4. Coleta de amostra cirúrgica: Estágio abdominal.
    1. Execute outra incisão no lado esquerdo do abdômen. Observe o baço através do peritônio.
    2. Remover o baço e coloque em um segundo tubo de hemólise contendo 1 ml PBS e colocar no gelo.
  5. Lung índice de lesão
    NOTA: a permeabilidade da membrana alvéolo-capilar é avaliada por medição marcado com FITC-albumina vazamento do compartimento vascular para o alvéolo-interstcompartimento itial.
    1. Centrifugar amostra de sangue e fluido BAL durante 10 min a 1.500 x g. Recolher os sobrenadantes para novos tubos de centrífuga. As pelotas de células de plasma correspondem a ou BAL recrutados e deve ser colocado sobre gelo.
    2. Adiciona-se 100 ul de cada sobrenadante de sangue (plasma, amarelo) ou BAL sobrenadante para uma placa de 96 poços transparentes (300 ul poços). Coloque uma folha sobre a placa se não for usado imediatamente.
    3. Medir os níveis de fluorescência do plasma e em sobrenadantes de BAL utilizando um leitor de microplacas de fluorescência (excitação, 487 nm; emissão, 520 nm).
    4. Determinação do índice de lesão pulmonar por meio do cálculo da taxa de fluorescência [(BAL sobrenadante / sangue sobrenadante) x 100].
  6. Lavagem (BAL) contagem de células broncoalveolares diferencial.
    NOTA: Use o agregado de células obtidas a partir de centrifugação do LBA no passo 5.5.1.
    1. Se necessário, use-tampão de lise de glóbulos vermelhos. Adicionar 500 ul de tampão de lise de células vermelhas no tubo de centrífuga contendo o cell pellet. Resumidamente vórtice e deixar 10 min em gelo. Adicionar 500 mL PBS para parar de lise de células vermelhas.
    2. Células colheita por centrifugação durante 10 min a 1.500 x g. Remover o sobrenadante e suspender o sedimento de células em 1 ml de PBS estéril. Enumerar as células em um hematocytometer Mallassez. Usando um hemocitômetro para contagem de células. Concentre-se as células em um slide com uma cytospin.
    3. Células mancha usando kit coloração permitindo a identificação e contagem de células (macrófagos, linfócitos, neutrófilos).
  7. Lung carga bacteriana e disseminação bacteriana
    NOTA: Para avaliar a carga bacteriana pulmão e disseminação de bactérias, pulmões e baço foram, respectivamente, recolhidos e armazenados em tubos de hemólise pré-pesadas contendo 1 ml de PBS (passo 5.3.9).
    1. Pesar tubos de hemólise contendo 1 ml PBS e ou pulmonares ou do baço. Homogeneizar as amostras com um homogeneizador de tecidos para se obter tecidos de pulmão homogeneizados de baço e homogeneizados.
    2. Deposite 100 l de homo tecidogenates em tubos de centrífuga contendo 900 ul de PBS estéril para obter diluições logarítmicas em série.
    3. Placa das duas últimas amostras diluídas adequadas (10 -3 e 10 -2) em ambos BCP-agar para P. aeruginosa ou agar YPD-amicacina suplementado para C. albicans pulmão e baço determinação carga.
    4. Incubar as placas de O / N a 37 ° C. No dia seguinte, enumerar as colónias em placas.
    5. Índice o resultado ao peso do pulmão para obter uma CFU por grama de pulmão. O tamanho das amostras de pulmão não são os mesmos, os resultados são expressos em CFU por grama de pulmão.
      Fórmula para o índice é: [UFC] x [peso do tubo de hemólise e de pulmão] - [peso do tubo de hemólise].

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Representative Results

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Como visto anteriormente durante a descrição do protocolo, o experimento precisa de cinco dias para ser concluído (Figura 1: Experiência linha do tempo). Um operador é solicitado durante toda a execução do experimento e pode lidar com os processos até um máximo de 10 ratos. Se forem necessários mais animais, duas pessoas são necessários particularmente para coleta de amostras cirúrgico. Na verdade todas as amostras devem ser recolhidos em menos de 2 horas para evitar um aumento da fuga de alvéolo-capilar passiva de albumina marcado com FITC nos últimos camundongos.

