We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.
Viele Mikroorganismen sind in der Lage zu erzeugen und zu sekretieren Exopolysaccharide (EPS), die wichtige Auswirkungen in medizinischen Bereichen, Lebensmittelanwendungen oder in den Ersatz von petro basierten Chemikalien haben. Wir beschreiben ein analytisches Plattform auf einem Flüssigkeitshandhabungssystem automatisiert werden, die eine schnelle und zuverlässige Analyse des Typs und der Menge an EPS von Mikroorganismen hergestellt werden können. Es ermöglicht dem Benutzer, neue natürliche mikrobielle Exopolysaccharid Hersteller zu identifizieren und die Kohlenhydrat Fingerabdrucks der entsprechenden Polymere innerhalb eines Tages in Hochdurchsatz (HT) zu analysieren. Mit Hilfe dieser Plattform, Stammsammlungen sowie Bibliotheken von Stammvarianten, die in technischen Ansätzen gewonnen werden könnten kann gescreent werden. Die Plattform hat einen modularen Aufbau, der eine Trennung des Protokolls in zwei Hauptteile ermöglicht. Erstens gibt es ein automatisiertes Screening-System, das verschiedene Polysaccharid Detektionsmodule kombiniert: a semi-quantitative Analyse von viscosity Bildung über einen Zentrifugationsschritt, einer Analyse der Polymerbildung durch Alkoholfällung und die Bestimmung des Gesamtkohlenhydratgehalts über eine Phenol-Schwefelsäure-Transformation. Hier ist es möglich, bis zu 384 Stämme pro Lauf zu screenen. Der zweite Teil enthält eine detaillierte Monosaccharid-Analyse für alle ausgewählten EPS Produzenten im ersten Teil die von zwei wesentlichen Module kombinieren: die Analyse der gesamten Monomerzusammensetzung über ultra Hochleistungs-Flüssigchromatographie gekoppelt mit UV-und Elektrospray-Ionisations-Ionenfalle Erkennung ( UHPLC-UV-ESI-MS) und die Bestimmung von Pyruvat als Polymer Substituent (Vorhandensein von Pyruvat-Ketal) durch enzymatische Oxidation, die zu einer Farbbildung gekoppelt ist. Alle analytischen Module dieser Screening-Plattform kann auf unterschiedliche Weise und angepasst auf die individuellen Anforderungen kombiniert werden. Zusätzlich können sie alle mit einer Flüssigkeitshandhabungssystem oder manuell durchgeführt gehandhabt werden. Dadurch wird das Screening plaTForm ermöglicht eine enorme Flexibilität, um verschiedene EPS zu identifizieren.
Mikrobielle Exopolysaccharide (EPS) sind eine strukturell sehr heterogene Gruppe von Polymeren, die verschiedene biologische Funktionen erfüllen. Sie sind meist aus komplexen Wiederholungseinheiten aufgebaut, die von verschiedenen Arten von Monomeren (Zucker, Zuckerderivate, Zuckersäuren) auszeichnen, die Bindungen zwischen den Monomeren und deren Substitutionen. Die strukturelle Vielfalt von mikrobiellen Polysacchariden verleiht eher unterschiedlichen Eigenschaften an die Mitglieder dieses Moleküls Klasse, die in verschiedenen Bereichen wie Lebensmittel 1, Kosmetika 2,3 ihre Anwendung ermöglicht es , bauchemische 4 oder Wasseraufbereitung 5. Zur Erweiterung auf dem Gebiet der Anwendung dieser biobasierten und so eine nachhaltige Polymere die Identifizierung von neuen natürlichen mikrobiellen Polysacchariden sowie das Engineering von Strukturvarianten vielversprechende Ansätze darstellt. So oder so, ein schnelles Screening-Verfahren ist erforderlich, schnell eine große Anzahl von Mikrobenstämme für thei scannenr Polysaccharid-Bildung und ihre Produkte zu analysieren. Daher haben wir kürzlich eine 96-Well – HT-Screening – Plattform für die Analyse von mikrobiellen Polysaccharid – Produktion aus natürlichen Isolaten oder künstlich Stammvarianten entwickelt, die die Identifizierung der monomeren Zusammensetzung umfasst 6.
Die Anwendung dieser Plattform für einen ersten Screeningrunde von ~ 500 natürlichen Isolaten konnten wir nur etwa 10 bis 20% der isolierten Stämme zu identifizieren, in der Lage, EPS zu produzieren (Daten nicht gezeigt). Dies bedeutet, dass 80-90% der analysierten Stämme produzieren nicht EPS unter den Bedingungen angewendet wird, und daher wird eine weitere Analyse des Fingerabdrucks detaillierten Kohlenhydrat war nicht erforderlich. Da diese hochentwickelte Identifizierung der monomeren Zusammensetzung ist ein zeitaufwendiges Verfahren, insbesondere für die Datenanalyse, eine schnelle Vor-Screening-Verfahren mit den Stämmen positiv in EPS Produktion zu identifizieren, würde die Effizienz drastisch erhöhen. Weiterhin Reagenzien,Verbrauchsmaterialien und Messzeit an der UHPLC-UV-ESI-MS würde reduziert werden. Darüber hinaus werden die verschiedenen Analysemodule, während einerseits die Methode sehr zuverlässig machen, sind auf der anderen Seite die manuelle Handhabung von mehr als zwei 96-Well-Platten parallel zu komplizieren, und als solche, das volle Potenzial des Verfahrens beschränken. Aus diesen Gründen haben wir uns entschlossen, ein automatisiertes Screening-Plattform zu entwickeln. Daher kombinierten wir die modularen Format des vorhandenen Kohlenhydratfingerabdrucktechnik mit einem vollautomatischen Schnellnachweisverfahren der Gesamtzuckergehalt, bezogen auf die Absorptionsmessung.
Das Phenol-Schwefelsäure-Methode stellt immer noch das Mittel der Wahl für die schnelle Bestimmung des Gesamtkohlenhydratgehalt von bakteriellen und pflanzlichen Polysacchariden 7,8. Diese Methode wurde erstmals von Dubois et al. 9 und für verschiedene Anwendungen und Probengrößen angepasst, auch bei kleinen Maßstab in 96-Well – Platten 10,11. Die phenol-Schwefelsäureverfahren misst die Gesamtkohlenhydratgehalt um einen Wert, Summieren aller monomeren, oligomeren und polymeren Kohlehydraten der Proben.
Unter diesen Aspekten Rechnung zu tragen, ist die Wahl eines geeigneten Kultivierungsmedium wichtig, diese Methode anzuwenden. Komplexen Medien oligomeres oder polymeres Kohlenhydratverbindungen wie Hefeextrakt könnte zu einer veränderten Polymergehalt führen und daher unbedingt vermieden werden sollte. Weiterhin werden als C-Quelle für die Kultivierung der Stämme hohe Mengen an Zuckern verwendet. Hohe Konzentrationen von restlichen Kohlenhydrate aus dem Kultivierungsprozess könnte negativ mit der Messung des EPS-Gehalt stören.
Daher wird die Verwendung von definierten und reine Zucker empfohlen. In unseren Experimenten verwendeten wir Glukose zur Kultivierung der Zellen. Der verbleibende Glucose nach der Kultivierung wurde über eine Gelfiltration verringert und über einen Glucose-Assay bestimmt. Schließlich ist die Glucose äquivalents der Polysaccharide wurden durch Subtrahieren der verbleibenden Glucose nach der Gel-Filtration von der Gesamtkohlenhydratgehalt berechnet, die mit dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren nachgewiesen worden war. Gel-Filtration und Glucose-Assay in Kombination mit dem Phenol-Schwefelsäure-Methode zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten und imstande sind, das erste, vollständig automatisierte Erfassungssystem ist.
Zwei neue Analysemodule wurden in der automatisierten Screening-Plattform enthalten, die Menge von Informationen von dem EPS-Erkennungssystem zu erhöhen: die Fällung und die Beobachtung einer Erhöhung der Viskosität.