O primeiro passo é a preparação de C. inóculo albicans e instilação intra-nasal para obter a colonização das vias aéreas por C. albicans. Um modelo de 4-dias persistência é obtida por instilação intranasal de 5 x 10 5 CFU de C. albicans por ratinho (Figura 2B). Durante estes 4 dias, os ratinhos ganho de peso (Figura 2A) e a instilação de 5x10 5 CFU não induz lung lesão (Figura 2C). Embora C. albicans pode persistir até 4 dias neste modelo, a carga diminui após 48 horas. Portanto, P. infecção pulmonar aguda induzida por aeruginosa é efectuada em 48 horas de C. persistência albicans.

P. aeruginosa PAO1 estirpe é uma cepa de laboratório em grande parte caracterizada compreendendo o principal fator de virulência, o tipo de sistema de três secreção (T3SS), como em 75% dos isolados clínicos de pulmão 15. Por razões teses, PAO1 é uma estirpe relevante em modelos animais de infecção pulmonar aguda. A lesão pulmonar é avaliada através alvéolo-capilar permeabilidade medida pelo vazamento de proteína a partir do compartimento vascular para a via aérea expresso como o índice de lesão pulmonar. Lesão Pulmonar aumenta com o inoculo (Figura 3A). Aqui nós relatamos cinética da componente lesão pulmonar aguda do nosso modelo induzida pela estirpe PAO1 (5x10 6 UFC / mouse) (Figura 3B-3F) sozinho, sem préviaC. albicans- escorva mediada. Dependendo da estirpe e tempo de percurso do modelo, a escolha de P. inicial aeruginosa inoculo é discutido na secção seguinte e é sugerido na Tabela 1.

Utilizaram-se cinco ratinhos por grupo. Índice de lesão pulmonar (Figura 3B), a carga bacteriana no pulmão (Figura 3C), a carga bacteriana no baço, reflectindo difusão bacteriana (Figura 3D), celularidade no LBA (Figura 3E) e contagem de células diferencial (Figura 3F) foram determinados a cada 12 h. A lesão pulmonar foi máxima entre 24 h e 36 h após a infecção (Figura 3B). Mostrou uma carga bacteriana 1-log UFC / mL diminuir a cada 24 h (Figura 3C). Disseminação bacteriana acumulada avaliada por culturas homogeneizado baço aumentado a cada dia (Figura 3D). Finalmente, embora a celularidade do LBA em ratinhos não infectados é principalmente composta (90%) Omacrófagos alveolares de f, no LBA de ratinhos infectados, os neutrófilos foram amplamente recrutados e contagem de células diferencial mostrou 90% de neutrófilos e 10% de macrófagos e linfócitos (Figura 3E, 3F).