Viele verschiedene EPS – zB Succinoglycans, Xanthan und Kolon – Säure 12 – berichtet , mit einem nicht-Kohlenhydrat – Pyruvat – Ketal auf Zucker Positionen C4 und C6 modifiziert werden. Diese Pyruvat Ketale (wie Succinyl Halbester und Uronsäuren) tragen zur polyanionische Natur und daher auf die physische properties des Polymers durch über zweiwertige Kation Brücken 13 zusammenwirkt. Um diese speziellen Polymere die Bestimmung von Pyruvat zu identifizieren wurde als ein weiteres zusätzliches Analysemodul etabliert. Dadurch erhöht sich die Information über die Polysaccharid-Substituenten und ihre möglichen makroskopischen Eigenschaften.
sowie eine schnelle und effiziente Bestimmung der EPS-Hersteller alle Module Kombination ermöglicht die Identifizierung verschiedener EPS. Durch diesen Ansatz kann die Screening – Plattform in zwei Hauptteile (1) aufgeteilt werden. Im Rahmen der automatisierten Screening (Teil I) tritt der Workflow vollautomatisiert (Tabelle 1) , um schnell die EPS – produzierenden Stämme vorgewählt werden . Das Kohlenhydrat Fingerabdruckanalyse (Teil II) bestimmt quantitativ die Monomerzusammensetzung der durch den vorgewählten Stämme produzierten EPS. Dadurch wurde die Datenanalyse minimiert, um das Screening von großen Stammsammlungen zu optimieren. Diesbietet die Möglichkeit, 384 Stämme in einem einzigen automatisierten Screening-Lauf und mit zwei Läufen zu analysieren, die pro Tag von 768 Stämme pro Tag möglich sind. Darüber hinaus gibt der Kohlenhydrat-Fingerprint-Analyse einen noch detaillierteren Überblick über alle identifizierten EPS. Dies ermöglicht die gezielte Analyse und Identifizierung von nur leicht unterschiedlichen EPS-Varianten oder ganz neue im Vergleich zu den bereits beschriebenen chemischen Strukturen von EPS.
Polysaccharids Detektion mit dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren: Verschiedene Monosaccharide zeigen unterschiedliche Absorptionsmaxima und molare Extinktionskoeffizienten durch Anwendung dieser Methode 9. Daraus ergeben sich unterschiedliche Absorptionsmaxima von Polymeren, die in unterschiedlichen Mengen mehrerer Zucker enthalten. Die verschiedenen Wellenlängen der Absorptionsmaxima für 16 verschiedene handelsübliche Polymere sind in Tabelle 5 angegeben. Die Polymere gelöst (1 g / L) in ddH 2 O, gerührt (150 rpm) über Nacht und mit dem Phenol-Schwefelsäureverfahren gemessen . Diutan Gummi zeigte die niedrigsten Absorptionsmaxima bei 470 nm und Scleroglucan und Hyaluronsäure höchsten bei 484 nm. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde 480 nm für diese Screening-Plattform entschieden. Die relative Absorption der Polymere wurde auf der Basis der Absorption mit 1 g / l Glucose (eingestellt als 100%) erhalten wurde, berechnet. Die niedrigsten Ergebnisse wurden mit Scleroglucan und Succinoglycans erhalten, beide mit 92%. Dies war expektiert weil Scleroglucan nur Glucose enthält und Succinoglycan enthält Glucose und Galactose in einem Verhältnis von 7: 1. Beide kommerziellen Polymere unterschiedliche Verluste der Trocknung und unterschiedliche Aschegehalte haben, ist dies der Grund, warum der theoretische Wert von ~ 110% wurde nicht erreicht. Xylan zeigte die höchste relative Absorption bei 311%. Der Grund dafür liegt in der hohen molaren Extinktionskoeffizienten von Xylose erreicht aufgrund der dominanten Furanose Form. In einer Menge von 0,1 g / l Glucose wurde die Bestimmungsgrenze erreicht hat, sowie die Nachweisgrenze in einer Konzentration <0,05 g / L. Jedoch ist die Nachweisgrenze für positive Spannungen in dem Screening von mehr als 0,7 g / L, und daher der Assay zeigte eine gute Leistung. Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, die verbleibende Glucose nach Gelfiltration wurde mit einem Glucose-Assay bestimmt und dieser Wert wurde aus dem Wert aus der Phenol-Schwefelsäure-Verfahren abgezogen.
Automatisierte Glucose-Assay Verdünnung: Die Leistungder Glucosebestimmung nach der Kultivierung (Verdünnung 1: 100) untersucht. Hierzu wurden 10 ul Überstand wurden auf 990 & mgr; l ddH 2 O in einem tiefen Well – Platte überführt und über zehnmal gemischt Ansaugen und Abgeben von 180 & mgr; l aus dieser Verdünnung. Der zweite entscheidende Schritt war die richtige Pipettieren von nur 5 ul Aliquot für die Verdünnung von 1:10 aus der Glucose-Test nach Gel-Filtration. Um die Verdünnung 25 ul ddH 2 O übertragen wurden mit einer 50 & mgr; l-Spitze zu erzeugen , wurden zusammen abgesaugt zuerst, danach 20 ul ddH 2 O und 5 ul Gel-Filtrat. Dies gewährleistet eine bessere Entfernung der 5 ul-Aliquot aus der Spitze. Beide Verdünnungsschritte wurden mit verschiedenen Glukosestandards über einen Glucose-Assay überprüft. Die Ergebnisse für zwei beispielhafte Konzentrationen sind in Tabelle 6 gegeben , um die . 1: 100 – Verdünnung für die Bestimmung der Glucosegehalt nach der Kultivierung hoher Präzision für beide Standards mit einem CV & # zeigten60; 1,2%. Zur gleichen Zeit wird die Genauigkeit für die höheren Standard betrug bis zu 11,6 (% Fehler). Dies ist jedoch vernachlässigbar, da die Glukose-Bestimmung nur die verbleibenden Glucosegehalt nach der Kultivierung darstellt, und daher ist nicht wichtig für die Polymerdetektion. Die Verdünnung von 1:10 für die restliche Glucose nach Gel-Filtration zeigte eine sehr zuverlässige Ergebnisse mit einem CV <1,4% und einer Genauigkeit <2,1% Fehler.
Berücksichtigung der Verdampfung: Das Screening erfordert 3,5 Stunden aus dem ersten Schritt zu dem ersten glucose-Assays. Um zu erfahren, ob dieser Zeitrahmen einen Einfluss auf die nicht begrenzten MTP Lagerung hat, 50 ul Glucose-Test Kalibrierungsstandards wurden für 3,5 Stunden in der Roboter-Karussell mit und ohne Deckel gespeichert. Im Kalibrierungsbereich (45 bis 4,5 mg / l) die Probenkonzentration kaum erhöht. Eine Erhöhung – verursacht durch Verdunstung – lag unter 2,1% und nur für die beiden niedrigsten Konzentrationen (1,8 und 0,9 mg / l) erreichte bis zu 12,4% ( <strOng> Tabelle 7).
Gel-Filtration: Hohe Mengen an nicht-metabolisierten Glucose stören die quantitative Bestimmung von Glukose aus dem hydrolysierten Polymer. Daher wurde eine Gel-Filtrationsschritt erforderlich, um die verbleibende Glucose nach der Kultivierung zu entfernen. Zudem reinigt die Gelfiltration des Polymers aus Salzen und monomeren Kohlenhydratverbindungen, andere als Glucose enthaltenden Überstand, die analytische Hintergrund in der Monomer-Analyse zu minimieren. Bei dem Gel-Filtrationsschritt 35 & mgr; l des Filtrats wurden in der Mitte des Bohrloches angeordnet. Zur Validierung der Robustheit der Gel-Filtration in dem automatisierten System acht Kalibrierstandards von 0,045 bis zu 9 g / l Glucose wurden filtriert (n = 8). Die Glucose jeder Konzentration wurde stets um mehr als 95% des Ausgangswertes (Tabelle 8) reduziert. so zeigte das Gel-Filtration sehr gute Ergebnisse für verschiedene Konzentrationen von Glucose zu tun. Zusätzlich kann die verbleibende Glucose nach Gel-ffast filtration wurde auch mit einem Glukoseassay und subtrahiert von dem Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung zu empfangen, die richtige Menge an Glucose-Äquivalent für das hydrolysierte Polymer bestimmt.