figura 1
Figura 1. Timeline da Lesão Pulmonar Aguda Modelo de Interação mediada Explorar-Host entre C. albicans e P. aeruginosa.
Representação gráfica de todo o procedimento. O primeiro passo é a adaptação do ambiente de ratos As instalações de alojamento. O segundo passo é C. albicans mediada colonização das vias respiratórias. Finalmente, o terceiro passo é a infecção pulmonar aguda mediada por P. aeruginosa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 2. C. albicans vias aéreas Colonização.
(A, B) Os ratinhos são instilado intranasalmente com 10 CFU 5 C. albicans (SC5314 tensão). Mice ganhar peso durante C. colonização das vias aéreas albicans mediada por (A). Colonização das vias aéreas pode ser prolongada para 3-4 dias com uma única instilação inicial. Em um estudo anterior, priming da imunidade inata ocorre entre 24 e 48 horas. (n = 5 por grupo), as barras de erro representam a média ± SD. (C, D) os ratos são instilados por via intranasal de 5 x 10 5 ou 5 x 10 6 CFU de C. albicans. Índice de lesão pulmonar (C) avaliados por alveolar permeabilidade da barreira capilar às 24 h. O ganho de peso (D) expressa como percentagem do peso inicial (n = 5 por grupo).As barras de erro representam médias ± SD. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Modelo de lesão pulmonar aguda induzida por P aeruginosa.
(A) C57BL / 6J são intra-nasalmente infectados com cargas crescentes de P. aeruginosa (a partir de 1 x 10 6 a 5 x 10 7 CFU por ratinho) (n = 5 por grupo), as barras de erro representam a média ± SD. Os ratinhos são sacrificados às 24 h. Lung índice de lesão é avaliada pela permeabilidade da barreira alvéolo-capilar que aumenta proporcionalmente com a carga bacteriana. Comparação do índice de lesão pulmonar obtido utilizando o método antigo com pulmão homogeneizados de sobrenadantes (barras pretas) e novo método combinado utilizando sobrenadantes de lavagem broncoalveolar (barra cinzas) (BF) ratos são intra-nasal infectada com 5 x10 6 UFC por mouse. Os ratos são sacrificados a cada 12 a 48 horas para cinética agudas modelo lesão. A lesão pulmonar (B), pulmão carga bacteriana (C), baço carga bacteriana (D), a lavagem broncoalveolar (LBA) celularidade (E) e contagem de células diferencial BAL (F) também são avaliadas. (n = 5) por grupo, barras de erro representam médias ± DP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Equipamento Cirúrgico e instilação intranasal.
(A)   Equipamento cirúrgico necessário para executar modelo de lesão aguda e lavado bronco-alveolar. Aqui cânula traqueal (20G) e as duas seringas de 1 ml estão ligados a uma válvula de 3-vias Luer-lock. Uma seringa para injectar água para os pulmões, um para extrair o fluido de volta para fora broncoalveolar dos pulmões. (B, C)   Posição do mouse na mão para executar a instilação intra-nasal. Nesta foto, o polegar sob a mandíbula garante uma boca fechada durante a instilação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Cirurgia e lavado bronco-alveolar.
O peito é amplamente aberto (A), e caixa torácica é aberta lateralmente para evitar danos ao coração (B). Após a recolha de sangue, a área do colo do útero é dissecada para expor a traqueia (C). O fio dental é usado como umsutura é passado para trás e traqueia (C, D). A traqueia é canulada, em seguida, com a cânula de 20-G combinada (D), montada na seringa e a válvula de 3 vias. A traquéia deve ser bem preso ao redor da cânula por amarrar um nó cirúrgico utilizando a sutura no lugar por trás da traquéia. Finalmente 500 uL de PBS são suavemente instilado nos pulmões e, em seguida, a BAL é desenhado gentilmente para fora. (E) pulmões incutiu-Fluid. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Burden incutiu Minimal Maximal incutiu Burden
T3SS- 5 x 10 7 1 x 10 8
T3SS + 5 x 10 6 1 x 10 7
T3SS + exoU + 5 x 10 1 x 10 5

Tabela 1. P. aeruginosa inóculos Usado em Infecção pulmonar aguda Models.
Intranasais concentrações ideais sugeridos de inóculos para induzir lesão pulmonar aguda segundo as estirpes.

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Discussion

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Modelos animais, particularmente mamíferos, são úteis para elucidar os mecanismos complexos de interacção hospedeiro-patogénio nas áreas de imunidade. Claro, a necessidade de informações obtidas somente a partir de modelos animais deve ser essenciais; caso contrário, a utilização de animais devem ser substituídos por modelos in vitro. Este modelo animal ilustra a percepção de que só pode ser fornecida por um modelo animal uma vez que a interacção entre agentes patogénicos é mediada por uma resposta do hospedeiro multi-componente. Camundongos atualmente utilizados para estudar essa interação patógeno-hospedeiro são jovens adultos com idades entre 6 a 10 semanas com uma resposta imune maduro e inalterados. Quando a focagem sobre a resposta imune inata, são preferidos C57BL6 / J fundo ratinhos. Para evitar um efeito de sexo e ciclo hormonal (particularmente estrogénio) sobre a resposta imunológica, os machos são, por conseguinte, a melhor escolha. Para alcançar significância estatística, os grupos devem ter pelo menos 5 indivíduos no final da experiência, mas, tal como sugerido por todos os animais experimenorientações tação, o número de animais utilizados devem ser reduzidos e refinado a um mínimo estrito.

Transporte do criador fornecer os animais para o centro de pesquisa induz estresse em ratos. A conseqüência é um aumento da secreção de citocinas inflamatórias que podem alterar experimentos subsequentes como a nossa. Além disso, um novo ambiente e novos "companheiros de gaiola" contribuir para o estresse. Consequentemente, os ratos devem ser aclimatados durante pelo menos sete dias antes de estudar em seu novo ambiente de habitação. Este ambiente de alojamento tem de ser controlada, fornecendo alimentos padrão e água ad-lib, um ciclo de dia / noite, e umidade estável apropriado e temperatura.

Ambos colonização pulmonar e os modelos de infecção pulmonar requerem prática e destreza. A instilação pode ser realizado intra-nasal ou intra-traqueal. Este último é mais difícil e requer uma maior especialização por meio de treinamento devido a um alto risco de parada cardíaca anóxica. Com efeito, o procedure requer para entubar com sucesso um rato em menos de 15 segundos e anestesia mais profundos, portanto, necessários. A nossa escolha de instilação intra-nasal é mais fácil de realizar uma vez que a via de administração é acessível, menos arriscada requerendo anestesia leve e, portanto, é mais reprodutível.

Boutoille et al já descrito o nosso modelo de lesão pulmonar aguda, em especial a avaliação de lesão pulmonar através da medição da permeabilidade barreira alvéolo-capilar utilizando albumina marcado com FITC 16. Para reduzir o número de murganhos por experiência, este método foi adaptado e acoplado com lavagem broncoalveolar (BAL). Nos estudos de Boutoille et ai, utilizou-se a comparação entre a fluorescência da albumina-FITC etiquetado nos sobrenadantes de homogeneizado de pulmão e os sobrenadantes de sangue 17.

Para realizar plenamente esta comparação, os níveis de hemoglobina e hematócrito também são necessários. Este método foi adaptado para allow a análise concomitante de resposta do hospedeiro, dedicando um pulmão para homogeneização e avaliação da lesão pulmonar eo outro para lavagem e estudo da resposta do hospedeiro. Com efeito, o fluido BAL pode ser usado para avaliar os níveis de citocina, a secreção de proteínas e recrutamento de células. A nossa adaptação fornece mais resultados de uma única experiência com animais, reduzindo o custo e o número necessário de ratos, especialmente quando se utiliza ratinhos knock-out 17 como recomendado nas orientações experimentação animal. Além disso, uma parte do pulmão é mantida a -80 ° C para realizar a extracção de ARN total e de reacção em cadeia da polimerase quantitativa ou análise histológica. A comparação entre o método anterior e o novo método adaptado acoplado com LBA mostra resultados comparáveis ​​(Figura 3A) para avaliar o índice de lesão pulmonar.

No estudo de Mear et ai, utilizando os mesmos procedimentos, citómetro de fluxo de análise foi realizada sobre as células de BAL obtidas por centrifugação do fluido de BAL. Um semelhantenalyses foram realizados em células pulmonares totais a partir dos pulmões de 12. Neste caso, a avaliação da lesão pulmonar com albumina marcado com FITC não podem ser realizados concomitantemente, devido a artefactos induzidos por FITC (o mesmo canal do que a proteína de fluorescência verde). Portanto, se citometria de fluxo é necessária, os experimentos devem ser planejadas de acordo.

O momento da eutanásia é crítica. Um curso de tempo do modelo de infecção pulmonar aguda durante as primeiras 72 horas é apresentado Figura 3. Neste modelo, o auge da lesão pulmonar e resposta do hospedeiro ocorre entre 24 e 36 horas (Figura 3). Assim, em nosso projeto do ponto final de 24 horas foi escolhido como uma leitura por 3 motivos: em primeiro lugar, é fácil de organizar em laboratório, segundo, para evitar a perda de ratos devido à mortalidade entre 24 e 36 horas, e, finalmente, porque a resposta do hospedeiro foi máxima neste ponto de tempo.

O primeiro passo do nosso estudo de interacção representa a colonização das vias aéreas com <em> C. albicans. Usando uma instilação de 10 5 UFC por mouse, um modelo de persistência de 4 dias é obtido sem qualquer lesão pulmonar. Na verdade, os ratos ganharam peso durante o curso de tempo desta fase. O ganho de peso é um indicador útil da ausência de lesões em conformidade com a colonização em oposição à infecção. Com efeito, um aumento da carga inicial (ao longo de 10 6 CFU por ratinho) lesão pulmonar induzida (Figura 2C) e uma série de resposta prejudicial muito além de escorvamento, na qual os ratos perderam peso de casos (Figura 2D). Pelo contrário, usando uma carga menor inicial (por exemplo, 10 4 CFU por ratinho) de um modelo de persistência das vias aéreas não poderia ser obtida. Assim, para obter o escorvamento observada da imunidade do hospedeiro descrito por Mear et al 12, a calibração da carga fúngica instilado é crítica para o sucesso e o controlo da curva de controlo de peso é uma chave.