Pyruvat-assay: Erstens, wurde untersucht, ob die neutralisiert und verdünnt (1:10) TFA-Matrix aus dem Hydrolyseschritt mit der enzymatischen Reaktion stört. Daher wurde die vollständige Test zweimal durchgeführt, einmal mit und einmal ohne Matrix und zeigte zuverlässige Ergebnisse. Schließlich wurde die Pyruvat – Gehalt von 16 im Handel erhältlichen Polymeren erfolgreich gemessen und ist in Figur 3 dargestellt ist . Es ist allgemein bekannt , dass nur aus diesen Polymeren 16 Succinoglycan und Xanthan natürlich Pyruvat enthalten. Mit unserem Pyruvat-Assay beide dieser Polymere wurden korrekt identifiziert. In Scleroglucan, Welangummi und Xylan Pyruvat wurde auch in signifikanten Mengen nachgewiesen. Insgesamt wurde die Fähigkeit des Ansatzes validiert und das Pyruvat-Assay showed eine hohe Leistung. Es erwies sich als in der Lage sein Pyruvat in verschiedenen Polymeren nach der Hydrolyse zu detektieren.
Carbohydrate Fingerabdruck: Nach Durchführung aller analytischen Module im automatisierten Screening, potenzielle EPS Produzenten wurden für den Kohlenhydratfingerabdruckanalyse ausgewählt. Hierzu wurden mehrere Kriterien gelten: 1) Positive Beobachtung der Viskositäts nach Zentrifugation und / oder nach der Filtration. 2) Niederschlag vor und nach der Filtration. Beobachtete Fasern und Flocken wurden als positiv bewertet. 3) Glucose-Äquivalentwert aus dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren. Werte> 700 mg / l wurden als positiv und Werte zwischen 300 und 700 mg / l wurden als mutmaßliche EPS Produzenten bewertet bewertet. Wenn zwei oder drei Kriterien als positiv bewertet wurden, wurden die Stämme zur weiteren Kohlenhydrat Fingerabdruckanalyse ausgewählt. Die Kriterien können an den individuellen Zweck der EPS – Screening (zB niedrige Viskosität EPS) angepasst werden. Unser Ansatz bei der Suche nach effici Zielent EPS Produzenten. Wenn für die Stämme zu suchen, die nur geringe Mengen an EPS die Bewertungsgrenze des Glucoseäquivalent produzieren sollte reduziert werden.
Technische Nutzen und zukünftige Anwendungen: Ein interessantes Merkmal dieses Protokolls ist der modulare Charakter der Schritte und die verschiedenen Analysemodulen. Sie können auf verschiedene Weise kombiniert werden, angepasst auf die individuellen Anforderungen und neue Module leicht implementiert werden kann. Darüber hinaus können die Analysemodule separat verwendet werden, beispielsweise die Hydrolyse – Modul in Verbindung mit dem HT-PMP-Derivatisierung Modul kann eine monomere Zusammensetzungsanalyse von verschiedenen Polymerlösungen (1 g / l) in 96-Well – Format durchzuführen. Für Laboratorien, ohne die vollständige Abschirmung manuell Zugriff auf ein Flüssigkeitshandhabungssystem, ohne Änderungen in dem Pipettierschema gehandhabt werden kann. Jedoch ein Flüssigkeitshandhabungssystem erhöht den Durchsatz bis zu 768 Stämmen (anstelle von 192 Stämmen wenn Screened manuell) pro Tag. Das Protokoll , das hier beschrieben wird , ist in der Lage ein Screening für verschiedene Gattungen und daher für das Screening von großen Stammsammlungen neuartige EPS Hersteller zu identifizieren und deren Kohlenhydrat – Fingerabdrucks analysiert in einem Ansatz (Abbildung 4). Weiterhin ist ein gezieltes Screening für Polysaccharide mit seltenen Zucker wie Fucose, können Uronsäuren oder sogar unbekannte Zucker über die detaillierte Monosaccharid-Analyse durchgeführt werden. Außerdem können verschiedene Zuckerkombinationen in definierten Verhältnissen nachgewiesen werden. Dies ermöglicht die einfache Identifizierung von strukturell verwandten Varianten bereits bekannter EPS oder neuartige EPS.