A mesma precisão é necessário para P. aeruginosa P. aeruginosa é rapidamente removido das vias respiratórias por uma resposta hospedeiro apropriado. Usando um excessivamente alta P. inicial aeruginosa ultrapassa as capacidades de defesa do hospedeiro ou até mesmo induz uma resposta inadequada e derleterious resultando em carga leva a lesão aguda maciça e morte de apagar todas as diferenças entre os grupos. O inoculo óptima para induzir lesão aguda depende da presença de um sistema do tipo 3 secreção funcional (T3SS) e a produção de exotoxina de L, uma toxina translocado pelo T3SS para o citoplasma da célula hospedeira. Estes dois atributos específicos de estirpe tem que ser considerado na escolha da carga bacteriana inicial. Encargos bacterianas iniciais são sugeridas neste artigo como exemplos de limites inferiores e superiores para induzir lesão pulmonar aguda com T3SS-negativos ou tensão positiva, e cepas produtoras de exotoxina U ou não (Tabela 1). Ao estudarenvolvimento de T3SS, estirpe tem de ser cultivadas S / N e para reaquecer com novo meio LB 3 h antes da preparação do inoculo para se obter uma actividade óptima de T3SS.

A determinação da carga bacteriana e fúngica de 24 horas após P. infecção pulmonar induzida por aeruginosa requer considerações específicas discutidas nesta seção. Com efeito, como se mostra, quando os ratinhos foram infectados com 5 x 10 6 CFU estirpe T3SS-positiva, a carga bacteriana nos pulmões ao 24 h vontade diminuída para cerca de 1 log (Figura 3C). Diluições em série das amostras deve ser realizada até à diluição 5-log e plaqueadas em placas de agar-BCP. No que se refere C. albicans nos pulmões, em 72 h, a carga fúngica é diminuída para cerca de 2 log e as amostras devem ser plaqueadas em YPD-agar suplementado com amicacina para facilitar a identificação de colónias. Finalmente, a determinação de difusão bacteriana pode ser avaliada através do plaqueamento de 100 ul de amostra de sangue em BCP-ágar ou por plaqueamento de 100 ul de baço homogenates no mesmo meio. Os dois métodos foram já foram comparados e cultura baço parece ser mais preciso. Na verdade, o baço é um órgão que "filtros" sangue total e pode "concentrar" e conservar bactérias ter disseminado para o sangue. Assim, os homogeneizados de baço refletem a disseminação bacteriana sistêmica durante a infecção pulmonar aguda com uma sensibilidade maior do que sangue. As amostras de sangue representam difusão bacteriana em um determinado momento muito específico e pode não reflectir verdadeiramente o fenómeno de difusão bacteriana como um todo. Portanto são preferidas culturas de baço homogeneizado.

Lung índice de lesão é uma avaliação sensível de lesão pulmonar resultante de infecção e / ou inadequada resposta do hospedeiro eo efeito de potenciais terapias sobre esses componentes. Além disso, este em viv o modelo permite a coleta de várias amostras diferentes para estudar a resposta do hospedeiro. Pulmonar pode ser utilizada para a extracção de ARN e a análisede transcrição do gene. Amostras de pulmão também pode ser colocado em paraformaldeído (PFA) a mais observações histológicas. LBA pode ser utilizado para a avaliação da secreção de proteína, tais como citocinas inflamatórias. Finalmente, como discutido acima o protocolo pode ser adaptado para proporcionar amostras para análise de citometria de fluxo.

Finalmente, este protocolo pode ser adaptado para modelizar C. interação micróbios albicans- envolvidos em pneumonia associada à ventilação mecânica, como Staphylococcus aureus 18 ou enterobactérias. Uma outra adaptação pode ser colonização das vias respiratórias por meio de bactérias, em vez de C. albicans de modelizar bacteriana interacção na doença pulmonar crónica supurativa como bronquiectasia. Para este fim, os ratinhos imunocomprometidos têm de ser utilizados, porque a eliminação bacteriana em ratinhos imunocompetentes não permite uma colonização persistente das vias respiratórias.