The authors have nothing to disclose.
We sincerely thank Thomas Howe and Jörg Carsten for the programming and technical support with the liquid handling systems.
96 well deep well plate 2.0 mL (DWP) | Greiner Bio-One | 780271 | Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990µl of ddH2O |
Breathable Sealing Film | Axygen | BF-400-S | Incubation film for pre- and main-culture DWP |
Aluminum Sealing Film | Axygen | PCR-AS-200 | -80 °C storage film for glycerol-stock plates |
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl | TECAN | 30038619 | Worktable position (WTP 2-1 to 2-4) |
A/B glass-filter-plate 1µm | Pall Corporation | PN 8031 | Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Greiner Bio-One | 651201 | Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well SpinColumn G-25 | Harvard Apparatus | 74-5612 | Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Nunc | 249944 | Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4) |
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips | TECAN | 30038609 | Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6) |
Trough 250 ml | Axygen | Res-SW96-HP | Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetat buffer pH 5.6 (CP 5-7) |
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP) | Greiner Bio-One | 655101 | precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2) |
96-well silicon cap mat | Whatmann | 7704-0105 | Cover mat for MTP |
200 µl pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | For manually handling |
1000 µl pipette tips | Sarstedt | 70.762 | For manually handling |
96-well-PCR micro titer plate | Brand | 781350 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat | Brand | 781405 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
Filter plate 0.2 µm Supor, | Pall Corporation | PN 8019 | Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate |
Pipette Tips LHS 5-300 µl | Brand | 732150 | Brand LHS system |
ABTS (2.2-azino‑bis-(3‑ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid) | Sigma-Aldrich | A1888 | Glucose-assay |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | Glucose-assay |
Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Glucose-assay, pyruvat-assay |
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt) | Wako Chemicals GmbH | 043-22351 | Pyruvat-assay |
Pyruvate oxidase | Sigma-Aldrich | P4591 | Pyruvat-assay |
Potassium phosphate dibasic | Carl-Roth | P749.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Potassium phosphate monobasic | Carl-Roth | 3904.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Pyruvat-assay |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 31413 | Pyruvat-assay |
2-Propanol | VWR | 20922.466 | Precipitation |
Phenol | VWR | 20599.231 | Phenol-sulfuric-acid method |
Sulfuric acid | Carl-Roth | 4623.4 | Phenol-sulfuric-acid method |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | Hydrolysis |
Ammonium solution | Carl-Roth | P093.1 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Phenol red | Alfa Aesar | B21710 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone | Sigma-Aldrich | M70800 | PMP-derivatization |
Methanol LC-MS | VWR | 83638.320 | PMP-derivatization |
Acetonitril LC-MS | VWR | 83040.320 | PMP-derivatization |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 338826 | PMP-derivatization, |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | PMP-derivatization |
Methyl red | Alfa Aesar | 36667 | pH-value |
Robotic liquid handling system | Tecan | Freedom EVO | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid handling station LHS | Brand | 709400 | Worktable setup in Figure 2 |
Tip-Adapter | Brand | 709434 | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid Ends MC 20-300µL | Brand | 709416 | Worktable setup in Figure 2 |
Adapter 60mm | Brand | 709430 | Worktable setup in Figure 2 |