Para a instilação, a posição da mão segurando o animal é critica. Como já salientado na seção anterior, quando intra-nasal incutir o mouse, o operador deve assegurar que a boca está perfeitamente fechada para evitar a expectoração da solução. O polegar suporta a maxila e mantém a boca fechada durante todo o processo de instilação (Figura 4B). Em seguida, com a outra mão, a pipeta é depositado sobre uma narina (Figura 4C) e solução progressivamente instilada suavemente e sem ar, para evitar a formação de bolhas. Obviamente, a instilação deve ser realizada em um nível armário 2-biosegurança.

Recolha de amostras requer pequenos animais treinamento cirúrgico Certifed do operador. Em cada passo, as amostras devem ser colocadas em gelo para evitar a lise das células e preservar proteínas de desnaturação. Instrumentos cirúrgicos necessários são básicos (Figura 4A). Eles devem ser esterilizados em autoclave antes da utilização. Recomenda-se que os diferentes conjuntos de instrumentos cirúrgicos para ser usado abdominal e passos cirúrgicos torácicos, evitando a contaminação cruzada de amostras de pulmão. As diferentes etapas críticas de dissecção cirúrgica são apresentados (Figura 5A-5E). Posição do mouse é crítica; o animal deve ser imobilizado plana sobre ele está de volta cabeça oposto do operador e em linha reta. O etanol deve ser usado livremente para preparação antes da primeira incisão para evitar a propagação de cabelo nas amostras e potencial contaminação bacteriana da pele. A pele é bem vascularizado e deve ser recolhido cuidadosamente para evitar uma hemorragia (Figura 5A).

Em seguida, a caixa torácica é reclinado na sequência de uma incisão lateral do tórax, durante o qual a caixa torácica deve ser constantemente mantido sob o domínio pinça para evitar lesões no coração e pulmões durante a incisão. Pulmão e coração estão expostos (Figura 5B). Pulmão não infectados aparecem esbranquiçada (Figura 5B). Dissecção da região cervical expõe a traqueia e uma sutura é carroefully colocado atrás da traqueia superior (Figura 5C). Canulação da traquéia deve ser realizada com cautela. Não utilizar uma cânula de grandes dimensões (tamanho máximo é de 20 G). Uma pequena incisão anterior da traqueia membranosa entre dois anéis cartilagíneos permite a inserção da cânula. Quando a cânula é observado por transparência através da traqueia acima da carina (Figura 5D), o fio de sutura está firmemente amarrada em torno da traqueia prendendo-o em torno da cânula (Figura 5E). A cânula é ligada a uma válvula de bloqueio Luer macho de 3 vias com 2 seringas ligados às portas do sexo feminino. Uma seringa contém PBS gelado para lavagem broncoalveolar; o outro é vazia para chamar de volta o LBA. Estas seringas devem ser chaged entre grupos.

Em conclusão, priming antes do modelo de lesão pulmonar aguda é um modelo relevante e poderosa para explorar nas interações mediados pelo hospedeiro vivo entre patógenos. A utilização de animais é alimitação principal e devem ser cuidadosamente ponderados em relação a informações obtidas in vitro.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevorane, Sevoflurane Abott 05458-02 250 ml plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940 Berthold Technologies reference in first column no comment
Bromo-cresol purple agar Biomerieux 43021 20x per unit
Pentobarbital sodique 5.47% CEVA 6742145 100 ml plastic bottle
2-headed valve  Distrimed 92831 no comment
Sterile inoculation loop 10 µl Dutscher 10175 x1,000 conditioning
Insuline syringes 1 ml Dutscher 30003 per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 ml Dutscher 64300 no comment
Ultrospec 10  General Electric life sciences 80-2116-30 no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm  Gosselin W1773X per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline Life technologies 10010023 packaged in 500 ml
amikacin 1 g Mylan 62516778 per 10 
Heparin 10,000 UI in 2 ml Pan pharma 9128701 10x per unit
RAL 555 coloration kit RAL Diagnostics 361550 3 flacons of 100 mL
1.5 ml microcentrifuge tube Sarstedt 55.526.006 x 1000
Transparent 300 µl 96-well plate Sarstedt 82 1581500 no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth Sigma 95763 in powder
FITC-albumin Sigma A9771 in powder
Luria Bertani Broth Sigma L3022 in powder
25-gauge needle Terumo or unisharp A231 x 100 conditioning
Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 no comment

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Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways
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Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).More

Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).

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